PLoS ONE: MEK /ERK Pathway Fremmer HAK Signalering i kræft i bugspytkirtlen Cells

Abstrakt

Aktivering af hakket receptorer afhængig af deres intracellulære proteolyse af gamma-sekretasekomplekset. Denne spaltning frigiver den NOTCH intracellulære domæne (NIC) derved tillader translokation af NIC mod kernen til at samle sig til en transkriptionel platform. Lidt oplysninger om de lovgivningsmæssige skridt opererer på NIC følgende sin frigivelse fra transmembrane receptor op til sit samarbejde med transkriptionelle partnere. Forstyrrende med disse regulerende trin kunne potentielt påvirker den nukleare resultat af HAK signalering. Heri, vi udnyttet en pålidelig model til at studere de molekylære begivenheder efter NOTCH1 spaltning. I bugspytkirtelkræftceller, puls NOTCH1 aktivering førte til øget ekspression af notch målgener nemlig HES1 og c-myc. Vi afslørede, at efter dets frigivelse, den NOTCH1 intracellulære domæne, Nic1, undergår en række post-translationelle modifikationer, der omfatter phosphorylering. Mest interessant, fandt vi, at aktivering af MEK /ERK-vejen fremmer HES1 udtryk. Inhibering af y-sekretasekomplekset forhindrede MEK /ERK-induceret HES1 ekspression antyder en NOTCH-afhængig mekanisme. Endelig højere niveauer af Nic1 blev fundet associeret med sine transkriptionelle partnere [CBF1, Su (H) og LAG-1] (CSL) og MASTERMIND-LIKE 1 (MAML1) upon MEK /ERK-aktivering tilvejebringer en potentiel mekanisme hvorved MEK /ERK pathway fremmer ekspression af NOTCH målgener. For første gang, vores data udsat en signalvej, nemlig MEK /ERK vej, der positivt indvirkning på HAK nukleare resultat.

Henvisning: Tremblay I, Paré E, Arsenault D, Douziech M, Boucher M-J (2013) MEK /ERK Pathway Fremmer HAK Signalering i bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 8 (12): e85502. doi: 10,1371 /journal.pone.0085502

Redaktør: Irina V Lebedeva, Columbia University, USA

Modtaget: August 30, 2013; Accepteret: November 27, 2013; Udgivet: December 31, 2013

Copyright: © 2013 Tremblay et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra de canadiske Institutes for Health Research (IC1-102949 og MOP-106.456 til MJB). MJB er en lærd fra Fonds de Recherche Santé Québec (FRQ-S) og medlem af FRQ-S-finansierede Centre de Recherche Clinique Étienne-Le Bel. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hakket receptorer iscenesætte en række udviklingsprocesser udover at sikre voksent væv homeostase [1,2]. Dette stærkt konserverede signalvej har en relativt simpel molekylær arkitektur. Ved ligandbinding, de transmembrane HAK receptorer (hak 1-4) underkastes sekventielle spaltninger af Adam-metalloproteaser og gamma-sekretasekomplekset. Sidstnævnte, blokeret af gamma-sekretase hæmmere, frigiver HAK intracellulære domæne (NIC), der er gratis at translokere mod kernen til at samarbejde med det DNA-bindende protein [CBF1, Su (H) og LAG-1] (CSL) og co-aktivator MasterMind-LIKE 1 (MAML1) til at modulere genekspression. De bedst karakteriserede målgener af HAK vej er helt sikkert medlemmer af HAIRY forstærker af SPLIT (HES) familie, selv regulatorer af transskription [1-3]. En distinkt egenskab ved NOTCH signalvejen er således den dobbelte rolle af receptoren, dvs. føling af signalet og opnå svaret. Der vides kun lidt om de lovgivningsmæssige skridt opererer på NIC efter frigivelse fra transmembrane receptor til sin transkriptionel handling. Men den nukleare resultat af NOTCH signalering, mest sandsynligt, tæt kontrolleret for at sikre den præcise regulering af signalstyrken og varighed. Yderligere undersøgelser er således et klart behov for at optrævle de mekanismer, som det spaltede receptor koordinerer genekspression. Desuden bør identificere potentielle modulator af HAK signalering forbedre vores forståelse af denne tilsyneladende forsimplede vej.

