PLoS ONE: Terapeutiske Konsekvenserne af GIPC1 Silencing i Cancer

Abstrakt

GIPC1 er en cytoplasmatisk stillads protein, der interagerer med talrige receptor signalering komplekser, og nye beviser tyder på, at det spiller en rolle i tumorigenese. GIPC1 udtrykkes kraftigt i en række humane maligniteter, herunder bryst-, ovarie-, gastrisk, og pancreascancer. Undertrykkelse af GIPC1 i humane bugspytkirtelkræftceller hæmmer

in vivo

tumor vækst i immunsvækkede mus. For bedre at forstå GIPC1 funktion, undertrykt vi dens udtryk i human og kolorektale cancer cellelinjer og humane mammae epitelceller (HMECs) og analyseret både genekspression og cellulær fænotype. Undertrykkelse af GIPC1 fremmer apoptose i MCF-7, MDA-MD231, SKBR-3, SW480 og SW620-celler og svækker forankringsuafhængig kolonidannelse af HMECs. Disse observationer indikerer GIPC1 spiller en væsentlig rolle i oncogen transformation, og dets ekspression er nødvendig for overlevelsen af ​​humane bryst- og colorektale cancerceller. Desuden blev en GIPC1 knock-down gen signatur, der anvendes til at afhøre offentligt tilgængelige bryst- og æggestokkræft microarray datasæt. Dette GIPC1 signatur statistisk korrelerer med en række bryst- og ovariecancer fænotyper og kliniske resultater, herunder patientens overlevelse. Tilsammen indikerer disse data, at GIPC1 hæmning kan repræsentere et nyt mål for terapeutisk udvikling til behandling af humane kræftformer

Henvisning:. Chittenden TW, Pak J, Rubio R, Cheng H, Holton K, Prendergast N, et al. (2010) Terapeutiske Konsekvenserne af GIPC1 Silencing i kræft. PLoS ONE 5 (12): e15581. doi: 10,1371 /journal.pone.0015581

Redaktør: Pawel Michalak, Virginia Tech, USA

Modtaget: Oktober 20, 2010; Accepteret: November 12, 2010; Udgivet: December 30, 2010

Copyright: © 2010 Chittenden et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. TWC, AC, JQ, JP, RR, KH, NP, VG, YC, SB, MS, JCM, EAH, MA, og RS blev støttet af midler fra Dana-Farber Strategic Fund Initiative og Claudia Adams Barr Foundation. J.Q. og J.C.M blev delvist understøttet af en bevilling fra National Library of Medicine (R01LM010129) af de amerikanske National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

GIPC1, GIPC2 og GIPC3 omfatter humane GIPC gen familie, som er karakteriseret ved en enkelt, konserveret PDZ domæne og GIPC homologi (GH1 og GH2) domæner [1]. GIPC1 er et stillads protein involveret i celleoverfladereceptorekspression, intracellulær transport, og signaltransduktion. Vi viste tidligere GIPC1 spiller en central rolle i fysiologisk vækstfaktor signalering, endotelcelle regulering, og arteriel forgrening morfogenese i både mus og zebrafisk [2], [3]. Desuden GIPC1 interagerer med og stabiliserer vigtige receptor signalering komplekser, herunder receptortyrosinkinaser TrkA og TrkB [4], [5], VEGF co-receptor neuropilin-1 [6], FGF co-receptor syndecan-4 [7], [ ,,,0],8], Frizzled-3-receptoren [9], IGF-1-receptor [10], TGF-beta type III-receptor [11], og endoglin [12]. Disse receptor komplekse vekselvirkninger afspejler rollen GIPC1 spiller som en adapter protein, som forbinder faktor-støttede processer anerkendelse multipel vækst til intracellulære signalveje, der kulminerede i celle cyklus regulering blandt andre funktioner.

I kræft, blev GIPC1 identificeret som et immunogent antigen overudtrykt i både bryst- og ovarietumorer [13], [14]. GIPC1 og GIPC2 mRNA’er er udtrykt i Okajima, TMK1, MKN45 og KATO-III humane gastriske cancerceller, og i forskellige primære gastriske tumorer [15], [16]. GIPC1 er højt udtrykt i human pancreas adenocarcinom og spiller en central rolle for stabiliteten af ​​IGF-1R i pancreas adenocarcinom cellelinier [17], [18]. Senest blev GIPC1 undertrykkelse i humane bugspytkirtelkræftceller vist at hæmme

in vivo

pancreas tumorvækst i immunsvækkede mus [19]. Imidlertid er den mekanisme, som GIPC1 fremmer kræft vækst ikke veletableret.

