PLoS ONE: Replication og Virus-induceret transkriptom af HAdV-5 i Normal Host Celler versus Cancer Cells – Forskelle i relevans for Adenoviral Oncolysis

Abstrakt

adenovirus (Ads), især HAdV-5, har været genetisk udstyret med tumor-begrænset replikation potentiale til at aktivere applikationer i onkolytisk cancerterapi. Sådanne onkolytiske adenovirus er veltolereret i kræftpatienter, men deres anti-tumor effekt skal styrkes. I denne forbindelse bør det overvejes, at kræftceller, afhængig af deres væv af oprindelse, kan afvige væsentligt fra de normale værtsceller hvortil Annoncer tilpasset af komplekse virus-vært interaktioner. Derfor viral replikation effektivitet, en afgørende faktor for oncolytisk aktivitet, kan være suboptimal i kræftceller. Derfor har vi analyseret både replikations- kinetik HAdV-5, og virus-induceret transkriptom i humane bronkiale epitelceller (HBEC) i sammenligning med cancerceller. Dette er den første rapport om genom-dækkende udtryk profilering af annoncer i deres oprindelige værtsceller. Vi fandt, at E1A udtryk og indtræden af ​​virale genom replikation er mest hurtige i HBEC og betydeligt forsinket i melanom celler. I pladecelle lungecarcinomceller, vi observerede mellemliggende HAdV-5 replikering kinetik. Infektiøs partikel produktion, viral spredning og lytiske aktivitet af HAdV-5 blev svækket i melanomceller versus HBEC. Ekspressionsprofil ved starten af ​​viral genom replikation afslørede, at HAdV-5 inducerede den stærkeste ændringer i den cellulære transkriptom i HBEC, efterfulgt af lungecancer og melanomceller. Vi identificerede fremtrædende regulering af gener involveret i cellecyklus og DNA metabolisme, replikation og pakning i HBEC, hvilket er i overensstemmelse med nødvendigheden af ​​at inducere S-fasen for viral replikation. Påfaldende, i melanomceller HAdV-5 udløste modstående regulering af generne, og i modsætning til lungecancerceller blev ingen svage S-fasen induktion detekteres ved brug af E2F-promotor som reporter. Vores resultater giver et rationale for at forbedre onkolytiske adenovirus enten ved tilpasning af virusinfektion at målrette tumorceller eller ved at modulere tumor cellefunktioner til bedre støtte virusreplikation

Henvisning:. Dorer DE, Holtrup F, Fellenberg K, Kaufmann JK Engelhardt S, Hoheisel JD, et al. (2011) Replication og virus-induceret Transkriptomet af HAdV-5 i Normal Host Celler versus Cancer Cells – Forskelle af relevans for Adenoviral onkolyse. PLoS ONE 6 (11): e27934. doi: 10,1371 /journal.pone.0027934

Redaktør: Maciej S. Lesniak, The University of Chicago, USA

Modtaget: Juni 28, 2011; Accepteret den 28. oktober 2011; Udgivet: November 30, 2011

Copyright: © 2011 Dorer et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Helmholtz Association of nationale forskningscentre (Helmholtz-University Group Grant), den Intramural Program for det tyske Cancer Research center (DKFZ, Deutsches Krebsforschungszentrum) og ved stipendier fra Helmholtz International Graduate School for Cancer Research til DED, FH, og JKK. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Adenovira (Ads) dukker kræftmedicin baseret på deres styrke til at inficere og lysere kræftceller, en proces kaldet viral onkolyse [1], [2]. Dette regime har en unik forstærkning virkning som inficerede tumorceller producerer afkom virus, der spredes smitte i tumoren. En yderligere fordel er, at virkningsmåden af ​​oncolytiske annoncer adskiller sig fra konventionelle behandlinger, som cancerceller ofte udvikle resistens. Begrænsning af virusreplikation til tumorceller er hovedsageligt nødvendig for anvendelsen af ​​annoncer i kræftbehandling. I denne henseende, den omfattende viden om Ad struktur, genom organisation og replikation cyklus kombineret med teknologier til Ad engineering letter en rationel udvikling af onkolytiske annoncer [2], [3]. Faktisk har oncolytiske vira med udestående tumorselektivitet blevet manipuleret baseret på det nært beslægtede HAdV-2 og HAdV-5. Dette blev opnået enten ved at mutere genfunktioner, der er suppleret i cancerceller, men ikke i normale celler, eller ved at målrette ekspressionen af ​​essentielle virale gener til tumorceller [1], [2], [4]. Adskillige kliniske forsøg har vist, at sådanne manipuleret Annoncer veltolereret i patienter, men at deres terapeutisk virkning skal forbedres [5], [6]. I den forbindelse mulighed for rationel engineering af annoncer er igen en vigtig fordel, da den fremmer udviklingen af ​​avancerede onkolytiske midler. Tilsvarende undersøgelser for at forbedre Ad indrejse i kræftceller eller til at indsætte terapeutiske gener i onkolytiske annoncer er blevet rapporteret [2], [7], [8].

