PLoS ONE: samvirken af ​​Sfæroide-Derived Stem-lignende celler og Endotel progenitorceller Fremmer Udvikling af Colon Cancer

Abstrakt

Selv om nogle undersøgelser beskrev egenskaber tyktarmskræft stamceller (CSCS) og den rolle, endotel stamceller (EPC’er) i neovaskularisering, er det stadig kontroversielt, om der findes en interaktion eller ej mellem CSCS og EPC’er. I den foreliggende undersøgelse, HCT116 og HT29 sphere modeller, som er kendt for at være de celler, berigende CSCS blev nedsat for at undersøge rollerne for denne interaktion i udvikling og metastase af tyktarmskræft. Sammenlignet med deres parentale modstykker, sfæroide celler demonstrerede højere kapacitet for invasion, højere tumorigen og metastatisk potentiale. Derefter in vitro og in vivo forhold mellem CSCS og EPC’er undersøgt ved hjælp af kapillarrør dannelse assay og xenograftmodeller. Vores resultater viste, at kugleformede celler kan fremme proliferation, migration og rør dannelse af EPC’er gennem sekretion af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF). I mellemtiden kunne EPC’er øge tumorigene kapacitet sfæroid celler gennem angiogenese. Endvidere blev højere mikrokar tæthed påvist i området berigende cancer stamceller i human tyktarmskræft væv. Vores resultater viser, at kugleformede celler har samme egenskaber som cancer stamceller og samvirkningen af ​​CSCS og EPC’er kan spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​tyktarmskræft

Henvisning:. Wei B, Han XY, Qi CL, Zhang S, Zheng ZH, Huang Y, et al. (2012) samvirkning af sfæroide-Derived Stem-lignende celler og endotel progenitorceller Fremmer Udvikling af tyktarmskræft. PLoS ONE 7 (6): e39069. doi: 10,1371 /journal.pone.0039069

Redaktør: Giovanni Camussi, University of Torino, Italien

Modtaget: December 25, 2011; Accepteret: 18. maj 2012; Udgivet: 26 juni, 2012 |

Copyright: © 2012 Wei et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Science Foundation of China (nr 30.872.462 til Hong-Bo Wei, og nr 81.000.960 til Bo Wei). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er den tredje hyppigste årsag til kræftdødsfald i verden, og 5-års relativ overlevelse er kun 53,8-65,2% på trods diagnostiske og terapeutiske fremskridt [1], [2]. Tumor tilbagefald og metastaser er to kritiske overlevelse-påvirke faktorer af kolorektal cancer.

For nylig stigende tegn på, at tumor initiering og metastaser er afhængige af en lille sub-population af tumorceller betegnes cancer stamceller (CSCS) bærende uendelig selvfornyelse potentiale og evnen til at differentiere til forskellige befolkningsgrupper, der omfatter en [3] tumor. Ifølge denne model, blev cancer stamceller vist sig at opretholde carcinogenese, metastase, og fornyet kolorektal cancer.

Eksistensen af ​​cancer stamceller blev først påvist i forbindelse med akut myeloid leukæmi [4]. Dette princip blev yderligere udvidet til nogle faste tumorer, herunder coloncancer, brystcancer, hjernetumorer, og lungekræft [5], [6], [7], [8], [9], [10]. Cell sortering af en delpopulation på grundlag af celleoverflademarkører og bekræftelse af deres tumor-initierende aktivitet i xenograft transplantation assays er almindeligt anvendt procedurer for isolering og identifikation af CSCS fra tumorvæv eller cellelinier [11]. Selvom CD133, CD44, EpCAM blev brugt i udstrakt grad som celleoverflademarkører for tyktarmskræft stamceller, var der stadig tvivl om disse celleoverflademarkører [12], [13]. Side befolkning (SP) celler isolation blev engang brugt til at berige cancer stamceller. Men flere undersøgelser viste beviser mod en associering mellem De SP celler og cancer stamceller [14], [15], [16], [17]. For nylig er stigende undersøgelser rapporteret, at de ikke-klæbende, tredimensionale (3D) tumor kugler under serumfrie betingelser effektivt kunne berige cancer stamceller [18], [19], [20]

in vitro Salg . Derfor blev denne fremgangsmåde anvendt til at berige tyktarmskræft stamceller i den foreliggende undersøgelse.

