PLoS ONE: forordning og Methylering af Tumor suppressor MIR-124 af Androgen receptor i Prostata Cancer Cells

Abstrakt

Prostatakræft (PCA) er den hyppigst diagnosticerede kræft for mænd i den udviklede verden. Androgenreceptor-signalvejen spiller en vigtig rolle i prostatakræft progression. Nylige undersøgelser viser, at microRNA MIR-124 udøver en tumor undertrykkende funktion i prostatacancer. Men forholdet mellem AR og MIR-124 er uklar. I nærværende undersøgelse fandt vi en negativ feedback loop mellem AR og miR-124-ekspression. På den ene side MIR-124 var en positivt reguleret målgen af ​​AR, på den anden side, overekspression af MIR-124 inhiberede ekspressionen af ​​AR. Desuden fandt vi, at MIR-124-2 og MIR-124-3 promotorer blev hypermethyleret i AR-negative PCA-celler. Desuden overekspression af miR-124 inhiberede spredning satser og invasionsevne kapacitet PCA celler

in vitro

, og undertrykte xenograft tumorvækst

in vivo

. Tilsammen vores resultater understøtter en negativ feedback loop mellem AR og miR-124-ekspression. Methylering af miR-124-2 og miR-124-3 kan tjene som en biomarkør for AR-negative PCA celler, og overekspression af miR-124 kunne være af potentiel terapeutisk værdi til behandling af PSA.

Henvisning : Chu M, Chang Y, Guo Y, Wang N, Cui J, Gao WQ (2015) forordning og Methylering af Tumor suppressor MIR-124 af Androgen receptor i prostatacancerceller. PLoS ONE 10 (4): e0116197. doi: 10,1371 /journal.pone.0116197

Academic Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTRIG

Modtaget: Oktober 1, 2014 Accepteret: December 7, 2014; Udgivet: April 10, 2015

Copyright: © 2015 Chu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information fil

Finansiering:. studiet er støttet af midler til W.-Q. Gao fra det kinesiske ministerium for videnskab og teknologi (2012CB966800; 2013CB945600 og 2012CB967900), National Natural Science Foundation of China (81.130.038 og 81.372.189), Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune (Pujiang programmet), Shanghai Uddannelsesudvalget Key Disciplin og specielle Foundation (J50208), Key Disciplin og specielle Foundation of Shanghai Health Bureau og KC Wong fundament, og M. Chu fra Shanghai Postdoc Scientific Program Kina (12R21415100)

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerer eksisterer interesser.

Indledning

MikroRNA’er (MIR) er endogene, enkeltstrengede små ikke-kodende RNA (ca. 20-22 nukleotider), som normalt forårsager gendæmpning ved at reducere mRNA-stabilitet og /eller oversættelse [1]. Deres afvigende ekspression har vist sig at være associeret med adskillige cancertyper [2-4]. MIR-124 er en særdeles konserveret microRNA der spiller en tumor suppressor rolle i forskellige former for kræft [5-9]. Den modne sekvens af MIR-124 forarbejdes fra tre precursor varianter sekvenser, som er placeret på kromosomerne 8p23.1 (MIR-124-1), 8q12.3 (MIR-124-2) og 20q13.33 (MIR-124- 3), der alle indeholder CpG-øer i deres promotorregion [9].

CpG-øer er genomiske regioner, der indeholder en høj frekvens af bindingssteder for CpG og typisk beliggende nær transcription start-sites [10]. Methylering af CpG’er i disse regioner menes at føre til transkriptionel silencing af deres nedstrøms gener [10]. Nylige undersøgelser har vist, at methylering er en grund til den lave ekspression af MIR-124 i livmoderhalskræft [9], akut lymfoblastisk leukæmi [5], hepatocellulært carcinom [6], og pancreascancer [7]. Imidlertid Raynal et al. [11] rapporterede, at DNA-methylering ikke stabilt blokere genekspression eftersom histondeacetylaseinhibitorer kan genaktivere genekspression uden at påvirke status for methylering [11]. Men mønstrene for methylering kan tjene som epigenetiske markører for langvarig opretholdelse af gendæmpning [11]. På grund af sin specificitet og stabilitet i humane prøver, kan DNA-methylering profiler være som en nyttig biomarkør i cancer screening [12, 13]. I overensstemmelse med dette begreb, de seneste undersøgelser har vist, at afvigende DNA methylering af miR-124 varianter giver en værdifuld biomarkør for livmoderhalskræft [9], blærekræft [14] og klar celle renalcellecarcinom [15].