For at undersøge den rolle, GIPC1 spiller i kræft, vi brugte RNAi til at undertrykke GIPC1 udtryk i både bryst og kolorektal cancer celler og humane mammae epitelceller (HMECs). Vi startede vores undersøgelse ved at undersøge ændringer i den globale genekspression mønstre efter GIPC1 undertrykkelse. Vores analyse viser, at GIPC1 er nødvendig for bryst- og tarmkræft celleoverlevelse og spiller en væsentlig rolle i onkogen transformation.

Resultater

GIPC1 lyddæmpning og genekspression mønster i MDA-MB231 humane bryst kræftceller

GIPC1 genekspression blev slået ned i MDA-MB231-celler ved transduktion af korte hårnål RNA (GIPC1 KD), sammen med tom-vektor og ikke-transducerede kontroller. Efter puromycinselektion blev syv uafhængige biologiske gentagelser af hver transduktion dyrkes i kultur, blev RNA ekstraheret, og GIPC1 knock-down blev analyseret under anvendelse qPCR. qPCR fundet 85% knock-down i GIPC1 KD celler i forhold til ikke-transducerede og tom-vektor kontrol. RNA fra de uafhængige puljer blev hybridiseret til Affymetrix Human Genome U133 Plus 2,0 GeneChips ™, data blev normaliseret ved hjælp Robust Multi-Array Analysis [20] implementeret i BioConductor

affy

pakke, og eksplorativ analyse udført med hierarkisk klyngedannelse hjælp den BioConductor pakken,

made4

[21]. En stærk biologiske effekt af GIPC1 silencing blev observeret (fig S1). Betydning Analyse af microarrays (SAM q-værdi = 0%). [22] blev anvendt til at identificere 3081 probesets (~2271 gener) med ændret udtryk i GIPC1 KD celler sammenlignet med vektor kontrol celler

Dette GIPC1 KD gen liste blev sammenlignet med egenskaberne ved Bild et al. [23], som analyserede overekspression af fem onkogener (aktiveret H-Ras, menneskelige E2F3, aktiveret β-catenin, human c-myc, og human c-Src) i primære HMECs, bruge

orderedlist

[ ,,,0],24]. Vi fandt en statistisk signifikant overlap af unormalt udtrykte gener i GIPC1 KD og de aktiverede H-Ras overekspression gen lister (P«0.05, figur S2).

De 3081 GIPC1 KD probesets repræsenterer 2271 gener blev brugt i en funktionel berigelse analyse ved hjælp Expression Analysis Systematisk Explorer (EASE) [25] og indlejrede EASE, som gælder EASE repræsentationelle analyse iterativt at identificere GO datter vilkår, der driver betydningen af ​​højere niveau vilkår (Chittenden

et al

., indsendt). EASE bruger Fishers eksakte test for at identificere funktionelle grupper i gen-sæt, der er overrepræsenterede i forhold til baggrunden fordeling af gener analyseret. Otte af 67 overrepræsenteret gen ontologi (GO) vilkår fundet af EASE er vist i tabel 1, blandt hvilke er vilkår forbundet med celleproliferation, cellecyklus, cellecyklusstop, apoptose, cellemigrering, og ubiquitinmedieret proteinnedbrydning.

Indlejret EASE (nEASE) er en udvidelse af EASE, der bruger en anden, sub-niveau, iterativ Fishers eksakte test for at finde GO underklasser, der driver EASE valg sigt. Resultaterne, vist i tabel 2, omfatter 17 statistisk berigede funktionelle underklasser af cellulære processer fundet af lethed. nEASE fandt, at EASE-signifikant GO biologisk proces klasser,

celledeling

,

protein modifikation

,

mitose

,

celle vækst og /eller vedligeholdelse

,

cytoskeleton organisation og biogenese

, og

fysiologisk proces

kollektivt drevet af de biologiske processer

celleadhæsion og integrin-medieret signalering

. Ligeledes EASE-signifikant sigt

cytoplasma organisation og biogenese

blev fundet af nEASE at være drevet delvist af

cytokinese efter mitose

. nEASE fundet

apoptose

betydelig grund GO vilkår forbundet med

regulering af endeløse actin

og

JAK-STAT signaleringskaskade

. Altered udtryk blev fundet i gener involveret i både

celle migration

stofskifte

; modifikationer i

ubiquitin-protein-ligaseaktivitet

skyldes ændringer i proteinbindingen. nEASE viser også, at GIPC1 KD ændrer ekspression af gener i EGF, TGFp, og Wnt-receptor signaling pathways.

