PLoS ONE: Expression kvantitativ egenskab Loci for CARD8 Bidrager til Risiko for to Infektion kræftformer-hepatocellulært carcinom og Cervical Cancer

Abstrakt

Caspase rekruttering domænenavn familie, element 8 (CARD8) kan koordinere medfødte og adaptive immunforsvar svar og sensibilisere celler til apoptose, der kan deltage i tumorigenese af virus-induceret hepatocellulært carcinom (HCC) og livmoderhalskræft. Ved bioinformatik analyser, vi identificeret en række enkelt nukleotid polymorfier (SNP) inden for en ny identificeret lang ikke-kodende RNA (lncRNA) som udtryk kvantitativ trait loci (eQTLs) for CARD8. I denne undersøgelse, hypotese, vi derfor, at CARD8 eQTLs SNPs inden lncRNA kan påvirke risikoen for HCC og livmoderhalskræft. Vi udførte to uafhængige case-kontrol studier af 1.300 sager med HBV-positive HCC og 1.344 normale kontroller, sammen med 1.486 livmoderhalskræft kræftpatienter og 1.536 kontrolpersoner at teste sammenhængen mellem eQTLs SNP (rs7248320) for CARD8 og risikoen for HCC og livmoderhalskræft kræft. Varianten genotype rs7248320 var signifikant forbundet med øget risiko for HCC og livmoderhalskræft [GG vs. AA /GA: justeret odds ratio (OR) = 1,28, 95% konfidensinterval (CI) = 1,03-1,61,

P

= 0,028 for HCC; justeret OR = 1,34, 95% CI = 1,09-1,66,

P

= 0,006 for livmoderhalskræft]. Endvidere er virkningen af ​​rs7248320 på cervikal kræftrisiko var mere fremtrædende i præmenopausale kvinder. Yderligere interaktiv analyse registreret en markant multiplikativ samspil mellem rs7248320 og overgangsalderen status på livmoderhalskræft risiko (

P

= 0,018). Disse resultater tyder på, at CARD8 eQTLs SNP kan tjene som en modtagelighed markør for virus-relaterede HCC og livmoderhalskræft

Henvisning:. Yin J, Wen J, Hang D, Han J, Jiang J, Song C, et al . (2015) Expression kvantitativ egenskab Loci for CARD8 Bidrager til Risiko for to Infektion kræftformer-hepatocellulært carcinom og livmoderhalskræft. PLoS ONE 10 (7): e0132352. doi: 10,1371 /journal.pone.0132352

Redaktør: Yifeng Zhou, Medical College of Soochow University, KINA

Modtaget: 31 marts 2015; Accepteret: 14 Juni 2015; Udgivet: Juli 6, 2015

Copyright: © 2015 Yin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Fund fra National Natural Science Foundation of China (81172757); National Science Foundation for Distinguished Young Scholars i Kina (81225020); National Natural Science Fund fra National Natural Science Foundation of China (81373079); Foundation i Jiangsu-provinsen for Distinguished Young Scholars (BK2012042); National Key Basic Research Program For Unge (2013CB911400); Institut til Program for New Century Fremragende Talenter i University (NCET-10-0178); Nationalt program for støtte af top-notch Young Professionals; Jiangsu-provinsen Klinisk Videnskab og Teknologi projekter (BL2012008); Collaborative Innovation Center For Cancer Personlig Medicin i Jiangsu-provinsen og Priority Academic Program for udvikling af Jiangsu videregående uddannelsesinstitutioner (Folkesundhed og forebyggende medicin); National Natural Science Fund fra National Natural Science Foundation of China (30901236); Beijing Natural Science Foundation (7123225); Beijing Nova Program (xx2012067); Videnskabelig Forskning Foundation for Returneret Scholars, Undervisningsministeriet i Kina for gennemførelsen af ​​forskning og forberedelse af artiklen. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hepatocellulært carcinom (HCC) og livmoderhalskræft er to mest almindelige cancertyper i hele verden. I 2008 blev det anslået, at mere end 80% af HCC og livmoderhalskræft tilfælde forekom i udviklingslande, herunder Kina [1,2]. Vedvarende Hepatitis B virus (HBV) og human papillomavirus (HPV) -infektion er blevet veletablerede som risikofaktorer for leveren [3] og livmoderhalskræft [4]. Men kun en lille brøkdel af virale vedvarende luftfartsselskaber tiden udvikle kræft, hvilket tyder på andre faktorer kan påvirke kliniske resultater efter virusinfektioner. Det blev rapporteret, at værten genetiske variationer spiller en kritisk rolle i carcinogenese af HCC og livmoderhalskræft [5,6].