Prostatakræft (PCA) er den mest almindelige malignitet blandt ældre mænd i den udviklede verden med stigende rater i udviklingslandene [16]. Androgen receptor (AR) signalvejen er meget vigtigt i prostatacancer [17], som regulerer mange andre gener involveret i tumorudvikling eller tumor suppression [18]. Desuden er det blevet vist, at AR er korreleret med status for methylering af specifikke microRNA i PCA-celler [19]. Men mekanismerne bag regulering og methylering af miR-124 er stadig uklart.

Den foreliggende undersøgelse har til formål at studere reguleringen mekanisme miR-124, status methylering af miR-124 og den anti-tumor-funktion af miR-124 i PCA celler. Resultaterne af vores eksperiment afslørede, at AR signalering fremmes ekspression af miR124, mens miR124 undertrykt AR ekspression. Der var en negativ feedback loop mellem miR124 og AR udtryk. Desuden viste DNA methyleringsanalyse at høj methylering af miR124-2 og MIR-124-3 forekom i AR-negative PCA-celler, hvilket antyder, at denne fænotype kunne anvendes som biomarkør for AR-negative PCA-celler. Desuden overekspression af miR-124 udviste anti-tumor aktivitet

in vitro

in vivo

, hvilket tyder på en potentiel terapeutisk værdi af miR-124 til behandling af PSA.

Materialer og metoder

Prostatakræft cellekulturer og dihydrotestosteron behandling

LNCaP, 22Rv1, DU145 og PC-3 cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA ). C4-2 celler, et delområde af LNCaP celler, blev opnået fra UroCore (Oklahoma City, OK, USA). PC3 /AR-celler er de PC3-celler, der stabilt overudtrykker vildtype-AR genet [20]; PC3 /neo-celler er en kontrol cellelinie. Celler blev opretholdt i overensstemmelse med producentens og udbydernes protokoller. For dihydrotestosteron (DHT, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) behandling, mediet indeholdende 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, UT, USA) blev erstattet med 10% trækul-strippet bovint kalveserum (Bioind , Israel), når LNCaP-celler var 60% -70% konfluente, og dernæst 0, 5 og 10 nM DHT blev tilsat henholdsvis og celler blev yderligere dyrket i 12 timer.

Plasmider, lentiviral produktion og infektion

En 21mer sekvens (5-GGTGTCACTATGGAGCTCTCA-3) blev designet til at generere den lentivirale vektor af AR korte hårnål RNA (shRNA) [21], og vektorkonstruktionen, blev lentiviral produktion og infektion udført ifølge tidligere beskrivelse [19] . Den lentivirale pLenti-CMV-MIR-124 vektoren blev konstrueret til stabilt overudtrykker modne sekvens af MIR-124. Vektoren af ​​pLenti CMV /TO Puro tom (Addgene plasmid # 17.482 [22]) blev købt fra Addgene. Det genomiske segment af MIR-124 -2 sekvenser blev amplificeret under anvendelse af primere MIR-124-2-F: CCTGGATCCGCTGTAAATGGCATGGAGATAT og MIR-124-2-R: GCGTCTAGAGCGGCTGTAATGGAAAAGTAG; og subklonet ind BamH1 og Xbal-stederne i pLenti CMV /i Puro tom vektor [23]. Lentivirus produktion og transduktion blev udført i henhold til en tidligere metode [23].

Real-Time PCR

Totale RNA’er blev udvundet ved hjælp af RNeasy Plus Mini (Qiagen, Valencia, CA, USA) fra forskellige PCA celler. Revers transkription blev udført under anvendelse af PrimeScript RT reagenskittet (Takara, Dalian, Kina) og TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Relative mængder af miR-124 (ved hjælp af TaqMan microRNA Analyser, Applied Biosystems) og AR (ved hjælp af SYBR Green Realtime PCR Master Mix, TOYOBO, Osaka, Japan) blev udført med en 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems). Genekspression blev normaliseret ved den endogene kontrol RNU44 (MIR-124) eller β-actin (AR). Ct-værdier blev beregnet under anvendelse af ΔΔCt metoden. Følgende primere blev anvendt: AR fremad CCAGGGACCATGTTTTGCC, omvendt CGAAGACGACAAGATGGACAA; β-actin frem CATGTACGTTGCTATCCAGGC, omvendt CTCCTTAATGTCACGCACGAT.