Kollektivt antyder disse data, at GIPC1 er involveret i celleproliferation, apoptose, cellemotilitet og adhæsion og ubiquitinmedieret proteinnedbrydning. Disse data tyder på, at GIPC1 spiller en bred rolle ud over dens tidlige tilknytning til vaskulær regulering, og at det kan i kræft, være involveret i de processer, der er forbundet med celle- cyklus kontrol.

GIPC1 lyddæmpning hæmmer MDA-MB231 spredning og inducerer apoptose

Fordi GIPC1 KD påvirker processer knyttet til cellevækst, vi vurderet virkningerne af GIPC1 udtømning på MDA-MB231 celleproliferation. Vi bestemt cellernes levedygtighed efter GIPC1 udtømning af både tilsætte Resazurin og MTS tetrazolium reduktion analyser i eksperimentelle og kontrol celler. I begge tilfælde GIPC1 nedregulering forårsager en signifikant reduktion i cellernes levedygtighed efter 48 timer efter podning (figur 1A og 1D). Da GIPC1 interagerer med neuropilin-1 [6], blev celler behandlet med VEGFA (10 ng /ml) for at bestemme, om tabet af cellelevedygtigheden forårsaget af GIPC1 suppression kunne overvindes ved en relevant mitogen. VEGFA behandling er ikke tilstrækkelig til at forhindre en omtrentlig 40% og 60% reduktion i cellelevedygtighed i GIPC1 KD celler ved 48 og 72 timer, (figur 1D).

A. Vurdering af cellelevedygtighed (blå) og caspase 3/7 aktivitet (lyserød) ved 0, 24, 48 og 72 timer. Solid linier med blå kasser (ikke-transduceret) og blå diamanter (uden for målgruppen) og stiplet linje med blå trekanter (GIPC1 KD) angiver cellernes levedygtighed. Pink betegner caspase 3/7 aktivitet. B. Normaliseret caspase 3/7 aktivitet. Total caspase 3/7 aktivitet blev normaliseret til cellelevedygtighed og vurderes ved 0, 24, 48 og 72 timer. Normalisering indikerer en 2,1 gange stigning i caspase 3/7 aktivitet i GIPC1 KD celler sammenlignet med ikke-målceller på 72 timer. C. Tunnel assay. DNA fragmentation blev vurderet som% positiv kontrol. GIPC1 KD korrelerer med en 11,24 gange stigning i apoptose (GIPC1 /Non-målet; P 0,05). D. Vurdering af celleproliferation efter VEGF (10 ng /ml) induktion. Proliferation blev vurderet ved 0, 24, 48 og 72 timer. Dag 1, 2 og 3 blev normaliseret til dag 0. Solid linier med blå kasser (ikke-transduceret) og blå diamanter (ikke-mål) og stiplet linje med blå trekanter (GIPC1 KD) viser celleproliferation i sult medier. Pink betegner VEGF induktion. D. Vurdering af spaltet PARP1. PARP1, spaltet PARP1, GIPC1, og GAPDH-ekspression blev vurderet ved Western blot i MDA-MB231 humane brystcancerceller. Data er præsenteret som middelværdi ± SEM. Stjerner angiver statistisk signifikans (p ≤ 0,05) mellem ikke-target og GIPC1 KD betingelser.

GIPC1 KD har også indflydelse apoptose. For at bestemme virkningerne GIPC1 dæmpende på caspase 3/7 aktivitet, blev fluorometriske reduktion resazurin assay er vist i figur 1A multiplekset med et Apo-ONE homogen caspase-3/7-assay. Når caspase 3/7 aktiviteter er normaliseret til levedygtighed celle værdier, vi registreret en betydelig stigning i caspase 3/7 aktivitet i GIPC1 KD celler i forhold til at styre cellelinjer på 72 timer (Figur 1B). Vi fandt lignende tab af cellelevedygtighed og øget caspase 3/7 aktiviteter efter GIPC1 silencing i MCF-7 og SKBR-3 human brystcancer og SW480 og SW620 humane colorektale cancercellelinier (data ikke vist).

for at bestemme hvorvidt stigningen i caspase 3/7 aktivitet fundet i MDA-MB231-celler er associeret med DNA-fragmentering, udførte vi en deadend kolorimetrisk TUNEL-assay (figur 1C). GIPC1 målretning inducerer DNA fragmentering; vurderes som et forhold i forhold til at styre celler, det relative forhold af apoptotiske celler (GIPC1 KD /ikke-mål) er 11,24 (P 0,05). Desuden er stigningen i både caspase 3/7 aktivitet og DNA-fragmentering i GIPC1-tavshed celler forbundet med en øget udtryk af kløvet PARP1 (Figur 1D). Disse data er i overensstemmelse med de microarray resultater (tabel 1 og 2), der angiver GIPC1 lyddæmpning hæmmer celledeling og fremmer apoptose.