Endotheliale progenitorceller (EPC’er), en mindre subpopulation af mononukleære cellefraktion i perifert blod, stammer hovedsagelig fra knoglemarven-afledte celler med evnen til at differentiere til modne endotelceller [21], [22]. EPC’er forlader knoglemarven og rekruttere til websteder, der kræver vaskulær reparation efter gradienter af vækstfaktorer og cytokiner, der frigives i cirkulationen af ​​skadede væv eller tumorer, og derefter bidrage til dannelse af blodkar [23], [24]. Nylige beviser vist, at cirkulerende EPC’er spiller en vigtig rolle i tumor neovaskularisering, tumorvækst, og metastase [25], [26], [27], [28], [29].

Selvom bidrag EPC’er til tumor neovaskularisering er blevet påvist i flere typer af kræft, har samspillet mellem EPCs og tyktarmskræft stamceller ikke blevet rapporteret. Formålet med denne undersøgelse var at bestemme Bionomics af tyktarmskræft stamceller og rolle samvirke af CSCS og EPC’er i vækst og metastase af tyktarmskræft.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle forsøg med menneskelige deltagere (herunder samling af humane navlestrengsblod og tyktarmskræft prøver) er blevet godkendt af Medical Research Ethics Committee of Sun Yat-sen Universitet, og udført i henhold til principperne i erklæringen Helsinki. Alle deltagere, der er involveret i undersøgelsen underskrevet informeret samtykke formularer, og alle dyreforsøg blev udført i henhold til de relevante nationale og internationale retningslinjer. Og dette projekt blev godkendt af Medical Research Animal Ethics Committee of Sun Yat-sen University.

Cell Culture

HCT116 (ATCC, CCL-247), og HT29 (ATCC, HTB-38) coloncancer cellelinier blev opretholdt i DMEM /F12 suppleret med 10% FBS, 200 U /ml penicillin, 200 ug /ml streptomycin. Tumorsphere medier (også kaldet som serumfrit medium, SFM) var sammensat af DMEM /F12-medium suppleret med 1 × B27 (Invitrogen), EGF (20 ng /ml, Peprotech), bFGF (10 ng /ml, Peprotech), rutinemæssig insulin (5 ug /ml, Invitrogen), 200 U /ml penicillin og 200 ug /ml streptomycin. For 3D suspensionskultur, blev HCT116 og HT29-celler dyrket i todimensional monolag spaltet med trypsin, resuspenderet, og derefter podet med en tæthed på 2 x 10

6 celler i SFM i 100 mm ultralave vedhæftede retter (Corning) ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2? 95% luft atmosfære.

Påvisning af CD133 Expression ved flowcytometri

De celler fra monolagskulturer og suspension kugler på dag 7 efter primær kultur blev opdaget for ekspressionen af ​​CD133. Cellerne blev vasket to gange i kold PBS og efterfølgende Cellesuspensioner blev inkuberet ved 4 ° C med 01:10 FITC-konjugeret muse-monoklonalt antihuman CD133 Ab (Miltenyi Biotec) i 45 minutter i mørke. Efter inkubation blev cellerne vasket to gange i kold PBS med 1% BSA og resuspenderes i 400 pi kold PBS med 1% BSA i flowcytometrianalyse inden for 1 time.

Kræver forny og Multi-differentiering Assay

sfæroid celler blev dissocieret til enkelte celler og udpladet i plader med 6 brønde ved 100 celler per brønd i 2 ml SFM. At evaluere forny sig selv kapacitet kugleformede celler, blev celle immunfluorescensfarvning af Lgr5 og CK20 udført efter 7 dages dyrkning. Celledifferentiering blev induceret ved dyrkning i DMEM /F12 suppleret med 10% FBS i offentlige kolber. Fire uger senere blev den samme celle immunfluorescensfarvning udført, og udtryk for CD133 blev bestemt ved FCM som beskrevet før.