Adenoviral onkolyse nødvendiggør en effektiv annonce replikation i målrettede cancerceller. Tidligere arbejde i marken har ikke i tilstrækkelig grad overvejet at kræftceller, afhængig af vævet af oprindelse, kan afvige væsentligt fra de normale Ad værtsceller. Således kan virusset ikke stødt på det cellulære miljø det er tilpasset ved omfattende virus-værts celle-interaktioner. Følgelig Ad replikation, kan cellelysis og spredning være suboptimal. Specifikt HAdV-2 og -5 er evolutionært tilpasset til at replikere i epitelceller i luftvejene [9], men er under udvikling til behandling af en lang række forskellige tumormål. Faktisk er rapporteret mutationer af HAdV-5 at øge virusreplikation og spredning i tumorceller [10] – [12]. Et eksempel er udeladelsen af ​​

E1B19K

, der har anti-apoptotisk aktivitet. Sletning af

E1B19K

har resulteret i stærkt forøget HAdV-5 replikation og onkolyse i lungekræft celler. Imidlertid har reduceret replikation er rapporteret i cancerceller afledt af andre væv, herunder melanomceller [11], [13] – [15]. Disse observationer igen peger på celletype afhængighed af Ad-værtscellelinier interaktioner og dermed Ad replikationseffektivitet: Forskelle i apoptose programmering mellem normale celler og cancerceller, men også mellem forskellige cancerceller sandsynligvis forårsage forskellige permissivity til

E1B19K

-deleted HAdV-5.

Som obligatoriske intracellulære parasitter annoncer er afhængige af cellulær energiproduktion og biosyntetiske maskineri. Faktisk har Ads implementeret forskelligartede og indviklede molekylære mekanismer til at etablere forhold i værtscellen, der sikrer en effektiv virus reproduktion. Disse er bedst undersøgt for HAdV-2 og -5 ([16], [17] og referencer deri). Tilsvarende produkter af tidlig viral genekspression – ud over at give proteiner nødvendige for replikation af det virale genom – manipulere den cellulære miljø til at understøtte virusreplikation ved flere mekanismer, især ved direkte og indirekte modulering af cellulær transskription ([17] – [19] og referencer deri). Den første virusgen udtrykt under Ad infektion er E1A, som koder en familie af proteiner fra alternativ splejsning. E1A-proteinerne inducerer ekspressionen af ​​yderligere tidlig Ad-gener og manipulere transkription af cellulære gener direkte eller indirekte [20], [21]. Den største E1A protein (13S) indeholder en potent transaktiveringsdomæne, som inducerer transkription når E1A interagerer med DNA-bindende proteiner. Både 13S og 12S E1A-proteinerne binder til pRb, hvilket resulterer i frigivelse af E2F transkriptionsfaktorer fra pRb-E2F-komplekser. E2F proteiner derefter aktivere transkription af virale og cellulære gener via E2F-bindingssteder ([17], [19], [22], [23] og referencer deri). E2F’ere bredt inducere cellulære gener involveret i S-fasen af ​​cellecyklussen, der også er nødvendige for Ad genomreplikation. Yderligere transskriptionelle aktiviteter af E1A-proteinerne medieres af interaktion med et panel af cellulære faktorer, som inhiberer eller aktiverer transskription, fx histonacetylaser ([17] og referencer deri). En anden Ad tidligt protein, E1B55K, indeholder en stærk transskription undertrykkelse domæne. Ved binding til p53 transaktiveringsdomænet det funktionelt skifter p53 fra transskriptionsaktivator- til en repressor [24]. Endvidere E1B55K sammen med E4ORF6 trigger nedbrydning af p53 [25]. Den resulterende afspærring af p53-responsive pro-apoptotiske gener modvirker induktion af apoptose udløst af unormal stimulering af cellecyklus ved E1A.