GIPC1 lyddæmpning inducerer MDA-MB231 G2 celle-cyklus anholdelse

Microarray resultater impliceret cellecyklus effekter af GIPC1 KD. Vi udførte single-channel FACS-analyse af GIPC1 KD celler og de tilknyttede kontroller at udforske cellecyklus i kontrol og GIPC1 KD celler. GIPC1 suppression fremmer subtile G1 og dyb G2-standsning på dag 14 efter puromycinselektion af GIPC1 shRNA transfektanter (figur 2A). Disse data indikerer akkumulering af celler i både G1 (43.70% ± 1,86% celler vs. 38.58% ± 0,21%) og G2 (46.33% ± 1,29% versus 27.70% ± 0,67%) faser af cellecyklus i GIPC1 KD forhold til uden for målgruppen kontrol celler. GIPC1 KD celler fortsætter med at krydse S-fasen mod den fremtrædende G2 anholdelse (9,98% ± 0,57% vs. 33,73% ± 0,53%). GIPC1 knockdown resulterer også i en signifikant akkumulering af celler i en 8N DNA top (9,74% ± 0,67% vs. 0%) og i cellulært debris (sub-G1, 5,52% ± 0,54% versus 1,57% ± 0,17%). Sammen med microarray resultater præsenteres i tabel 1 og 2, og sammenlignet med passende kontrol, antyder disse data GIPC1 undertrykkelse fremmer celledeling og apoptose.

A. Enkelt kanal FACS analyse af ikke-transduceret uden for målgruppen, og GIPC1 KD celler 14 dage efter transduktion. Grey er% celler i G1. Gul indikerer% celler i S-fasen. Orange lig% celler i G2. Blå er% celler ved 8N. D angiver% debris. B. Western blot analyse af Cdc25B, GIPC1, og GADD 45 α /γ udtryk i ikke-transduceret uden for målgruppen, og GIPC1 KD celler. Data er præsenteret som middelværdi ± SEM. Stjerner angiver statistisk signifikans (p ≤ 0,05) mellem uden for målgruppen og GIPC1 KD betingelser.

For at bestemme årsagerne til den unormale cellecyklus fundet med GIPC1 undertrykkelse, vi brugte Western blot for at evaluere protein udtryk for kendte celle-cyklus check-point regulatorer fundet differentielt udtrykt i microarray analyse. GIPC1 nedregulering inducerer et tab af Cdc25B og en stigning i GADD45α /γ-proteinekspression (figur 2B). Cdc25B er nødvendig for CDK1 aktivering og ibrugtagning mitose; henviser til, at der er udtryk for de GADD45 protein familiemedlemmer steget efter vækst anholdelse og DNA-skader. Disse resultater understøtter både microarray (tabel 1 og 2) og FACS (figur 2A) resultater indikerer, at GIPC1 undertrykkelse overvejende fremmer G2 anholdelse.

GIPC1 undertrykkelse ændrer celleadhæsion og motilitet

Microarray fund tyder GIPC1 er involveret i vedhæftning og motilitet (tabel 1 og 2). Vi vurderede virkningerne af GIPC1 tavshed på celle motilitet og vedhæftning i MDA-MB231 eksperimentelle og kontrol celler. GIPC1 lyddæmpning væsentligt forbedret MDA-MB231 celleadhæsion ved både 30 og 60 minutter efter udpladning (fig S3A). Vi brugte en ridse (sår) assay til at vurdere virkningerne af GIPC1 KD på celle motilitet. GIPC1 suppression faldt betydeligt MDA-MB231 cellemigration, enten med eller uden otte timers vækst faktor induktion (fig S3B). Microarray resultater indikerer GIPC1 suppression er associeret med en berigning af unormalt udtrykte gener i integrin-medieret, RHO protein, JAK-STAT, EGF, Ras, TGFp og Wnt pathways (tabel 2 og figur S2). Disse veje, først findes i vores bioinformatik analyse, regulere både celleadhæsion og migration og er kandidater til yderligere undersøgelse. Eksperimentelt GIPC1 depletion resulterer i forbedret celleadhæsion og reduceret cellemotilitet. GIPC1 udtynding resulterer i tab af EGF, FGF2, PDGF-BB, TGFp1, og VEGFA induceret cellemotilitet (fig S3B). Disse data antyder, at GIPC1 spiller en rolle i en række vigtige signaltransduktionsveje, der har indvirkning på både celleadhæsion og motilitet.