Aberrant HAK signalering viste sig at spille en vigtig rolle i blodkræftsygdomme [4] og nogle solide tumorer [2], såsom pancreas duktalt adenokarcinom (PDA). Faktisk er reaktivering af NOTCH signalering observeret tidligt i PDA patogenese og vedvarer hele sygdommens progression [5-8]. Exome sekventering af humant PDA væv billede yderligere støtte af en kritisk rolle for NOTCH signalering i pancreas carcinogenese [9]. Interessant blokade af NOTCH signalering med y-sekretase hæmmer forhindrede progression af præmaligne læsioner i bugspytkirtlen til PDA i en musemodel for KRAS-induceret PDA [10,11]. Bemærkelsesværdigt, KRAS nedstrøms signalering spiller afgørende rolle i pancreas carcinogenese som onkogen mutation i KRAS findes i 95% af PDA [9,12]. Desuden reducerede HAK signalering i humane bugspytkirtelkræft cellelinjer korrelerede med reducerede spredning, øget apoptose, nedsat forankringsuafhængig vækst og nedsat invasion egenskaber [11,13-16]. Denne sammenhæng mellem hak og RAS-signalering er ikke enestående for bugspytkirtelkræftceller. Faktisk blev RAS og HAK signalering vist sig at samarbejde om at fremme carcinogenese i brystkræftceller, melanom og leukæmi [17-19]. Globalt målrettet HAK signalering vises en attraktiv ny terapeutisk strategi især for PDA patienter [20]. Men en bedre forståelse af reaktionsvejen er kritisk for at udvikle effektive hak hæmmere og /eller antagonister, eftersom gamma-sekretase-inhibitorer, være nyttig, ikke hak specifik og ukritisk grad hele signalveje reguleret af y-sekretase kompleks udover anstiftelse gastrointestinal toksicitet [21-23].

I denne undersøgelse, vi udnyttet en pålidelig model til at studere de molekylære begivenheder efter spaltning af transmembrane NOTCH1 receptoren op til den nukleare lokalisering af spaltede NOTCH1 fragment (Nic1). Vi afsløret, at efter dens udgivelse, Nic1 undergår hierarkisk fosforylering i bugspytkirtelkræftceller som korrelerer med udtryk for HAK target gener såsom HES1. Mest interessant, fandt vi, at aktivering af MEK /ERK-vejen fremmer HES1 udtryk gennem notch-afhængige mekanismer.

Materialer og metoder

Cell Kultur og NOTCH Aktivering Procedure

HEK293T og de menneskelige bugspytkirtelkræft cellelinjer MIA Paca-2 og BxPC-3 blev opnået fra ATCC og dyrket som tidligere beskrevet [24].

For at fremkalde en puls af HAK aktivering, vi tilføjet ethylenglycol-bis (2-aminoethylether) –

N, N, N

‘,

N’

tetraeddikesyre (EGTA) (4 mM) i 15 minutter til eksponentielt voksende MIA PaCa-2-celler. EGTA blev derefter fjernet ved at erstatte medierne med frisk normal dyrkningsmedium (DMEM).

Antistoffer og reagenser

Det specifikke antistof, der genkender kun den spaltede NOTCH1 (D3B8) (Nic1) blev opnået fra celle signalering. Antistoffer mod dobbelt phosphoryleret (aktiv) ERK1 /2 (pErk1 /2), blev CSL, MAML1 og GAPDH købt hos Cell Signaling. HES1 antistof var fra Abcam. Antistof til påvisning af total ERK1 /2 var fra Santa Cruz. MYC og HA-antistoffer blev opnået fra Roche. Gamma-sekretase hæmmer N- [N- (3,5-Difluorophenacetyl-L-alanyl)] – S-phenylglycin

t

-butylester (DAPT) og MEK1 /2-inhibitoren U0126 blev indkøbt fra Calbiochem . Alle andre materialer var fra Sigma, medmindre andet er angivet.

Western Blot

Som tidligere offentliggjort [24], celler blev lyseret i Triton-buffer (1% Triton X-100, 50 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,2 mM orthovanadat, 40 mM β-glycerophosphat, 50 mM natriumfluorid, 10% glycerol, 1 mM PMSF, 0,5 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin og 0,5 ug /ml aprotinin) og renset for cellerester ved centrifugering. Lige så stor mængde af proteiner blev separeret ved SDS-PAGE (polyacrylamidgelelektroforese) og proteiner blev påvist immunologisk efter elektrotransfer på nitrocellulosemembraner. Salg

Forbigående transfektioner

Eksperimenter blev udført som tidligere [24-26] beskrevet. Kort fortalt blev HEK293T celler transficeret med Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens anbefalinger. Den vektor, der koder en MYC-mærket version af det cytoplasmatiske domæne af muse

notch1

(pLIA-Nic1) blev opnået fra Addgene (plasmid 15131). HA-mærkede vildtype-MEK1 (MEK1 WT) og konstitutivt aktiv mutant af MEK1 (MEK1 CA) -kodende cDNA’er blev venligst stillet til rådighed af N. Rivard (Université de Sherbrooke, Canada) og blev tidligere beskrevet [27]. Cellerne blev lyseret fireogtyve timer efter transfektion og forberedt til western blot.