Caspase rekruttering domænenavn familie, element 8 (CARD8) repræsenterer et nyt medlem af caspase-associeret rekruttering domæner (CARD) familie, som er protein-protein-interaktion moduler findes udførligt i proteiner, som spiller en vigtig rolle i apoptose og nuklear faktor kappa-B (NFKB) aktivering [7]. Defekter i apoptose ses i stort set alle typer af humane cancere [8]. CARD8 kan undertrykke aktiviteten af ​​NFKB aktiveres af inflammatoriske mediatorer [9]. Endvidere aktivering af NFKB, et kendetegn for inflammatorisk respons, er ofte påvist i tumorer og kan udgøre en manglende forbindelse mellem betændelse og kræft [10,11], og det er kritisk for udviklingen af ​​virusinducerede cancere herunder HCC og livmoderhalskræft [11-13]. For eksempel aktivering af NFKB signaltransduktion kræver interaktionen mellem hepatitis B virus X protein og onkogen AIB1 [14], og human papillomavirus 16 E5 oncoproteinet medierer cervikal carcinogenese via opregulering af COX-2-ekspression gennem NFKB [11].

lange ikke-kodende RNA’er (lncRNAs) er defineret som ikke proteinkodende transkripter større end 200 nucleotider. De styrer genekspression i kernen ved at modulere transkription eller via post-transkriptionelle mekanismer målrettet mod splejsning, stabilitet eller translation af mRNA’er [15]. LncRNA AC008392.1 er en af ​​nyligt identificerede lncRNAs, som lokaliserer i regionen opstrøms for CARD8 i det nittende kromosom og udtrykkes i flere cellelinjer, såsom GM12878 (Human B-lymfocyt) og HeLaS3 (Humane livmoderhalskræft celler). Ved bioinformatik analyser identificerede vi to enkelt nukleotid polymorfier (SNP) (rs7248320 og rs12459322) i AC008392.1 kan repræsentere udtrykket kvantitativ egenskab loci (eQTLs) for CARD8 (https://www.regulomedb.org) [16]. Det er muligt, at SNP’er påvirke interaktionen mellem AC008392.1 og CARD8 og derved ændre ekspressionen af ​​CARD8. Her har vi den hypotese, at CARD8 eQTLs SNPs kan bidrage til at ændre risikoen for to virus-relaterede HCC og livmoderhalskræft. For at teste vores hypotese, vi gennemført to uafhængige case-control studier, herunder 1.300 tilfælde med HBV-positive HCC og 1.344 kontrolpersoner, samt 1.486 livmoderhalskræft tilfælde og 1.536 kontrolpersoner at vurdere sammenhængen mellem eQTLs SNPs for CARD8 og modtagelighed de to kræftformer.

Materialer og metoder

undersøgelse emner

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité for Cancer Institute og Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences og Nanjing Medical University . Alle deltagerne give deres skriftligt informeret samtykke til at deltage i denne undersøgelse, og de etiske udvalg godkendte denne godkendelsesproceduren. Emnerne ‘indskrivning blev beskrevet tidligere [17-20].