Natriumbisulfit modifikation og sekventering

Status methylering af hver miR-124 varianter blev bestemt ved Bisulfite-sekventering PCR (BSP) efter bisulfit konvertering af celler under anvendelse af EZ DNA-methylering-direct kit (Zymo Research Corporation, Irvine, CA, USA) ifølge standardprotokoller. BSP Primere blev konstrueret under anvendelse af Methyl Primer Express v1.0 software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) (tabel 1). PCR produkterne blev ligeret ind i pMD19-T Simple Vector (Takara Biotechnology Co., Ltd., Dalian, Kina). Kolonier (n = 10) blev udvalgt pr PCa cellelinje og sekventeret ved Shanghai Shenggong Biotech (Shanghai, Kina).

Cell proliferationsassays

Cell proliferation blev målt ved hjælp af en celletælling kit (CCK-8; Dojindo, Kumamoto, Japan) assay. Celler blev udpladet i 96-brønds plader med 5.000 celler per brønd og undersøgt ved 48, 72, 96 timer efter udpladning (n = 12). CCK-8 (10 pi) blev tilsat til hver brønd, og cellerne blev inkuberet i yderligere 2 timer. Absorbansen blev målt med en mikropladelæser (BioTek, USA) ved bølgelængder på 450 nm.

Migration assays

Costar Transwell Migration Plader med 8 um porestørrelse (# 3422, Corning, USA) var anvendes. Det øvre kammer blev podet med 1 x 10

5 celler i serumfrie medier og 20% ​​FBS blev anvendt som lokkemiddel i det nedre kammer. Efter 24 timers dyrkning blev kultur inserts fjernes og vaskes med phosphatbuffer saltvand (PBS) flere gange for at slippe af ikke-bundne celler. Alle de resterende celler på oversiden blev skrabet med en vatpind. Migrerede celler på den nedre side af indsatsen blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 15 minutter, vasket med PBS to gange, og farvet med 0,1% krystalviolet i 10 minutter. For hver indsats blev 5 tilfældigt udvalgte områder af filteret talt under et lysmikroskop. Hver af eksperimentet blev gentaget tre gange.

In vivo

xenograft assays

Seks uger gamle BALB /C nøgne mus (SLAC, Shanghai, Kina) blev tilfældigt inddelt og subkutant injiceret med 4x 10

6 LNCaP-kontrol eller LNCaP-MIR-124-celler blandet med et tilsvarende volumen matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, USA). Hver gruppe havde mindst fem mus. Tumorer blev målt med en passer hver 10 dage fra 2 uger efter inokulering, og volumenet blev beregnet som π /6 x længde x bredde

2. Xenotransplantattumorer blev udskåret og vejet ved aflivning på 34 dag efter tumorcelle-injektion. Alle mus eksperimenter blev godkendt af Renji hospitalet Dyrepleje og brug udvalg.

Statistisk analyse

Data blev analyseret ved hjælp af SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Ill., USA), og Prism GraphPad 5 (GraphPad Software, La Jolla, Californien., USA). Statistisk analyse blev udført under anvendelse af t-test. Data er præsenteret som den middel ± SEM fra mindst tre uafhængige forsøg. Sandsynlighedsværdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante.

Resultater

En negativ feedback loop mellem miR-124 og AR udtryk

For at afgøre om AR regulerer ekspressionen af ​​miR-124 i PCA cellelinjer, AR overekspression og Ar knockdown eksperimenter blev udført i PC3-celler (vs. PC3 /AR) og LNCaP-celler (vs. LNCaP-sh-AR), hhv. Som vist i fig. 1, mens overekspression af AR i PC3-celler forøgede ekspressionsniveau af MIR-124 (fig. 1A), knockdown af AR i LNCaP-celler reducerede ekspressionsniveauet af MIR-124 (fig. 1B). Derudover undersøgte vi, om miR-124 er en androgen lydhør microRNA. LNCaP-celler, androgen-responsive PCA-celler, blev udpladet i androgen-frit medium og behandlet med DHT til 0 nM, 1 nM og 10 nM. Efter 12 time blev RNA’er ekstraheret og real time PCR blev analyseret. Disse forsøg viste en stigning til ekspressionen beløber niveauer af MIR-124-genet i LNCaP-celler behandlet med DHT (10 nM) behandling (fig. 1C). Ovenfor resultater antyder, at AR nøje er positivt korreleret med ekspressionen af ​​MIR-124. Det er imidlertid ikke klart, om der findes et feedback-påvirkning mellem MIR-124 og AR. For at undersøge denne mulighed blev LNCaP-celler inficeret med en kontrol lentivirus (LNCaP-kontrolceller) eller pLenti-CMV-mir-124 lentivirus (LNCaP-MIR-124-celler), der udtrykker høje niveauer af MIR-124 (fig. 1D). Ekspressionsniveauet af AR blev derefter analyseret ved QRT-PCR. Som vist i fig. 1E, overekspression af MIR-124 signifikant inhiberede AR mRNA-niveau, hvilket er i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse rapporterer, at behandling med MIR-124 resulterede i en reduktion af AR-protein i LNCaP-celler [8]. Tilsammen disse resultater foreslog en negativ feedback loop mellem miR-124 og AR udtryk (figur 1F.)