enestående viden om Ad-infektion er blevet opnået ved omfattende undersøgelser, der var for det meste udført med HAdV-2 eller -5 i HeLa og andre kræftceller og fokuseret på individuelle Ad gener [17]. Således Ad infektion i sin normale miljø i native værtsceller, fx primære epitelceller i luftvejene for HAdV-5, er kun sjældent blevet undersøgt (de fleste af disse undersøgelser analyserede selektivitet onkolytiske annoncer, se diskussionen). Bemærk, at HeLa-celler er forskellige fra de normale Ad værtsceller, da de er af livmoderhalskræft oprindelse og er blevet omfattende passeret. Desuden indeholder de humane papillomavirus-gener, som påvirker cellefunktioner vigtige for Ad-replikation. Undersøgelser, der undersøger, hvordan de enkelte annonce gener påvirker cellulære funktioner ikke anser det komplekse netværk af virus-vært interaktioner under virusinfektioner. I denne henseende mikroopstillingsteknologi er et effektivt redskab til genom-dækkende overvågning af omprogrammeret cellulær genekspression under Ad infektion. Faktisk har tidligere microarray undersøgelser viste, at HAdV-2 og -5 infektioner målrette multiple cellulære veje [26] – [30]. Disse undersøgelser er blevet udført med HeLa-celler og primære fibroblaster. Hvordan Ad infektioner modulere genom-dækkende genekspression af deres oprindelige værtsceller er ikke undersøgt til dato. Derfor er en sammenlignende analyse af Ad-induceret genekspression profiler af tumorceller versus native Ad værtsceller, som er af interesse for udvikling af onkolytiske Annoncer, er ikke tilgængelig til dato.

I denne undersøgelse derfor udforsket vi hvordan Ad infektion af kræftceller adskiller sig fra Ad-infektion af deres normale værtsceller. Til dette formål har vi udført en sammenlignende analyse af HAdV-5 replikering kinetik og lytisk aktivitet i primære bronkiale epitelceller, lunge pladecellecarcinom celler og melanomceller. Vi valgte dette sæt celler, som de repræsenterer normale HAdV-5 værtsceller, celler af tumorer afledt fra HAdV-5 værtsceller og tumorceller afledt fra et ubeslægtet celletype hhv. Vi efterfølgende udført hele genomet ekspression profilering af HAdV-5-infektion i normale bronchiale epitelceller og tumorceller. Celletypeafhængig forskelle i HAdV-5-inducerede cellulære transcriptomes blev bedømt ved bioinformatik analyse.

Resultater Salg

Lytisk potens og replikation effektivitet HAdV-5 i normale humane bronchiale epitelceller og cancer celler