Immunoprecipitation, fosfatase og Kinaseassays

Immunopræcipitationer blev hovedsagelig udført som beskrevet tidligere [25,26]. Kort beskrevet blev cellerne vasket to gange med iskold PBS, lyseret i Triton-buffer og renset for cellerester ved centrifugering. Primært antistof blev tilsat til 2 mg ryddede cellelysater og inkuberet i 3 timer ved 4 ° C under omrøring. Endogen Nic1 blev immunpræcipiteret under anvendelse af anti-spaltet NOTCH1 (Nic1) antistof, mens det anti-myc antistoffet blev anvendt til at immunoprecipate den overudtrykte Nic1 (MYC-mærkede). Protein G-sepharose (GE Healthcare) blev efterfølgende tilsat i 1 time ved 4 ° C under omrøring. Immunkomplekser blev vasket tre gange med iskold Triton buffer. Derefter immunkomplekser blev enten demonteres ved tilsætning af 4X Laemmli prøvebuffer (1X = 62,5 mM Tris-HCI pH 6,8, 2,3% SDS, 10% glycerol, 1 mM PMSF, 0,005% bromphenolblåt og 5% β-mercaptoethanol) eller anvendes til phosphatase og kinaseassays.

For phosphatase analyser, immunkomplekser blev yderligere vasket to gange med 1X NEBbuffer pack til Protein MetalloPhosphatase (New England Biolabs Inc.) suppleret med 1 mM MnCl

2 og 1 mM PMSF, 0,5 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin og 0,5 ug /ml aprotinin. Perlerne blev derefter ligeligt opdelt i to Eppendorf-rør. 400 enheder lambda proteinphosphatase (New England Biolabs Inc.) blev tilsat til en af ​​dem og begge rør blev inkuberet i 30 min ved 30 ° C. Reaktionen blev stoppet ved tilsætning 4X Laemmli prøvebuffer.

I kinase assays, Triton-vaskede immunkomplekser blev yderligere vasket to gange med ERK1 reaktionspuffer (25 mM Tris pH 7,5, 0,02 mM EGTA, 0,2 mM orthovanadat, 1 mM PMSF, 0,5 ug /ml leupeptin, 1 ug /ml pepstatin og 0,5 ug /ml aprotinin). Perlerne blev derefter ligeligt opdelt i to Eppendorf-rør og inkuberet 30 min ved 30 ° C i ERK1 reaktionsbuffer suppleret med 10 mM magnesiumacetat, 0,1 mM ATP og 2μCi [γ-

32P] ATP indeholder eller ikke 0,1 pg af aktiv ERK1 ( Millipore). Reaktionen blev stoppet ved tilsætning 4X Laemmli prøvebuffer. Radiomærket Nic1 blev separeret ved SDS-PAGE og bearbejdet til autoradiografi.

Data Presentation

Alle eksperimenter blev udført i mindst tre uafhængige forsøg. Typiske Western blots er vist. Densitometriske analyser blev udført ved hjælp af billede J 1,42 software.

Resultater

Calcium chelation aktiverer NOTCH1 receptor

Til rettidig undersøgelse NOTCH1 aktivering, vi udnyttet en model, der tillader den synkrone aktivering af NOTCH1 receptoren. På grund af arten af ​​indhakket receptorer, som er sammensat af to underenheder holdes sammen ikke-kovalent ved calcium-afhængige interaktioner [1,2], blev det tidligere påvist, at calcium depletion dissocierer og aktiverer hak receptorer [28]. Denne strategi blev bevist en pålidelig metode til HAK aktivering [29-34]. Derfor vi fortsatte med at en puls af NOTCH aktivering ved at udsætte bugspytkirtelkræft NOTCH1-udtrykkende celler til calciumchelator EGTA. Som forventet, en 15 minutters puls af EGTA resulterede i receptor-spaltning [28,31] fører til forøget ekspression af det spaltede fragment Nic1 (figur 1A). Efter EGTA eksponering, blev mediet fjernet, og cellerne blev returneret i forskellige tidsrum (dvs. 30 til 240 minutter) til deres normale dyrket tilstand, som indeholdt calcium. Øget protein ekspressionsniveauer af Nic1 målgener HES1 og c-myc blev observeret, selv med lidt anderledes temporal profil (figur 1A). Denne observation er i overensstemmelse med en nylig undersøgelse viser tydelige RNA profiler af notch responsive gener; medlemmer af