Kort fortalt blev HCC patienter konsekutivt rekrutteret mellem januar 2006 og december 2010 i Nantong Tumor Hospital, Qidong Liver Cancer Institute, og First Affiliated Hospital i Nanjing Medical University i Jiangsu-provinsen, Kina. Diagnosen HCC blev underbygget af en patologisk undersøgelse og /eller alfa-fetoprotein elevation ( 400 ng /ml) kombineret med magnetisk resonans og /eller edb-tomografi. Fordi HCV-infektion er sjælden i kinesiske befolkningsgrupper, blev HCC patienter med HCV-infektion udelukket. Som følge heraf 1.300 HBV-positive HCC patienter givet samtykke til at deltage i undersøgelsen. Fra september 2009 til den marts 2010 149,172 indbyggere, der var bosat i halvtreds-to landsbyer i Jiangsu-provinsen, Kina i mindst et helt år, blev indrulleret i et community-baseret tværsnitsundersøgelse. Blandt dem, i alt 11,474 deltagerne var HBsAg seropositive. Bagefter fra september til november 2010, 8,006 personer (69,8%, 8006/11474), som indvilligede i at regelmæssigt følges op hver 1-2 år blev kaldt tilbage og kontrolleret Hepatitis virus seromarkers igen. Endelig blev 7.250 personer, der blev HBsAg seropositive med dobbelt prøver kollektion i mindst 6 måneders interval, negative for HCV og have information om antiviral behandling indskrevet community-baserede kohorte. Blandt dem, blev udvalgt i alt 1.344 emner tilfældigt som kontrollerne fungerede som en sammenligningsgruppe af HCC tilfælde. Alle kontroller var HBV persistente bærere, der var positive for både HBV overflade antigen (HBsAg) og antistof mod hepatitis B kerneantigen (anti-HBc), men negative for HCV-antistof (anti-HCV). Ingen historie HBV vaccination blev rapporteret for disse fag. Disse udvalgte kontroller blev matchet til HCC sager om alder (± 5 år) og køn, og erklærede ikke tidligere malignitet.

For livmoderhalskræft undersøgelsen, 1.486 histologisk bekræftet livmoderhalskræft patienter blev konsekutivt rekrutteret mellem marts 2006 til december 2010 fra Nantong Tumor Hospital og First Affiliated Hospital i Nanjing Medical University, Jiangsu, Kina. De 1.536 kontroller blev også tilfældigt udvalgt fra en kontrol pulje mere end 40.000 personer, der deltog i et andet community-baserede screeningsprogram for ikke-smitsomme sygdomme foretaget i Jiangsu-provinsen med opfølgende sats på 98,1%. Kontrollerne var frekvens-matchede til de sager om alder (± 5 år). Alle kontroller havde ingen selvrapporterede kræft historie.

Efter skriftligt informeret samtykke blev opnået, blev hver deltager planlagt til en samtale ved hjælp af en struktureret spørgeskema at indsamle oplysninger om demografiske data, menstruation og reproduktiv historie, og eksponering historie miljøet. Personer, der røget en cigaret om dagen i mere end 1 år blev defineret som rygere, og dem, der forbruges en eller flere alkohol genstande om ugen i mere end 6 måneder blev kategoriseret som alkohol drikker. Alle patienter og kontroller var ubeslægtede etniske han-kinesere. Efter interviewet blev en venøs blodprøve på ca. 5 ml indsamlet fra hver deltager (HCC patient, livmoderhalskræft patient og kontrol).

Serologisk Testing

HBsAg, anti-HBc og anti-HCV blev påvist fra hver deltagers serum ved enzymbundet immunosorbentassay (Kehua Bio-engineering Co, Ltd, Shanghai, Kina) i overensstemmelse med producentens anvisninger som beskrevet tidligere [17].

SNPs Valg og Genotypning

på baggrund af data fra UCSC database (GRCh37 /hg19), Regulome database og kriterierne for mindre allel frekvens (MAF) 0.05 i Han kinesiske, fandt vi to fælles eQTLs SNPs for CARD8 i nærliggende lncRNA AC008392.1. De to CARD8 eQTLs SNP’er (rs12459322 og rs7248320) er i høj koblingsuligevægt (LD) (D ‘= 1,000). Således valgte vi rs7248320 som tagging SNP. Genomisk DNA blev ekstraheret fra en leukocyt pellet ved traditionelle proteinase K-fordøjelse og efterfulgt af phenol-chloroform-ekstraktion og ethanolfældning. SNP rs7248320 blev genotypebestemmes bruge Sequenom MassARRAY IPLEX platform (Sequenom Inc). Oplysningerne om primere er vist i tabel 1. genotypebestemmelse blev udført blindt uden at kende status af sagen eller kontrol. To tomme (vand) kontroller i hver 384 brønde blev anvendt til kvalitetskontrol og mere end 10% prøver blev tilfældigt udvalgt til at blive gentaget, hvilket giver en 100% konkordans sats.