Vi først vurderes, om effektiviteten af ​​HAdV-5 spread afhængig cellelyse og replikation er forskellige native HAdV-5 værtsceller og cancerceller. Primære humane bronchiale epithelceller (HBECs) blev anvendt i vores undersøgelse, da de repræsenterer de native HAdV-5 værtsceller i åndedrætsorganerne epitel mest nøje. De blev sammenlignet med lungecancerceller SK-MES-1, SW900 (både pladecellecarcinom) og A549 (adenocarcinom), til melanomceller SK-MEL-28 og Mel624, og til yderligere humane primære normale celler, nemlig fibroblaster og keratinocytter . I et cytotoksicitetsassay, observerede vi, at spread-afhængig cellelyse ved HAdV-5 var ligeledes effektiv i HBECs, SW900 og A549-celler, men svækkede i SK-MES-1-celler og endnu mere i de to melanoma cellelinier (fig. 1A ). Cytotoksicitet HAdV-5 for keratinocytter lignede HBECs, hvorimod ikke blev observeret nogen celle drab for primære fibroblaster på tidspunktet for målingen. Disse resultater viser klart, at lytisk styrke af HAdV-5 er celletype-afhængig og kan stærkt reduceret i cancerceller sammenlignet med HBECs. Af note, reduceret lytisk styrke af HAdV-5 i SK-MEL-28 og Mel624 celler kan ikke tilskrives ineffektiv viral cellebinding og posten, fordi disse celler viste kraftig ekspression af HAdV-5-receptor CAR (fig. S1) og var endnu mere modtagelige for transduktion af en replikationsdefekt HAdV-5 vector end HBECs, A549 og SW900-celler (tabel S1). Dette er et klart bevis, der reducerede lytisk aktivitet af HAdV-5 i melanom celler bestemmes ved en post-post trin af virusreplikation. I modsætning hertil manglede fibroblaster CAR ekspression og var vanskelige at transducere. Som celler blev farvet 8 dage efter infektion, hvilket giver mulighed for flere runder af virusreplikation, resultaterne af cytotoksicitetsassayet indikerer forskelle i effektiviteten af ​​HAdV-5-replikation og spredes mellem melanomceller og HBEC. Derfor vi næste sammenlignet HAdV-5 replikation i HBECs, SW900 og SK-MEL-28 mere direkte ved kvantificering af smitsomme produktion virus partikel i en runde af replikation (fig. 1B). Infektiøs viruspartikel produktion af HBECs var 100 gange højere end for SK-MEL-28 ved 36 timer og 48 timer efter infektion. Virus titre toppede for HBEC på 48 t, mens de fortsatte med at stige indtil 72 timer for SK-MEL-28, da de toppede på en titer stadig lavere end for HBECs. Infektiøs partikel produktion af SW900-celler viste lignende kinetik til HBECs, men forblev ca. 10 gange lavere. Vi konkluderer, at HAdV-5 replikation er forsinket i SK-MEL-28 celler sammenlignet med HBECs og SW900 celler, hvilket er i overensstemmelse med de cytotoksicitetsdata

(A) Cytotoksicitet:. Forskellige celletyper blev inficeret med enten vildtype HAdV-5 (

wt

) eller replikationsdeficiente kontrol virus HAdV-5 CMV-GFP (

GFP

) ved MOI på 10

1 til 10

-4 TCID

50 /celle. Celler blev primære humane bronkiale epitelceller (HBEC celler fra en af ​​to donorer giver lignende resultater vist), pladecellekarcinom i lungen (SK-MES-1, SW900), lungeadenocarcinom (A549), melanom (SK-MEL -28, Mel624) primære humane forhudsfibroblaster (HFF) og primære humane keratinocytter (PHK). Efter inkubation i otte dage blev overlevende celler fikseret og farvet med krystalviolet. Lung celler (

til venstre paneler

) viste generelt stærkere cytotoksicitet i forhold til melanomaceller (

midterste paneler

). (B) Replication: HBEC, SW900 eller SK-MEL-28-celler blev inficeret med 1 TCID

50 /celle af HAdV-5. Efter en times inkubation blev inoculums fjernet, og cellerne blev vasket tre gange. Celler og supernatanter blev høstet ved angivne tidspunkter og infektiøse viruspartikler blev kvantificeret ved bestemmelse af TCID

50. Søjler repræsenterer middelværdier af tredobbelte infektioner og fejllinjer standardafvigelser. Stjerner angiver statistisk signifikans (

p ≤ 0,05

) af forskelle mellem SK-MEL-28 og HBEC samt SK-MEL-28 og SW900 (*), eller mellem SW900 og HBEC (**). Stigninger i virustitere var signifikant (

p ≤ 0,05

) for HBEC indtil 48 h og SK-MEL-28 indtil 72 timer efter infektion. For SW900 viste virustitere ingen signifikant stigning efter 36 h (

p = 0,056 for 48 h versus 36 timer

).