(A) PC3 /AR-celler er en stabil cellelinie overudtrykker human AR cDNA.; PC3 /neo celler anvendes som kontrol. (B) LNCaP-sh-AR celler er AR-knockdown-celler, i hvilke LNCaP-celler blev inficeret med lentivious AR shRNA; LNCaP-sh-kontrol celler anvendes som en kontrol. (C) 0 nM, 1 nM og 10 nM DHT blev tilsat til LNCaP-celler og dyrkes i 12 time. (D) LNCaP-celler blev inficeret med en kontrol lentivirus (LNCaP-kontrolceller) eller pLenti-CMV-mir-124 lentivirus (LNCaP-MIR-124 celler). Relativ ekspression af MIR-124 i LNCaP-celler blev bestemt ved QRT-PCR og korrigeret til RUN44 niveauer. Værdier betyder fold-ændringer normaliseret til (A) PC3 /neo celler; (B) LNCaP-sh-AR celle; (C) LNCaP-celler (0 nM DHT) og (D) LNCaP-kontrolceller. (E) Relativ ekspression af AR blev bestemt ved QRT-PCR og normaliseret til p-actin niveauer. Værdier betyder fold-ændringer normaliseret til LNCaP-kontrol celler. (F) En skematisk diagram af vejen beskrevet i undersøgelsen. Data er vist som den middel ± SEM fra 3 uafhængige forsøg, som hver blev udført in triplo

Methyleringsanalyse af MIR-124 i PCA-celler Salg

Den modne MIR-124 indeholder 3 præmature varianter: MIR-124-1, MIR-124-2 og MIR-124-3 (20q13.33). Bisulfit sekventering PCR (BSP) og gen-sekventering blev udført for at analysere DNA methylering niveauer af hver af MIR-124 varianter. Disse analyser viste, at methylering aktiviteter miR-124-2 og miR-124-3 var højere i AR-negative PCA-celler (85% -96%, 80% -88%, henholdsvis) end i AR-positive PCA-celler (0 % -50%, 1% -3%, henholdsvis) (figur 2).. I begge AR-negative og AR-positive PCA-celler, blev promotorområdet af MIR-124-1 methyleret kun i begrænset grad (2% -38%, fig. 2). Desuden MIR-124-1 methylering var ikke signifikant højere end AR-positive celler ved AR-negative PCA celler (DU145, PC3) undtagen det DU145 celler, hvor methylering var signifikant højere end AR-positive celler (22RV1, C4 -2 og LNCaP; p. 0,05)

Skematisk oversigt over CpG steder i miR-124-1, miR-124-2 og miR-124-3 promotorregioner. (A) Methylering Analysen blev udført i 10 kloner fra hver cellelinie. Hver række af cirkler repræsenterer en enkelt klon, og hver cirkel repræsenterer en enkelt DNA methyleret eller demethyleret site. (B) De methylering procentdele af 10 kloner fra hver af cellelinierne er opsummeret i søjlediagrammet. Data er vist som den middel ± SEM. Stjerner angiver P 0,05, dobbelt stjerner angiver P. 0,001

MIR-124 overekspression undertrykker LNCaP celler spredning, migration og xenotransplantattumorer vækst

Tidligere undersøgelser viser, at miR-124 skuespil en rolle som en tumor suppressor [5-9], så vi ønskede at investigator om overekspression af miR-124 kunne hæmme PCa celler proliferation. For at besvare dette spørgsmål blev LNCaP-kontrolceller og LNCaP-MIR-124 celler udpladet i plader med 96 brønde og undersøgt ved 48, 72, 96 timer efter den indledende udpladning (n = 12). Celleproliferation blev målt ved absorbansen (optisk densitet, OD) på 450 nm bølgelængder. Vores resultater viste, at overekspression af MIR-124 signifikant hæmmet LNCaP celleproliferation ved 48, 72 og 96 timer, (fig. 3A).