E

(

spl

) familie gener (

Drosophila

homologer af det menneskelige

HES

familie) er enestående i hurtigheden af ​​deres respons på NOTCH aktivering [30].

A. MIA PaCa-2-celler blev efterladt ubehandlet (-) eller behandlet med EGTA (4 mM) i 15 minutter (+). EGTA medium blev fjernet og erstattet af normal dyrkningsmedier (Ca

2+) for de angivne perioder. B. MIA PaCa-2-celler blev forbehandlet (+) eller ikke (-) med DAPT (25 pM) i 30 min. Celler blev derefter udsat for EGTA (4 mM) i 15 minutter (+). EGTA-holdige medium fjernet og erstattet med normal dyrkningsmedier (Ca

2+) indeholdende DMSO (-) eller DAPT (25 pM) i 90 min. C. MIA PaCa-2-celler blev efterladt ubehandlet (-) eller behandlet med EGTA (4 mM) i 15 minutter (+). EGTA medium blev fjernet og erstattet af normal dyrkningsmedier (Ca

2+), der indeholder DMSO eller actinomycin D (1 pg /ml) for de angivne perioder. Western blot-analyser blev udført under anvendelse af de egnede antistoffer.

For at understøtte Notch-afhængige mekanismer involveret i EGTA-induceret HES1 udtryk, vi pre-behandlet cellerne med gamma-sekretase hæmmer DAPT, kendt for at blokere HAK spaltning. Forbehandling af cellerne med DAPT forhindrede EGTA-induceret Nic1, HES1 og c-myc protein udtryk (figur 1B og data ikke vist), der understøtter, at EGTA påvirkninger HES1 udtryk gennem aktivering af hakket receptorer. Også tilsætning af transskriptionsinhibitor actinomycin D efter EGTA eksponering ikke signifikant indflydelse på EGTA-inducerede Nic1 ekspression men forhindrede ekspression af HES1 og c-MYC (figur 1C og data ikke vist). Tilsammen vores data er i overensstemmelse med hvad der tidligere er vist i andre cellelinier [29-34] Dvs. forbigående eksponering for EGTA fører til NOTCH1 aktivering ved frigivelse af intracellulære domæne Nic1, gør det muligt at translokere mod kernen til at modulere gentransskription . Subcellulær fraktionering bekræftede, at Nic1 overvejende findes i kernen efter EGTA eksponering (figur S1).

Nic1 phosphoryleres i bugspytkirtelkræftceller

Interessant, vi har registreret forskellige molekylvægt former for Nic1 efter en puls af NOTCH1 aktivering af EGTA med overvejende højmolekylære former gradvist observeret over tid (figur 1A ). Bemærkelsesværdige, 240 minutter efter EGTA eksponering, Nic1 udtryk vendte tilbage til niveauer sammenlignelige med ubehandlede celler tyder på en hurtig omsætning af Nic1 efter sin transkriptionel handling. Derfor HES1, en kortvarig protein [3], blev kun udtrykt forbigående, toppede på 90-120 minutter efter EGTA eksponering og returnering om kontrolniveauer efter 240 minutter.

For at forklare de forskellige molekylvægt profil Nic1, vi testede, om Nic1 gennemgår post-translationelle modifikationer efter frigivelse fra transmembrane receptor. Mere specifikt analyserede vi phosphoryleringsniveauerne af Nic1 i bugspytkirtelkræftceller nemlig MIA Paca-2 og BxPC-3. Disse cellelinier vise basal aktivering af NOTCH1 receptoren som angivet ved ekspression af det spaltede NOTCH1 fragment Nic1 (figur 2). Bemærkelsesværdige, eksponentielt voksende MIA PaCa-2-celler vise lavere NOTCH1 aktivering sammenlignet med BxPC-3. Phosphatase assays viste, at Nic1 phosphoryleres i eksponentielt voksende MIA PaCa-2 og BxPC-3-celler (figur 2). Endvidere efterfølgende EGTA-induceret NOTCH1 aktivering i MIA PaCa-2, Nic1 blev overvejende fundet i en phosphoryleret tilstand (figur 2).