Kinetik af viral genekspression og genom replikation af HAdV-5 i HBECs og cancerceller

Derefter undersøgte vi kinetikken for HAdV-5-replikation i HBECs og cancerceller mere detaljeret ved kvantificering af viral genekspression og genomreplikation (fig. 2). Da disse forsøg blev anvendt til at definere tidspunktet for efterfølgende genekspression profilering, blev de udført med de tilsvarende standardiserede procedurer, dvs. celler blev dyrket i microarray vækstmedier og inficeret med virustitere resulterer i 80% infektionseffektivitet for hver celletype (tabel S1). Indtræden af ​​viral DNA-replikation blev forsinket i melanomceller (SK-MEL-28, 20 h, Mel624, 24 h), og SK-MES-1-celler (20 h) i forhold til SW900-celler (16 h) og HBEC (16 timer eller 12 timer, afhængig af donor) (fig. 2B). Primære fibroblaster udviste et sent (24 h), men den primære keratinocytter et tidligt (16 timer) indtræden af ​​viral DNA-replikation. Disse forskelle i HAdV-5 replikering kinetikken mellem celletyperne korrelerede godt med forskelle på viral lysis og infektiøs partikel produktion (se fig. 1). Analyse af E1A-mRNA-ekspression kinetik viste, at forskelle i indtræden af ​​DNA-replikation mellem celletyperne afspejler tilsvarende forskelle i tidlig genekspression: HBEC, SW900 og keratinocytter viste en hurtigt indsættende E1A mRNA-ekspression nåede nær-grænseværdierne 8 timer efter infektion . I modsætning hertil for melanomceller, SK-MES-1 og fibroblaster en langsommere og vedvarende stigning i E1A-mRNA-ekspression blev observeret (fig. 2A). Årsagen til forskellene i E1A udtryk mellem cellelinjer er uklar. Eksperimenter med transient transfektion med et reporterplasmid indeholdende den første 557 bp af HAdV-5 genom afslørede ikke betydelige forskelle i E1A enhancer /promotor-aktivitet mellem celletyper (Fig. S2). Sen viral genekspression spejlet kinetikken for virale genom replikation, som forventet (fig. 2C). Vi konkluderer, at HAdV-5 replikation og lysis er betydeligt hurtigere i HBECs end i melanom celler. Replikation og lysis i lungecancerceller er, afhængig af cellelinien, hurtig eller mellemprodukt. For andre primære celler, replikation kinetik var afhængig af celletype: epiteliale keratinocytter viste hurtige og mesenkymale fibroblaster, som rapporteret før [27], [30], viste langsom replikation kinetik

Humane primære celler (

til venstre paneler

) og tumor cellelinier (

højre paneler

) blev inficeret med HAdV-5 på titre resulterer i 80% infektion effektivitet (

se

fig. 1

til navne på celletyper; HBEC d1, HBEC d2 er HBEC fra forskellige donorer

). Inoculums blev fjernet efter en time inkubering. Total RNA og DNA blev høstet for hver angivne tidspunkt og blev analyseret for E1A (A) og fiber (C) mRNA-niveauer og for virale genom kopier (B), henholdsvis ved qPCR. Resultaterne af repræsentative eksperimenter er vist; gentagelse eksperimenter gav identiske tidspunkter for indtræden af ​​E1A og fiber-mRNA-ekspression og virusgenomet replikation. For HBEC d2 blev genom kopiantal ikke bestemt ved 20 timer og 24 timer, på grund af et begrænset antal celler fra denne donor.

Komparativ analyse af HAdV-5-inducerede ændringer i cellulær genekspression i kræftceller versus HBECs