(A) LNCaP-kontrolceller og LNCaP-MIR-124-celler var udpladet i 96 brønde og undersøgt ved 48, 72 96 timer med CCK8 assay. Celleproliferation blev analyseret ved værdien af ​​OD. Data er vist som den middel ± SEM (n = 12). Gruppere data (B) og repræsentative billeder (C, D) er vist. (B) Antal migrerende celler pr området LNCaP-kontrol celler og LNCaP-miR-124 celler. Repræsentative fotomikrografier illustrerer migrationen af ​​LNCaP-kontrolceller (C) og LNCaP-MIR-124-celler (D). Fem nøgne mus pr gruppe blev injiceret subkutant med 4×10

6 LNCaP-kontrolceller eller LNCaP-MIR-124 celler. (E) Mængden af ​​xenotransplantattumorer blev målt hver 10 dage fra 2 uger efter inokulering. (F) Tumorvægte blev målt på tidspunktet for aflivning på 34 dag efter tumorcelle-injektion. (G) tumorer blev skåret på tidspunktet for aflivning på 34 dag efter tumorcelleinjektion. Data er præsenteret som middelværdi ± SEM. Stjerner angiver P 0,05, dobbelt stjerner angiver P. 0,001

Desuden er vi afgøre, om overekspression af miR-124 undertrykker PCa celle migration, Transwell kamre blev anvendt til at evaluere vandrende effekt af LNCaP- kontrolceller og LNCaP-mIR-124 celler. Transwell assays viste, at overekspression af MIR-124 undertrykte signifikant migrering af LNCaP-celler (fig. 3B, C, D). Den iagttagelse, at miR-124 hæmmer LNCaP celler proliferation og migration fik os til at bestemme, om miR-124 overekspression kan hæmme xenograft tumorvækst i LNCaP celler

in vivo

. For at besvare dette spørgsmål, blev mandlige nøgne mus podet subkutant med LNCaP-kontrol celler eller LNCaP-miR-124 celler. Vi fandt, at begge grupper af mus viste palpable xenotransplantattumorer den 14. dag efter inokulering. Men størrelsen af ​​tumorer var signifikant mindre i LNCaP-MIR-124 xenotransplantater sammenlignet med LNCaP-kontrol xenotransplantater efter 24 dage (fig. 3E, G). Desuden fandt vi, at vægten af ​​tumorer var signifikant lysere i LNCaP-MIR-124 xenotransplantater sammenlignet med LNCaP-kontrol xenotransplantater på tidspunktet for aflivning på 34 dage (fig. 3F, G). Kollektivt, overekspression af miR-124 ikke kun hæmmede LNCaP celleproliferation og migration

in vitro

men også betydeligt undertrykte væksten af ​​xenotransplantattumorer

in vivo

.

Diskussion

i den foreliggende undersøgelse har vi præsenteret dokumentation for, at miR-124 er en androgen /AR responsive gen og overekspression af miR-124 hæmmer AR udtryk og undertrykker PCa celler proliferation, migration og xenograft tumorvækst. Disse resultater tyder på en negativ feedback loop mellem AR og miR-124 udtryk, og miR-124 kan være et lovende terapeutisk mål for PSA.

Androgen /AR-signalering er meget afgørende i opståen og udvikling af prostata carcinogenese [ ,,,0],24, 25]. Ikke kun steroid hormoner, men også ikke-steroide forbindelser kunne aktivere AR signalering [26]. Desuden, i “hormon-refraktær prostatacancer”, AR signalering kan aktiveres alle de samme [27]. Kort sagt i androgen /AR-signalering, AR spiller en større rolle end androgen. Derfor det første vi udførte AR overekspression og Knockdown eksperimenter for at undersøge, om AR signalering kunne påvirke ekspressionen af ​​miR-124. Vi fandt, at ekspressionen af ​​miR-124 var positivt korreleret til AR. For det andet er behandlingen af ​​LNCaP-celler med DHT inducerede en forøget ekspression af MIR-124. Derfor AR positivt regulerer ekspressionen af ​​miR-124. Det bemærkes, at vores resultater ikke er i overensstemmelse med en tidligere rapport, hvor androgen analog R1881 blev brugt og ikke regulere [8] miR-124. En forklaring på denne forskel kan skyldes de forskellige undersøgelsesmetoder. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at afklare de inkonsistente resultater.