Nic1 blev immunpræcipiteret (IP Nic1) fra de samlede lysater af eksponentielt voksende MIA PaCa-2 (MIA), MIA PaCa-2 celler behandlet med EGTA (4mM) for 15 min og derefter vendte tilbage til deres normale substrater til dyrkning 90min, eller eksponentielt voksende BxPC-3 (Bx). Efter Nic1 immunopræcipitation blev phosphatase-assays udført (+) ved anvendelse af lambda phosphatase (λ phosphatase). IP Nic1 ikke inkuberes med lambda phosphatase er angivet som pNIC1. Et repræsentativt Western blot ved hjælp af et antistof mod Nic1 vises.

I vores bestræbelser på at identificere potentielle kinaser, som modulerer Nic1 fosforylering, vi fortsatte med at transiente transfektioner i HEK293T celler. Interessant observerede vi højere molekylvægt former af et eksogent Nic1 når celler blev co-transficeret med en konstitutiv aktiv form af MEK1 (MEK1 CA), som fører til ERK1 /2-aktivering (figur 3A). Phosphatase analyser fremlagt beviser, at Nic1 phosphoryleres, når den udtrykkes i HEK293T celler (figur 3B venstre, Nic1 + MEK1 WT). Imidlertid blev Nic1 phosphoryleringsniveauerne øget betydeligt, når MEK /ERK pathway blev aktiveret ved tilstedeværelsen af ​​en MEK1 CA (figur 3B højre). Tilsvarende Nic1 phosphoryleringstilstande blev påvist, når celler blev co-transficeret med et onkogent RAS (data ikke vist). Disse resultater antydede, at MEK /ERK-vejen kan påvirke phosphoryleringsniveauerne af Nic1. Den ERK1 /2 er velkendte for phosphorylere en række cytoplasmatiske og nukleare proteiner, herunder transkriptionelle regulatorer [35,36]. Derfor testede vi, om Nic1 kunne være et direkte mål for den ERK1 /2. Interessant nok en aktiv ERK1 var i stand til at phosphorylere Nic1 i

in vitro

kinaseassays (figur 3C). Tilsammen vores resultater antyder, at Nic1 phosphoryleres i bugspytkirtelkræftceller. Ifølge vores observation, at Nic1 phosphoryleringsbegivenheder stater steget over tid efter EGTA eksponering, mens faldende i udtryk, er det fristende at spekulere, at Nic1 kunne undergå hierarkiske phosphoryleringsbegivenheder efter frigivelse fra transmembrane receptor, som koordinerer Nic1 udtryk samt Nic1-afhængig transskription aktivering og dæmpning. Desuden deraf til vores resultater, den potentielle inddragelse af MEK /ERK vej i reguleringen af ​​Nic1 funktion fortjener helt sikkert yderligere opmærksomhed.

A. HEK293T blev transficeret med pLIA-Nic1 (MYC-mærkede) konstruere sammen med et cDNA kodende for et vildtype (WT) eller konstitutiv aktiv (CA) version af MEK1 (HA-mærkede). Cellerne blev lyseret 24 timer efter transfektion. Nic1 ekspression blev analyseret ved western blot med et anti-MYC-antistof. Ekspressionsniveauet af det eksogene MEK1 blev evalueret ved Western blot under anvendelse af et anti-HA-antistof. Dual-phosphorylerede og total ERK1 /2 ekspressionsniveauer blev vurderet ved anvendelse af specifikke antistoffer. Den MEK1 CA-induceret højere molekylvægt form af Nic1 er angivet med en asterisk *. B. HEK293T blev transficeret med pLIA-Nic1 konstruere sammen med et cDNA, der koder MEK1 WT eller MEK1 CA. Cellerne blev lyseret og Nic1 blev immunpræcipiteret (IP Nic1) anvendelse af et anti-MYC-antistof. Phosphatase-assays blev derefter udført (+) ved anvendelse af lambda phosphatase (λ phosphatase). De phosphorylerede former af Nic1 betegnes pNIC1. Den MEK1 CA-induceret højere molekylvægt form af Nic1 er angivet med en asterisk *. Nic1 ekspression blev analyseret ved western blot med et anti-MYC-antistof. C. Nic1 blev immunpræcipiteret (IP Nic1) fra pLIA-Nic1 transficeret HEK293T anvendelse af et anti-MYC-antistof. Kinase assays blev derefter udført som beskrevet i eksperimentelle fremgangsmåder. Den autoradiografi skildrer fosforyleret Nic1 (pNIC1) vises. Efter elektrotransfer af gelen, blev mængden af ​​Nic1 immunopræcipiteret bekræftet ved Western blot (WB) anvendelse af et anti-MYC-antistof.