Statistisk analyse

Forskelle i demografiske karakteristika og genotypefrekvenser af SNP rs7248320 mellem cases og kontroller blev beregnet af t-test (for kontinuerlige variabler) og χ

2 test (for kategoriske variabler). Foreninger mellem genotyper og kræft risici blev vurderet ved at beregne odds ratio (OR) og deres 95% konfidensintervaller (CIS) fra logistisk regressionsanalyse. Heterogenitet associationer mellem undergrupper blev vurderet af χ

2-baserede

Q

test. Alle de statistiske analyser blev udført med R-software (version 2.13.0; R Foundation for Statistisk Computing). Alle tests var to-sidet og kriteriet om statistisk signifikans blev sat til

P

0.05.

Resultater

De demografiske karakteristika 1.300 HBV-positive HCC patienter og 1.344 kontrolpersoner, og 1.486 livmoderhalskræft patienter og 1.536 kontrolpersoner blev beskrevet tidligere (tabel 2 og 3) [ ,,,0],17-20]. Der var ingen signifikante forskelle i andelen af ​​alder, køn og rygning mellem HCC cases og kontroller. Men andelen af ​​drikkevand var signifikant højere i HCC tilfælde end i kontrollerne (

P

0,001). Sammenlignet med kontrolpersoner, de livmoderhalskræft patienter havde signifikant højere andel af rygning (

P

0,001), præmenopausale status (

P

= 0,002), og højere paritet (

P

= 0,001).

genotypen fordelinger af rs7248320 i patienter og kontroller blev vist i tabel 4. genotypefrekvenserne af rs7248320 var i Hardy-Weinberg ligevægt i kontrollerne (

P

= 0,718 for HCC kontrol og

P

= 0,343 for celleforandringer i livmoderhalsen kontrol kræft). I de multivariate logistiske regressionsmodeller, blev rs7248320 variant genotype GG forbundet med en øget risiko for HCC med 1,28 gange (95% CI = 1,03-1,61,

P

= 0,028) i forhold til genotyperne AA /GA. Tilsvarende GG genotypen øgede risikoen for livmoderhalskræft ved 1,34 gange (95% CI = 1,09-1,66,

P

= 0,006) sammenlignet med genotyperne AA /GA (tabel 4).

Sammenhængen mellem rs7248320 og risikoen for HCC blev undersøgt yderligere i stratificeret analyse (tabel 5). I recessive model, risikoen effekt for rs7248320 var lidt mere fremtrædende i yngre patienter (≤ 53 år), mandlige forsøgspersoner, og dem, der nogensinde havde røget. Imidlertid heterogenitet test var ikke signifikant for disse strata. Tabel 6 viste associering rs7248320 med risiko for livmoderhalskræft. Selvom risikoen effekt for rs7248320 var lidt mere udtalt blandt yngre kvinder (≤ 53 år), forsøgspersoner, der aldrig havde røget, forsøgspersoner, som ikke havde nogen familie historie af enhver kræft, og mindre paritet (0 ~ 1), ingen heterogenitet mellem disse lag var observeret. Interessant nok blev observeret en stærkere risiko effekt af rs7248320 blandt præmenopausale kvinder (justeret OR = 1,82, 95% CI = 1,33-2,48) (

P

= 0,014 for heterogenitet test). Ved yderligere interaktiv analyse, blev der observeret en signifikant multiplikativ samspil mellem rs7248320 og menopausale status for risikoen for livmoderhalskræft (

P

= 0,018). Den crossover analyse foreslog, at sammenlignet med overgangsalderen kvinder med genotyper AA /GA, præmenopausale kvinder med genotype GG havde den højeste risiko for livmoderhalskræft (justeret OR = 3,18, 95% CI = 2,24-4,52,

P

0,001) (tabel 7). Vejviser

diskussion

i disse to uafhængige case-control studier, vi undersøgte sammenhængen mellem rs7248320 og modtagelighed HCC og livmoderhalskræft fra en kinesiske befolkning. Vi fandt, at eQTLs SNP rs7248320 for CARD8 var forbundet med øget risiko for HCC og livmoderhalskræft. Desuden blev en betydeligt multiplikativ samspil mellem rs7248320 og menopausale status for risikoen for livmoderhalskræft også observeret.