GIPC1 er påkrævet for forankringsuafhængig kolonidannelse af tHMEC-LT-st cellelinie

for at vurdere, om GIPC1 er nødvendig for onkogen transformation, undertrykt vi til udtryk i hTERT-udødeliggjort HMECs transformeret med SV40 Large T (LT) og Small T (st) antigener (tHMEC-LT-st) [26]. tHMEC-LT-ST-celler er i stand til forankringsuafhængig vækst; dog GIPC1 udtømning signifikant reduceret effektiviteten af ​​forankringsuafhængig kolonidannelse af tHMEC-LT-st cellelinie sammenlignet med kontrolceller. Som en yderligere kontrol blev en anden GIPC1 shRNA konstrukt anvendt i dette sæt af eksperimenter (figur 3A). Disse data indikerer, at GIPC1 er påkrævet for forankringsuafhængig kolonidannelse, et mål for oncogen transformation af HMEC-celler.

A. Blød agar koloni dannelse i nontransduced uden for målgruppen, og GIPC1 KD tHMEC-LT-st celler celler. B. Western blotting angiver effectivness af GIPC1 tavshed med to uafhængige GIPC1 shRNA contructs: NM_005716.2-1083s1c1 og NM_005716.2-499s1c1. Data er præsenteret som middelværdi ± SEM. Stjerner angiver statistisk signifikans (p ≤ 0,05) mellem ikke-target og GIPC1 KD betingelser.

Klinisk relevans af gener, der reguleres af GIPC1 knock-down

For yderligere at vurdere den antagelse, at GIPC1 spiller en væsentlig rolle i udviklingen og progressionen af ​​menneskelige kræftformer, 411 probesets med en fold-ændring ≥2 i SAM-analyse af GIPC1 udtømte MDA-MB231-celler i forhold til kontrol-celler (GIPC1 underskrift tabel S1) blev anvendt til at afhøre to offentligt tilgængelige og klinisk kommenteret bryst- og ovariecancer datasæt med BioConductor pakken,

globaltest

[27]. En stor fusionerede brystkræft mikromatrice datasæt med 689 forbehandlingsanlæg prøver [28], [29], [30] og en ovariecancer datasæt med 274 behandlede patienter [31] blev anvendt til analysen. I Global Test multivariate analyse af patienterne 689 brystkræft, er GIPC1 KD signatur forbundet med tumor bedømmelse (P 0,01), lymfeknude-status (P 0,0001), og ER status (P 0,05). Den GIPC1 signatur er også stærkt associeret patient overlevelse inden ErbB2 + /ER + (n = 42, P 0,001), luminale B (n = 146, P 0,05) og basal (n = 92, P 0,01) molekylær brystkræft undertyper (tabel 3). Analyse af kræft i æggestokkene datasæt viser, at GIPC1 signatur er signifikant associeret med alle kliniske variabler vurderes; herunder patientens overlevelse og tumor stadie, grad og type (tabel 3). Disse data understøtter de seneste rapporter tyder på, at GIPC1 spiller en rolle i human og ovariecancer ætiologi og progression [13], [14].

Diskussion

Der vides kun lidt om den rolle af GIPC1 i tumorvækst og progression. Beviser indikerer det er overudtrykt i en række humane maligniteter, herunder bryst-, ovarie-, gastrisk, og pancreascancer [13], [14]. Desuden er en nylig rapport viser GIPC1 er nødvendig for

in vivo

pancreas tumorvækst i immunsvækkede mus [19]. I denne undersøgelse, brugte vi både beregningsmæssige og eksperimentelle metoder til at undersøge GIPC1 i human og kolorektal cancer celler, og hos patienter med bryst- og ovariecancer. Vi fandt, at GIPC1 er påkrævet for bryst- og tarmkræft celleoverlevelse, og det spiller en væsentlig rolle i oncogen transformation af humane mammae epitelceller.