Aktivering af MEK /ERK-vejen fremmer NOTCH signalering

Vi næste rettet om MEK /ERK pathway kunne påvirke NOTCH signalering især i vores bugspytkirtelkræft celle model MIA PaCa-2, som viser basal NOTCH1 aktivering /Nic1 ekspression men inducerbar NOTCH1 aktivering (se figur 1A). Bemærkelsesværdigt, ligesom de fleste bugspytkirtelkræftceller, MIA PaCa-2-celler huser en KRAS mutation fører til basal ERK1 /2-aktivering, hvor sidstnævnte er af afgørende betydning for MIA PaCa-2-celleproliferation og overlevelse [37]. At stærkt og bæredygtigt stimulere MEK /ERK-vejen, vi behandlede MIA PaCa-2 celler med phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA). Som vist i figur 4A, hurtigt tilsætning af PMA ført til vedvarende ERK1 /2-aktivering, hvilket korrelerede med øget HES1 og c-myc-protein-ekspressionsniveauer. At sikre, at virkningen var NOTCH-afhængig, vi pre-behandlede celler med DAPT at droppe Nic1 ekspression (figur 4A) og sandsynligvis inhibere spaltningen af ​​de andre hak receptorer. Forbehandling med DAPT betydeligt forhindrede PMA-induceret HES1 udtryk, mens effekten på c-myc var partiel (figur 4A). Dette kunne potentielt forklares ved, at selv om C-MYC er blevet identificeret som en NOTCH1 direkte målgen [38,39], er c-MYC også kendt at være reguleret direkte af ERK1 /2 [35,36]. Derfor kan det være muligt, at c-myc er reguleret af både hak og ERK-afhængige mekanismer i vores model. Bemærkelsesværdige, i vores model, DAPT helt ophævede PMA-induceret HES1 udtryk antyder, at PMA i høj grad fremmer HES1 udtryk gennem hak receptorer kontrasterende med tidligere undersøgelser tyder en MEK-afhængig HAK-uafhængig regulering af HES1 [40,41].

A. MIA PaCa-2-celler blev forbehandlet (+) eller ikke (-) med DAPT (25 pM) natten over. Cellerne blev derefter behandlet med PMA (100 nM) for de angivne perioder. B. MIA PaCa-2-celler blev efterladt ubehandlet (-) eller behandlet med EGTA (4 mM) i 15 minutter (+). EGTA medium blev fjernet og erstattet af normal dyrkningsmedier (Ca

2+), der indeholder DMSO, PMA (100 nM) eller PMA + U0126 (10 uM) for de angivne perioder. A. og B. Celler blev lyseret, og Western blot-analyser blev udført ved anvendelse af de viste antistoffer. C. Fra lignende forsøg præsenteret i B., en grafisk afbildning, der viser relativ HES1 udtryk, for hver tidsperiode, i behandlede celler (PMA, PMA + U0126) sammenlignet med kontrol celler (DMSO-behandlede) er vist. D. Fra lignende forsøg præsenteret i B., en grafisk afbildning, der viser relativ c-myc-ekspression, for hver tidsperiode, i behandlede celler (PMA, PMA + U0126) sammenlignet med kontrol celler (DMSO-behandlede) er vist. C. og D. Resultaterne er middelværdierne ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg. * P 0,05, ** p 0,005, *** p 0,0005 sammenlignet med den tilsvarende periode i DMSO-behandlede celler. # P 0,05, ## p 0,005, ### p 0,0005 sammenlignet med den tilsvarende periode i PMA-behandlede celler.