Den negative feedback loop, som vi observeret mellem miR-124 og AR udtryk kan spille en rolle i udviklingen af ​​kastrationsresistent PCa (CRPC). Som vi ved, androgen deprivation terapi, der fjerner cirkulerende androgener eller blokerer AR er en standard for pleje behandling for prostatakræft behandling. Trods en indledende effektiv respons på behandlingen, næsten alle patienter uundgåeligt udvikle sig til CRPC. Selv om der har været en masse forskning udført, mekanismen er stadig uklart. Vores resultater viste androgen /AR signalering kan have en positiv indflydelse på ekspressionen af ​​MIR-124, men sidstnævnte inhiberer ekspressionen af ​​førstnævnte. Vi spekulere, at i normal prostata celle, AR og MIR-124 udtryk er på en balance som foreslået for det, der forekommer mellem proto-onkogener og tumor suppressorer [28]. Hvis AR signalering er aktiveret, vil ekspressionen af ​​nedstrøms MIR-124 være høj, og omvendt inhiberer AR-signalering. Men den balance forstyrret i PCa, dvs. AR signalering kan forbedres yderligere, når ekspressionen af ​​miR-124 er lav [8].

Da methylering spiller en rolle i reguleringen af ​​gen ekspression, har den foreliggende undersøgelse undersøgte, om ekspressionen af ​​mIR-124 var forbundet med dens status for methylering. Modne sekvens af MIR-124 har tre prækursor varianter, mir-124-1, MIR-124-2 og MIR-124-3, som alle blev analyseret for status for methylering i vores studier. Udover MIR-124-1, er promotorregionerne af MIR-124-2 og MIR-124-3 stærkt methyleret i AR-negative PCA celler end AR-positive PCA-celler (fig. 2). Når ekspression af MIR-124 er undersøgt i PCA-celler, er det ikke vist sammenhæng med status for methylering af PCA-celler (S1 Fig.). Denne discordancy kunne forklares ved en nylig ny teori antyder, at DNA-methylering ikke stabilt lukke genekspression men i stedet fungerer som en molekylær markør for en langvarig opretholdelse af gendæmpning [11]. På grund af DNA methylering repræsenterer en mere kemisk og biologisk stabil kilde til molekylær diagnostisk information end RNA eller de fleste proteiner [29], det har et stort potentiale til at være et nyttigt informativ biomarkør i kræftscreening [12, 13]. I denne henseende, vores resultater tyder på, at afvigende hypermethylering af miR-124-2 og miR-124-3 kan give en nyttig biomarkør for AR-negative PCA celler.

Det skal påpeges, selvom overekspression af miR- 124 kan hæmme PCa kræftfremkaldende proces

in vitro

in vivo

, har knockdown af miR-124 i LNCaP celler ikke ændre kræftfremkaldende status (data ikke vist). En forklaring kan være, at de modne sekvenser af MIR-124 har tre precursor varianter sekvenser, og det er vanskeligt at dybt nedregulere ekspressionen. Imidlertid er yderligere undersøgelser nødvendige for at afklare dette punkt.

Samlet set vores resultater giver ny indsigt i det regulerende mekanisme tumor suppressor miR-124 og anderledes methylering status miR-124 varianter kan anvendes som et potentielt anvendelig biomarkør for PCA celler.

Støtte Information

S1 fig. Ekspression af MIR-124 i PCA Cells.

Relativ udtryk for miR-124 i PCA-cellelinjer blev bestemt ved QRT-PCR og korrigeret til RUN44 niveauer. Værdier betyder fold-ændringer normaliseret til LNCaP celler. Data er vist som et middel ± fra 3 separate eksperimenter, som hver blev udført i tre eksemplarer

Doi:. 10.1371 /journal.pone.0116197.s001

(DOC)

Tak

undersøgelsen er støttet af midler til WQ Gao fra det kinesiske ministerium for videnskab og teknologi (2012CB966800; 2013CB945600 og 2012CB967900), National Natural Science Foundation of China (81.130.038 og 81.372.189), Videnskab og Teknologi Kommissionen for Shanghai kommune (Pujiang program), Shanghai Uddannelsesudvalget Key Disciplin og specielle Foundation (J50208), Key Disciplin og specielle Foundation of Shanghai Health Bureau og KC Wong fundament, og til M Chu fra Shanghai Postdoc Scientific program Kina (12R21415100).