Vi næste undersøgt, om cellulær genekspression forskelligt påvirket af Ad-infektion i kræft versus normale celler. Derfor har vi foretaget en sammenlignende analyse af HAdV-5 infektion-inducerede ændringer i transcriptomes af HBECs (2 forskellige donorer), skællede celle lunge kræftceller (SK-MES-1, SW900) og melanom celler (SK-MEL-28, Mel624 ). Cellerne blev dyrket ved anvendelse af standardiserede betingelser og medier (se materialer og metoder for detaljer) og blev inficeret med HAdV-5 ved titere resulterer i 80% transduktionseffektivitet for hver celletype eller var mock-inficeret. Celler blev høstet til tiden for indtræden af ​​viral genom replikation, fordi på det tidspunkt forventedes vigtigste ændringer i den cellulære transkriptom i fremstilling af viral DNA-replikation. Endvidere har tidligere undersøgelser vist mindre ændringer på tidligere tidspunkter for andre celler [27], [28], [30]. Ved at vælge dette tidspunkt for hver celletype individuelt, ifølge kinetikken vist i fig. 2, kunne vi justere for forskelle i viral replikation kinetik mellem celletyper. Totalt RNA blev oprenset og anvendt til ekspression profilering. Microarray data er tilgængelige on-line på ArrayExpress databasen (tiltrædelse nummer E-MEXP-3125). Under bioinformatisk analyse genekspression i ikke-inficerede prøver blev defineret som steady state og sammenlignet med genekspressionsniveauer i inficerede prøver. Derved har vi bestemt virus-inducerede cellulære transkriptom, dvs. infektion-specifikke ændringer for hver celletype genekspression individuelt uden at skabe en bias gennem inter-celle variationer type ved forskellige genetiske baggrunde (se materialer og metoder for detaljer).

Vi fandt de stærkeste ændringer i genekspression efter HAdV-5-infektion i HBECs, efterfulgt af lungekræft celler, hvorimod genekspression meget mindre påvirket af HAdV-5-infektion i melanomceller (se også korrespondance analyse i fig. S3). Både antallet af cellulære gener signifikant reguleres af HAdV-5-infektion (tabel 1) og folden ændringer i genekspression (ArrayExpress, E-MEXP-3125) var højest for HBECs og var lavest for melanomceller. Disse resultater korrelerer med replikationseffektivitet af HAdV-5 for disse celler: HBECs viste både mest effektive HAdV-5-replikation og stærkeste virus-induceret genekspression, mens der for melanomceller både replikation effektivitet og virusinducerede ændringer i genekspression var lavest.

Som udtryk profilering af Ad-infektion af normale respiratoriske epitelceller ikke er blevet rapporteret før, vi først vurderede HAdV-5-induceret cellulære transkriptom i HBEC. Vores resultater viser induktion af gener involveret i DNA-replikation og cellecyklus, kromatin organisation, og nukleotid metabolisme, mens gener involveret i differentiering, regulering (for det meste negative) for spredning, og celledød regulering blev undertrykt (tabel 2 og tabel S2).

Næste, vi sammenlignet genekspression underskrifter fra HAdV-5-infektion i HBECs og cancerceller ved forskellige bioinformatiske analyser. Hierarkisk klyngedannelse af differentielt regulerede gener af de fem analyserede celletyper fremhævet to klynger af gener, der viser modstående regulering i melanomceller versus HBECs, dvs. gener, der induceres i HBECs, men undertrykt i en eller begge af melanomcellelinjer (indrammet i fig . 3A, forstørret i fig. S4). Interessant nok større klynge viser en yderst signifikant akkumulering af gener involveret i DNA-replikation, nukleotid metabolisme, cellecyklusregulering og DNA-skade respons (fig. 3B), som også blev fundet i den mindre klynge (her betydning akkumulering blev ikke nået på af det lille antal gener). Udvalgte gener er anført i tabel 3. Disse cellulære funktioner er ofte blevet rapporteret at blive induceret af Ad-infektion [17] og disse klynger indeholder flere af de gener stærkest induceret i HBECs (se tabel 2). Det er således påfaldende, at HAdV-5 undlader at inducere eller ofte endog undertrykker disse gener /cellulære funktioner i melanomceller. Genekspressionen data opnået ved microarray analyse blev valideret ved kvantitativ PCR (Fig. S5). Som et yderligere bioinformatik tilgang til at identificere cellulære veje mest differentielt reguleret af HAdV-5 infektion af melanomceller versus HBECs, udførte vi Ingenuity pathway analyse af genekspression data. Vi identificerede G1 /S overgang regulatoriske netværk med vigtige pro-S fase gener (

E2F

,

CCNE

,

CDK2

,

Cdc25A

) induceret i HBECs, men undertrykt eller ikke reguleret i melanom celler (fig. S6). Vi konkluderer, at HAdV-5 infektion af melanomceller undlader at inducere et panel af S-fase gener involveret i cellecyklusregulering, nukleotid metabolisme og DNA-replikation og reparation, som er induceret i de native HAdV-5-celler, HBEC.