For at også undersøge indflydelsen af ​​ERK1 /2-aktivering efter en puls af NOTCH1 aktivering, tilføjede vi PMA i medierne efter vask ud EGTA. Tilsætning af PMA fremmet EGTA-induceret HES1 og c-myc-ekspression, en effekt, der blev ophævet ved tilstedeværelsen af ​​MEK-inhibitor U0126 (Figur 4B-D). Det er værd at nævne, at vi betegnede en forøgelse af ERK1 /2 phosphorylering, der faldt med tiden efter udskiftning af mediet af EGTA-behandlede celler med normal dyrkningsmedium (se kontrol (DMSO-behandlede) celler, figur 4B). Denne lille stigning kan udgøre en begrænsning af fremgangsmåden (der kræver fjernelse af EGTA) og måske kun være konsekvent i at erstatte det EGTA-holdige medier med friske dyrkningsmedier, ERK1 /2 phosphorylering bliver helt følsomme over medium forandring. Vi udelukkede en rolle for NOTCH signalering i modulering ERK1 /2-aktivitet, eftersom i) DAPT behandling forhindrede EGTA-induceret Nic1 ekspression (figur 1B) uden at påvirke ERK1 /2 phosphorylering (data ikke vist) og ii) inhibering af NOTCH signalering ved DAPT behandling ikke signifikant modulerer ERK1 /2 phosphorylering (figur 4A). Tilsammen vores resultater peger i retning af en positiv regulering af HAK-afhængig HES1 udtryk ved MEK /ERK-vejen.

Vi har etableret, at EGTA-induceret HES1 udtryk krævede transkriptionelle begivenheder (Figur 1C) støtte en model, hvor de frigivne Nic1 translokerer mod kernen til at påvirke (

HES1

) genekspression. Iboende til dette, sammenslutningen af ​​Nic1 med sin DNA-bindende partner CSL og co-aktivator MAML1 dermed danner en funktionel transkriptionel enhed, er helt sikkert en forudsætning for gen modulation [1,2]. Derfor, for at begynde at afgrænse de mekanismer, der tegner sig for den positive virkning af MEK /ERK-vejen på HAK signalering, undersøgte vi, om aktivering af MEK /ERK vej kunne fremme sammenslutningen af ​​Nic1 med enten CSL eller MAML1. I modsætning til Nic1 blev CSL og MAML1 ekspressionsniveauer ikke moduleret ved EGTA behandling (figur 5A). Derfor vi immunopræcipiteret CSL og MAML1 og testet Nic1 forening. Efter en puls af NOTCH1 aktivering blev fundet højere niveauer af Nic1 forbundet med enten CSL eller MAML1 (figur 5B) igen styrke vores model som, når den EGTA-medieret NOTCH1 aktivering, det frigivne Nic1 samler til en aktiv transkriptionel kompleks til at modulere genekspression. Interessant, sammenlignet med DMSO-behandlede celler, behandling med PMA fremmes med næsten 2-fold associering Nic1 med enten CSL (figur 5C) eller MAML1 (figur 5D). Tilføjelsen af ​​U0126 forhindrede både PMA-inducerede Nic1 /CSL og Nic1 /MAML1 forening (figur 5C-D) støtte MEK-afhængige mekanismer.

MIA PaCa-2-celler blev efterladt ubehandlet (-) eller behandlet med EGTA (4 mM) i 15 minutter (+). EGTA-holdige medium fjernet og erstattet med normal dyrkningsmedier (Ca

2+) indeholdende DMSO, PMA (100 nM) eller PMA + U0126 (10 uM) i 90 min. A. Nic1, MAML1 og CSL ekspressionsniveauer blev vurderet ved Western blot under anvendelse af de egnede antistoffer. B. CSL og MAML1 blev immunpræcipiteret (IP) før western blot analyser ved hjælp af de viste antistoffer. C. CSL blev immunpræcipiteret (IP) efterfulgt af western blot-analyser af Nic1 (til venstre). En grafisk afbildning, der viser den relative mængde af Nic1 co-immunpræcipiteret med CSL (Nic1 /CSL) er vist (til højre). D. MAML1 blev immunpræcipiteret (IP) efterfulgt af western blot-analyser af Nic1 (til venstre). En grafisk afbildning, der viser den relative mængde af Nic1 co-immunpræcipiteret med MAML1 (Nic1 /MAML1) er vist (til højre). C. og D. Resultaterne er middelværdierne ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg. * P 0,05 sammenlignet med DMSO-behandlede celler.