Vores data viser også GIPC1 spiller en vigtig rolle i cellecyklusregulering. EASE analyse af GIPC1 knockdown i MDA-MB231-celler viser berigelse af differentielt udtrykte gener med kommenterede funktioner i G1 /S og G2 /M-overgange, cellecyklus anholdelse, celleproliferation og apoptose. nEASE søger biologiske forklaringer på disse vigtigste virkninger og implicerer potentielle abnormiteter i celleadhæsion, integrin-medieret signalering, og regulering af actincytoskelettet. Derudover nEASE fundet en berigelse af gener involveret i cytokinese. Dette fund er i overensstemmelse med en nylig rapport indikerer, at aktivering af syndecan-4 (SDC4), en transmembrane heparansulfatproteoglycan der interagerer med GIPC1 og FGFR1 receptoren til at regulere FGF2 signalering, er nødvendig for cytokinese af MCF-7 humane brystkræftceller [32]. Keller-Pinter

et al

. viste, at serine179-phosphorylering og ektodomæne udgydelse af SDC4 er maksimal ved G2 /M. Angivelse af manipuleret mutanter efterligner serin 179-phosphorylering (Ser179Glu) eller fosforylering-resistent SDC4 forårsagede ufuldstændig abscission og kæmpe, flerkernede celler [32]. Desuden SDC4 regulerer actin polymerisering, fokal vedhæftning dannelse, og celle motilitet gennem PI3K signalering

nEASE analyse viser også, at GIPC1 er involveret i seks store signaltransduktion netværk i brystkræft:. Integrin-medieret, RHO protein, JAK-STAT, EGF, TGF og WNT. Disse resultater understøtter tidligere rapporter indikerer, at GIPC1 interagerer med Frizzled-3-receptoren [9], TGF-beta type III-receptoren [11], og endoglin [12]. Trods det faktum, at vores analyse ikke tyder på en berigelse af gener i PI3K signaltransduktion netværk, finder vi, at GIPC1 undertrykkelse nedsætter udtryk for en række centrale gener involveret i vejen, herunder

SDC2, PIK3CB, PIK3D, PDK1, Akt3, CDC42BPA, CDC42EP3, RACGAP1

og

Rac1

. Omvendt GIPC1 nedregulering fremmer betydelige stigninger i genekspression for

PTEN, p27

Kip1, RHOBTB1, RHOB

og

Pak2

. Mens afvigende aktivering af PI3K-signalering er involveret i induktionen af ​​oncogen transformation, disse gener fungerer i fællesskab for at integrere mekanismer, der kontrollerer en række cellulære processer, herunder cytoskelet regulering, cellemotilitet og adhæsion, celleproliferation og apoptose [26], [ ,,,0],33].

Eksperimentel validering af genekspression profilering resultater indikerer, at GIPC1 nedregulering fremmer G2 celle-cellecyklusstandsnings, apoptose, og vekslen i celleadhæsion og motilitet i MDA-MB231 humane brystcancerceller. GIPC1 udtømning korrelerer med øget caspase 3/7 aktivitet, DNA-fragmentering, opregulering af GADD45 familiemedlemmer, og tab af Cdc25B udtryk. Desuden GIPC1 nedregulering korrelerer med markante reduktioner i celle levedygtighed og evalueringer i caspase 3/7 aktiviteter i MCF-7 og SKBR-3 human brystkræft og SW480 og SW620 humane kolorektal kræftceller.

Ved at bruge RNAi at nedbryder GIPC1 mRNA i MDA-MB-231-celler kunne vi identificere en lang række gener, hvis ekspression blev ændret. Vi sammenlignede denne GIPC1 signatur til offentligt tilgængelige bryst- og æggestokkræft genekspression datasæt for hvilke godt kommenterede fænotype og outcome data var tilgængelige. Vi fandt en stærk korrelation mellem GIPC1 underskrift og en række vigtige patient kliniske variable.