(A) Hierarkisk klyngedannelse af gener ved hjælp af Multi-Experiment Viewer (

MeV 4.5.1

) baseret på ca.. 1000 mest markant regulerede gener (

se

Materialer og metoder

for data filtrering kriterier

). Klynger af gener, der viser modsatrettede regulering af HAdV-5-infektion i HBEC versus melanom celler er indrammet. Forstørrelser på disse klynger er vist i fig. S4. (B) Lister over gener i klynge 2 blev udsat for gen-ontologi analyse ved hjælp af Database til anmærkning, Visualisering og integreret Discovery (

DAVID,

david.abcc.ncifcrf.gov). P-værdier for GO vilkår blev korrigeret for flere test ved hjælp af Benjamini-Hochberg algoritme.

Analyse af S fasen induktion af HAdV-5-infektion ved hjælp af E2F-1 promotor som reporter

som genekspressionsprofilering indikerede, at HAdV-5 formår at fremkalde gener kritisk involveret i S-fase processer i melanomceller, vi næste udføres en uafhængig biologisk assay til at undersøge S-fase induktion af HAdV-5-infektion. E2F-1-promotoren, som er stærkt induceres under S-fasen, blev anvendt som en reporter for Ad-induceret S-fase entry [31]. HBEC, SW900, SK-MES-1, A549, SK-MEL-28 og Mel624 celler blev transficeret med luciferase- reporter plasmider indeholdende enten E2F-1 promotor eller den konstitutive SV40-promotor som kontrol. Transficerede celler blev efterfølgende superinficeres med enten HAdV-5 eller med HAdV-5 CMV-GFP som E1-deleteret, replikationsdefekt kontrol virus. Kvantificering af reportergenekspression (fig. 4) viste, at i lungecancerceller, infektion med HAdV-5 inducerer E2F-1-promotoren, men ikke SV40-promotoren, meget stærkere end den replikationsdeficiente viruskontrol. I modsætning hertil E2F-1-promotor-induktion af HAdV-5-infektion var minimal eller mangler i melanomceller. Disse resultater er i overensstemmelse med vores genekspression profilering data og viser, at S-fase induktion af HAdV-5 er effektiv i HBEC, men fattig på melanomceller. Salg

(A) luciferasereportergen plasmider indeholdende E2F-1 eller SV40-promotor-fragmenter blev transficeret ind i de angivne cellelinjer. Efter 24 timer blev celler inficeret med HAdV-5 (

wt

) eller replikationsdefekt HAdV-5 CMV-GFP (

GFP

) ved titere resulterer i 80% infektion. Luciferaseaktivitet blev kvantificeret tyve timer efter infektion. Kolonner repræsenterer middelværdier af tredobbelte transfektioner /infektioner og fejlsøjler afspejler standardafvigelsen. Stjerner angiver statistisk signifikans for sammenligninger af HAdV-5 med HAdV-5 CMV-GFP (

* p ≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001

). (B) Forskellige repræsentation af data vist i panel A:. Fold ændring i promoter aktivitet ved HAdV-5 sammenlignet med HAdV-5 CMV-GFP

Diskussion

Produktive Ad infektion er afhængig af et cellulært miljø, der støtter de forskellige trin i den virale replikationscyklus. Derfor Annoncer har udviklet strategier til at manipulere den cellulære miljø i værtsceller. Umiddelbare tidlige og tidlige virusproteiner etablere et komplekst netværk af interaktioner med værtens cellefunktioner for at modvirke værtsforsvar og inducere cellulære veje, der er nødvendige for replikation af det virale genom. Dette omfatter omprogrammering af cellulær genekspression. Her beskriver vi for første gang den HAdV-5 infektion induceret transkriptom for HBECs, der repræsenterer deres oprindelige værtsceller. Vi først fastlægges kinetikken for HAdV-5 replikation i HBECs, lyder således: E1A udtryk starter før 4 timer efter infektion (h.p.i.) og når et plateau ved 8 h.p.i .; den første stigning i virale genom og fiber mRNA kopier sker ved 8 eller 12 hpi, afhængig af donor, og infektiøs produktion partikel når et plateau ved 48 hpi. Dette efterfølges af en effektiv virus spredes i cellemonolaget, som observeret af cytotoksicitet assay efter lav titer infektion. Hele genomet ekspression profilering af HAdV-5-inficerede HBECs ved begyndelsen af ​​viral genom replikation, når der forventes større ændringer værtscellen ved tidlige virusgener, afslørede en signifikant stigning i ekspression for 424 og et fald til 519 af 18.631 vurderes gener. Således genrepression var fremtrædende på dette tidspunkt, selv i betragtning af, at det er vanskeligere at opdage end geninduktion grund af halveringstiden for mRNA til stede før infektion. Gener involveret i cellecyklus, DNA-replikation, chromatin organisation og nukleotid metabolisme blev akkumuleret i opreguleret gen population. Dette omfattede