Da KODE Projekt og RNA-seq analyse har identificeret tusindvis af nye lncRNAs, de genetiske varianter og biologiske funktion lncRNAs bliver hot spot i studier af komplekse sygdomme. Flere undersøgelser rapporterede, at flere lncRNAs blev dysreguleret i HCC og livmoderhalskræft, såsom hotair og MEG3 [21-25]. Desuden tidligere rapporteret vi at ZNRD1 eQTLs SNPs øgede risikoen for HCC [20]. LncRNA AC008392.1 lokaliserer i regionen opstrøms for CARD8, der kan have indflydelse på ekspressionen af ​​CARD8. En tidligere undersøgelse viste, at varianten genotype rs7248320 og rs12459322 var forbundet med ned-ekspression af CARD8 i monocytter [26]. Der er tegn på, at CARD8 er en negativ regulator af NFKB aktivering, hvilket resulterer i undertrykkelse af immune og inflammatoriske [27,28]. Desuden reduktion af CARD8 foreslår et fald i anti-apoptotisk forsvar [29]. Aktiveringen af ​​NFKB signalering bidrager til carcinogenese og fremmer sygdom prognose og metastase i HCC og livmoderhalskræft [30-34]. Således kan variant genotype GG af rs7248320 i lncRNA AC008392.1 være forbundet med aktivering af NFKB og apoptose hæmning gennem nedregulering af CARD8, og dermed fremme udviklingen og progressionen af ​​infektion-relateret kræft, herunder HCC og livmoderhalskræft, som var i overensstemmelse med risikoen virkning af varianten genotype GG af rs7248320 i resultaterne af vores undersøgelse.

der er flere begrænsninger af den undersøgelse, som skal løses i yderligere forskning. For det første, vi gennemførte undersøgelsen for kun én etape case-kontrol uden validering. Yderligere undersøgelser store er nødvendige for validering foreningerne imellem rs7248320 i AC008392.1 og risikoen for HCC og livmoderhalskræft. For det andet blev den biologiske funktion af de to eQTLs SNPs på AC008392.1 ikke yderligere undersøgt i dette studie. Foreningerne mellem SNP’er og risikoen for HCC og livmoderhalskræft bør fortolkes med forsigtighed. Mens der i vores tidligere undersøgelse [20], Vi fandt ZNRD1 (Zink bånd domæne, der indeholder en) eQTLs SNP rs3757328 i ZNRD1-AS1 (ZNRD1 antisense RNA 1) var forbundet med øget risiko for HCC, og yderligere eQTLs analyseresultater indikerede markant forening mellem genotyper rs3757328 og udtryk for ZNRD1 og ZNRD1-AS1. In vitro-forsøg viste også, at ZNRD1 knockdown inhiberede ekspression af HBV-mRNA og fremmes proliferation af HepG2.2.15-celler. I betragtning af, at resultaterne fra vores tidligere undersøgelse [20], vi hypotese, at lncRNA AC008392.1 kunne regulere ekspressionen af ​​relaterede protein (CARD8) selv variation og dermed indflydelse på forekomsten og udviklingen af ​​levertumor og livmoderhalskræft tumor. For det tredje blev HPV-infektion, den primære og nødvendige årsag til livmoderhalskræft, ikke påvist i cervikale prøver. Og samspillet mellem HPV type og rs7248320 kunne ikke vurderes i livmoderhalsen carcinogenese.

Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse undersøger sammenslutning af CARD8 eQTLs SNPs i lncRNA AC008392.1 med risiko for HCC og livmoderhalskræft. Med en relativt stor befolkning, denne undersøgelse viste, at variant genotype GG af rs7248320 i lncRNA AC008392.1 påvirket risikoen for to virus kræftformer-HCC og livmoderhalskræft. Varianten genotype GG kombineret med præmenopausale status styrket risikoen virkning. Disse resultater antydede, at AC008392.1 rs7248320 kunne tjene som en modtagelighed markør for HCC og livmoderhalskræft. Yderligere undersøgelser, hvori der indgår forskellige befolkninger og funktionelle assays er berettiget til at validere og udvide vores resultater.