I brystkræft, brugte vi Global Test metode og fundet tilbagefald overlevelse var signifikant associeret med GIPC1 signaturen kun inden for specifikke molekylære undertyper af sygdommen: patienter med luminal B ER + tumorer (high-grade ER +, P = 0,015), ERBB2 + /ER + sygdom (P = 4,3 × 10

-4), og måske basale-lignende eller tredobbelt-negative cancere (P = 0,0074). Inden luminale A ER + (lav kvalitet ER +) tilfælde og patienter med ErbB2 + /ER- kræftformer, den GIPC1 signaturen var ikke prædiktiv for fornyet overlevelse. Derfor kan GIPC1 underskrift være i stand til at skelne patientens udfald inden for grupper af høj kvalitet brystkræft, især dem, der er ER +, og ikke blot at skelne tumor bedømmelse (høj vs. lav) eller ER status (positiv versus negativ). I kræft i æggestokkene datasæt er GIPC1 signatur statistisk korreleret med alle kliniske variabler vurderede: samlet overlevelse og tumor kvalitet, type, og scene. Et fælles træk ved de sammenhænge, ​​vi fandt mellem GIPC1 signatur og kliniske parametre i bryst- og ovariecancer var en forening med høj kvalitet tumorer, der er kendetegnet ved overdreven DNA-skader og dårlig patient prognose.

tilgængelige udtryk data indikerer, at GIPC1 i høj grad udtrykkes i alle mennesker cancer og vores resultater tyder GIPC1 er en nødvendig komponent for human vækst cancer fremmes af opstrøms vækstfaktorer og deres receptorer. Fordi GIPC1 signaltransduktion aktiveres af en lang række celleoverfladereceptorer og fordi det også er kendt for at være essentiel for forgrening morfogenese af arterielle blodkar, målretning GIPC1 medierede pathways er en logisk terapeutisk strategi til behandling af humane cancere. Især vores data tyder målrettet GIPC1 kan være særligt vigtigt for østrogen-receptor-positive høj kvalitet brystkræft.

Materialer og metoder

Cell kultur

MCF-7 , MDA-MB231, og SKBR-3 humane brystcancercellelinier og SW480 og SW620 humane colorektale cancercellelinier blev indkøbt fra ATCC. Humane mammae epitelceller (HMECs) blev købt hos Invitrogen (# A-10565). Primære HMEC forsøg blev udført ≤ passage 10.

hTERT

-immortalized HMECs udtrykker SV40 LT og st blev dyrket som tidligere beskrevet [26]. Alle cellelinier blev dyrket i 100 × 20 mm vævskulturskåle (Becton Dickinson # 353.803). MCF-7-celler blev dyrket ved 37 ° C og 5% CO

2 i EMEM (GIBCO # 11.095-080) suppleret med 10% varmeinaktiveret kalvefosterserum (ATCC # 30-2020) og 1% Antibiotika-Antimyotic (Invitrogen # 15240-062). MDA-MB231-celler blev dyrket ved 37 ° C og 0% CO

2 i Leibovitz L-15 medium (GIBCO # 11.415-064) suppleret med 10% FBS og 1% Antibiotika-Antimyotic. SKBR-3-celler blev dyrket ved 37 ° C og 5% CO

2 i McCoys 5A medium (GIBCO # 12.330-031) suppleret med 10% FBS og 1% Antibiotika-Antimyotic. SW480 og SW620-celler blev dyrket ved 37 ° C og 0% CO

2 i Leibovitz L-15 medium suppleret med 10% FBS og 1% Antibiotika-Antimyotic. Primære HMECs blev dyrket ved 37 ° C og 5% CO

2 i Medium 171PRF (phenolrødt-frit) (GIBCO # M-171PRF-500) suppleret med brystepitel- vækst supplement (megs) (Gibco # S-015- 5) og 1% antibiotika-Antimyotic. Alle cellelinjer blev fastholdt på 60-70% sammenflydning.

shRNA lentiviral vektor produktion og transduktion

GIPC1 (NM_005716.2-1083s1c1 og NM_005716.2-499s1c1) og tomme vektor shRNA plasmider som samt Delta 8.9 og VSVG plasmider blev opnået fra The RNAi Facility på Dana-Farber Cancer Institute. En forvrænget, ikke-target shRNA plasmidet var køb fra Sigma (# SHC002). cDNA-versioner af SV40 LT + st (LTG) blev klonet ind pWZL-blast som tidligere beskrevet [26]. Alle plasmider blev dyrket i LB Broth +100 pg /pl Ampicillin (Teknova # L8105). Plasmider blev oprenset ved anvendelse af Qiagen HiSpeed ​​Plasmid Maxi Kit ifølge producentens instruktioner (Qiagen # 12663), og udbytter blev vurderet ved anvendelse af en NanoDrop spektrofotometer (Thermo Scientific # SID-10.135.606). HEK 293T /17 celler (ATCC # CRL-11268) blev ekspanderet til en densitet på 5 x 10