E2F-2

, der viser den største stigning i mRNA-ekspression (11,5 gange),

CCNE1

og

CCNE2

(cyclin E1 og E2, 7.9- og 6.2 fold),

RRM2

(ribonukleotidreduktase M2 5.2-fold),

Cdc25A

(3,5 gange),

MCM2

,

7

10

(3-, 3.3- og 3.3-fold),

EXO1

(exonuclease 1; 3,1 gange),

RFC3

og

4

(replikation faktor C3 og 4, 2,8 og 2,1 gange),

PCNA

(prolifererende celler nuklear antigen; 2,2 gange) og flere histon, kromatin samling faktor og centromerfusioner gener. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der har etableret, men i andre celletyper, at S fase induktion i Ad-inficerede celler er nødvendig for viral replikation at fortsætte. Antallet af gener og induktion satser, vi rapport kan eventuelt endog undervurderet, som vi ikke synkronisere HBECs før infektion for at muliggøre en gyldig sammenligning med cancerceller. Gener med aktivitet i differentiering, negativ regulering af spredning (herunder

CDKN1A

, -2.9 og

CDKN2B

, -2,73), og celledød regulering blev akkumuleret i undertrykte gen befolkning (stærkest repression var for parathyroidhormon-lignende hormon, 16,1 gange). Notatet vi ikke identificere ophobning af gener involveret i immunitet i opreguleret genpulje.

HAdV-5-infektion er blevet sjældent undersøgt i normale respiratoriske epitelceller før. Adskillige studier af onkolytiske Ads har sammenlignet primært respiratoriske epitelceller med tumorceller i cytotoksicitet og infektiøse produktions- partikel assays for at vurdere selektiviteten og effektiviteten af ​​virusmutanter [32] – [39]. Disse studier har vist, at produktionen af ​​infektiøse HAdV-5 partikler i primære respiratoriske epitelceller er effektiv og toppe omkring 48 timer p.i. [37], [39], som er i overensstemmelse med vores resultater.

Tidligere undersøgelser af ekspression profilering af Ad-infektion er blevet udført med HeLa-celler og humane fibroblaster. For HeLa-celler, blev HAdV-2-infektion hos MOI 100 rapporteret at regulere 76, 60, eller 382 gener mere end 1,5 gange ved 6 timer, 10 timer eller 20 hpi henholdsvis (12.000 blev analyseret ved 6 timer, 7.500 gener ved 10 h og 20 h) [26], [28]. En anden undersøgelse viste 75 af 4.600 gener reguleres mere end dobbelt af HAdV-5 ved 24 h.p.i. af HeLa-celler [40]. Hvorvidt det lavere antal regulerede gener i forhold til HBECs i vores undersøgelse skyldes omdannelsen af ​​HeLa-celler er svært at bedømme på grund af forskelle i metodologi. I denne henseende viste vores undersøgelse et lavere antal regulerede gener for både lungekræft og melanomcellelinier i direkte sammenligning med HBECs (se nedenfor). S-fase-gener blev rapporteret at blive induceret af Ad-infektion i HeLa-celler, herunder

Cdc25A

(1,8 ved 10 h),

UNG Hotel (1.6) og histon gener [28], som vi fandt også i HBECs. Overlapninger findes også i nedreguleret gener:

MYC

(-1,9 versus -2,4 i HBEC);

THBS1

(thrombospondin-1, -2,6 versus -9,4 i HBEC);