Diskussion

Efter aftale med tidligere undersøgelser [29-34], vores resultater viser, at en forbigående eksponering for EGTA er en nyttig og pålidelig model til rettidig undersøgelse NOTCH1 aktivering i NOTCH1- udtrykkende celler. Faktisk er det tilladt os at opdage, at efter frigørelse fra den transmembrane receptor, Nic1 gennemgår en række post-translationelle modifikationer, der omfatter phosphorylering. Det bekræftes også tidligere fastlagte koncept, hvor Nic1 er en kortvarig protein [1] som inden for en 4h tidsramme, udtryk for den nyligt spaltede Nic1 næsten helt forsvundet. Sammen med øget Nic1 udtryk, post-translationelle modifikationer og omsætning, kunne vi for første gang, at påvise forøget ekspression af endogene hak mål tyder på, at EGTA-induceret Nic1 ekspression udslag i en funktionel transkriptionel enhed i bugspytkirtelkræftceller. Den vigtigste nyhed i vores forskning er påvisningen af, at MEK /ERK-vejen fremmer udtryk for HAK mål HES1. Selvom flere undersøgelser vil helt sikkert være nødvendige for at afgøre, om de MEK /ERK aktivering påvirkninger alle eller kun en delmængde af hak mål, vores data dokumenterer, at MEK /ERK vej styrker HES1 udtryk sandsynligvis gennem mekanismer, der er afhængige af hakket receptorer, fordi præ- behandling af cellerne med en gamma-sekretase hæmmer (DAPT) forhindrede PMA-induceret HES1 ekspression. Tidligere undersøgelser også rapporteret virkningen af ​​RAS-vejen på HAK signalering [18,42]. Disse undersøgelser, primært sker under langvarig RAS aktivering eller MEK hæmning, foreslog, at RAS signalering fremmer NOTCH1 receptor spaltning /aktivering. Vores resultater er innovative, da de viser, at MEK /ERK signalvej er effektiv til, minutter efter NOTCH1 spaltning, direkte indflydelse Nic1 transkriptionel funktion. En hypotese der skyldes vores resultater er, at MEK /ERK-vejen fremmer samlingen af ​​en funktionel Nic1 transkriptionsenhed med CSL og MAML1. Dog er yderligere undersøgelser nødvendige for at afgrænse de præcise mekanismer, hvormed MEK /ERK-vejen fremmer HAK signalering.

Interessant nok er tidligere foreslået, at post-translationelle modifikationer, især fosforylering, er næsten helt sikkert modulerende Nic1-afhængige transkription [1]. I første omgang i

Drosophila

[43], men senere i pattedyr, påvistes hyperphosphorylering af det intracellulære domæne af NOTCH1 og NOTCH2 ved overgang fra den transmembrane receptor [44,45]. Bemærkelsesværdigt, hyperphosphorylering af Nic1 var forbundet med i) Nic1 kerneakkumulation [45-48], ii) Nic1 interaktion med CSL [44], iii) øget CSL-afhængig transskription [44,47,48] og iv) Nic1 transformerende kapacitet [ ,,,0],48]. Disse resultater antydede, at Nic1 phosphorylering kan fremme transkriptionel potentiale Nic1 /CSL kompleks. Men til dato, mest kinaser, der negativt regulerer Nic1 funktion er blevet identificeret: AKT viste sig at fremme Nic1 cytoplasmatisk lokalisering [49], phosphorylering af Nic1 ved DYRK1A svækket HAK signalering [50], og NLK-afhængige Nic1 fosforylering faldt dannelsen af den Nic1 /CSL kompleks [51]. Capobianco gruppe for nylig fremlagt beviser, at der forud eller under Nic1 /CSL /MAML1 kompleks forening, er Nic1 phosphoryleret af CK2 lade adgangen til en efterfølgende fosforylering site [52]. Begge phosphoryleringsbegivenheder optrådte kræves til dissociation af komplekset fra DNA. Desuden er CycC /CDK8 kompleks menes at spille en vigtig rolle i at forstyrre Nic1 /CSL /MAML1 kompleks ved phosphorylering Nic1 inden dets C-terminale PEST domæne efterfølgende FBW7-medieret Nic1 ubiquitinering og nedbrydning [53]. Ikke desto mindre, til dato, ingen positive Nic1 regulatorer (kinaser) blev identificeret og næsten alle phosphoryleringsbegivenheder sites på Nic1 endnu ikke fastlagt. Vores resultater nu danne grundlag for at undersøge det positive bidrag fra MEK /ERK-vejen på HAK signalering især i forbindelse med bugspytkirtelkræftceller. Bemærkelsesværdigt, blev det tidligere vist, at den tvungne ekspression af Nic1 i musen pancreas epitel fremmer dannelsen af ​​præmaligne læsioner i bugspytkirtlen er igangsat af en oncogen

KRAS

[54] tyder på, at KRAS og NOTCH signalering samarbejder om at fremme pancreas carcinogenese.