6/100 mm celledyrkningsskål (BD Primaria # 353.803) i Dulbeccos modificerede Eagles medium (ATCC # 30-2002) + 10% varmeinaktiveret kalvefosterserum (ATCC # 30-2020) og inkuberet ved 37 ° C, 5% CO

2 i 24 timer. Hver plade blev derefter transficeret med FuGENE 6 Transfection Reagent (Roche # 11814443001), VSVG oprenset plasmid, Delta 8.9 oprenset plasmid, og enten 6 ug shRNA oprenset plasmid eller 4 ug oprenset LTG

WB plasmid i OptiMem medier (Invitrogen # 11.058-021). Medier blev ændret én dag efter transfektion med DMEM + 10% FBS medier indeholdende 1% Antibiotika-Antimyotic (Invitrogen # 15240-062). Medier indeholdende det emballerede virus blev opsamlet på dag 2 efter transfektion frisk medium blev tilsat, og den virale høst blev opsamlet igen på dag 3 efter transfektion. Det pakkede lentivirus blev filtreret med 0,45 um filtre (Corning # 431.220) og koncentreret i 90 minutter ved 16.600 g ved anvendelse af en ultracentrifuge (Beckman # L8-70M). Efter resuspension blev lentivirus titreret under anvendelse af QuickTiter lentivirus kvantificeringskit (Cell Biolabs # VPK-108-HIV) ifølge producentens anvisninger. For lentiviral shRNA vektor transduktion, vækstmedier indeholdende polybren og et volumen på lentivirus, der svarede til en MOI på 50 blev tilsat til cellerne og inkuberet natten over i cellelinje specifikke dyrkningsbetingelser. Næste dag blev virus erstattes medierne med cellelinie specifikke vækstmedier. Efter 72 timer blev vækstmediet suppleret med enten 10 ug /ml puromycin og /eller 2,5 ug /ml blasticidin. Eksperimenter blev udført 14 dage efter selektion.

RNA-isolering, microarray hybridisering og fremstilling, og kvantitativ PCR

Totalt RNA blev isoleret fra cellelinjer under anvendelse af RNeasy Mini Kit (Qiagen # 74106) ifølge producentens specifikationer med QIAshredder søjler (Qiagen # 79.656) til cellepelleten homogenisering. Total RNA blev kvantificeret ved anvendelse af en NanoDrop spektrofotometer (Thermo Scientific # SID-10.135.606). Enogtyve Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrays blev anvendt til denne undersøgelse. Syv arrays per gruppe blev anvendt til de følgende MDA-MB231-cellelinier: ikke-transducerede, tom vektor, og GIPC1 KD. Microarray hybridisering og forarbejdning blev udført under anvendelse af standardprotokoller på mikroarrayet Core Facility på Dana-Farber Cancer Institute. Prøve behandling blev udført med en Affymetrix GeneChip Fluidik Station FS450 og arrays blev scannet med en GCS300 vifte scanner i henhold til producentens anbefalinger. Totrins Kvantitativ realtids-PCR blev udført med en Applied Biosystems 7900HT (Applied Biosystems # 4.329.001) system. TaqMan GIPC1 (Applied Biosystems # Hs00991802_m1) og 18S Endogen Kontrol (Applied Biosystems # 4.304.437) analyser blev kørt ved 8 replikater per prøve ved hjælp af den relative Kvantificering (Delta Ct), FAM ingen quench indstillinger. Delta Cts blev beregnet ved at trække den gennemsnitlige Ct af de endogene kontrol fra den gennemsnitlige Ct af forstærkning målet. Delta-delta Ct blev beregnet ved at subtrahere den gennemsnitlige delta CT af tom vektor prøver fra den gennemsnitlige delta Ct med målvektoren prøver. Fold forandring blev beregnet som 2 til magten af ​​delta-delta Ct.

Microarray data normalisering og analyse

Rådata (.cel filer) blev importeret til R og data blev normaliseret med RMA [ ,,,0],20] ved hjælp af BioConductor pakken,

affy

. Initial eksplorativ dataanalyse blev udført med hierarkisk klyngedannelse analyse (gennemsnit-kobling og metrisk 1 – Pearson korrelationskoefficient distance) ved hjælp af BioConductor pakken,

made4

[21]. To klasse uparrede betydning Analyse af microarrays (SAM;. [22] med en 0% falsk opdagelse sats (q-værdi) blev anvendt til bestemmelse differentiel genekspression mellem tom vektor kontrol og GIPC1 KD MDA-MB231-celler