Cell Proliferation og Colony Formation Assay

Single-celle suspensioner af sfæroide og adhærente celler blev fremstillet og podet ved 1 x 10

4 celler per brønd i 96-brønds plader og dyrket i enten SFM eller serumholdigt medium i 24 timer. Celleproliferation blev udført på dag 1, 2, 3, 4, 5, 6, og 7 under anvendelse af celle Counting Kit-8 (Dojindo, Japan). Pladen kolonidannelse assayet blev udført til bestemmelse af kolonidannelse effektiviteten af ​​celle i de fire grupper. Encellede suspensioner blev udpladet ved 1 x 10

2 brønd i 6-brønds plader og dyrket i serum-holdige medier ved 37 ° C i 5% CO2 i 2 uger. Derefter blev pladerne farvet med Giemsa-Wright farvning. Antallet af kolonier i hver brønd blev talt og fotograferet. Forsøgene blev uafhængigt udført mindst tre gange.

Homogenitet og forskelligartethed Adhæsion assay

Adhæsionen cellernes evne til at ECM blev testet under anvendelse fibronektin (FN) -belagt plader med 96 brønde (Corning) . Encellede suspensioner af sfæroide og adhærente celler blev udpladet (10

5 /brønd), og inkuberet ved 37 ° C i 2 timer, derefter vasket med PBS for at fjerne de ikke-klæbende celler. Delt OD på 570 nm blev bestemt at afspejle FN-klæbende celler ved hjælp af Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Japan). Adhæsionen cellernes evne til at homogene celler blev testet under anvendelse monolagcellerne-asfalterede plader med 96 brønde. Sfæroide og adhærente celler blev udpladet ved 10

5 per brønd og inkuberet ved 37 ° C i 60 min, 90 min, og 120 min. Så ikke-klæbende celler blev talt og homotypisk klæbende aktivitet blev beregnet ved hjælp af formlen:. Homotypisk vedhæftning (%) = (total celle nummer – ikke-klæbende celler) /samlede celler × 100%

Migration og Invasion assays

Migration og invasion-assays blev udført i 24-brønds plade transwell kamre med 8 um pore polycarbonat filterindsatse (Corning). I alt 5 × 10

4 eller 10

5 dissocierede sfæroide eller klæbende celler blev podet på ikke-coatede eller Matrigelcoatede indsatser i 100 ul serumfrit medium skær til migration eller invasion analyser hhv. De nedre kamre blev fyldt med 0,5 ml 10% FBS-suppleret DMEM /F12-medium. Efter 24 timer og /eller 48 timer blev celler på den øvre side af filtret fjernet, og cellerne på den nedre overflade af indsatsen blev fikseret og farvet med krystalviolet. Antallet af farvede celler blev talt under et lysmikroskop. Assays blev udført i triplikater.

Western blot-analyse

De totale celleekstrakter blev separeret ved 10% SDS-polyacrylamidgelelektroforese og overført til polyvinylidenfluoridmembran (Millipore) for ICAM-1, CXCR4 og VEGF detektion. Membranerne blev vasket i Tris-bufret saltvand med Tween (TBST, sammensat af 10 mM Tris-HCI, pH 8, 150 mM NaCl og 0,05% Tween 20), blokeret i 1 time ved stuetemperatur med 5% fedtfri mælk i TBST, og derefter probet 1 time ved stuetemperatur med anti-ICAM-1 (Santa Cruz Biotechnologies), anti-CXCR4 (Abcam), anti-VEGF (BD Pharmingen) og anti-GAPDH (Peprotech). Efter inkubering med peberrod peroxid-konjugeret sekundært antistof blev immunreaktive proteiner detekteret ved ECL detektionssystem (Millipore). Proteinkoncentrationer blev bestemt ved anvendelse af BCA proteinassaykit (ThermoScientific Biosciences).

Isolering og vurdering af EPC’er

Mononukleære celler blev isoleret ved densitetsgradientcentrifugering fra humant navlestrengsblod og dyrket i fibronectin overtrukne kolbe under anvendelse M199 suppleret med 20% FBS og 1% ekstrakter af muse hjernevæv. EPC’er oprenset basere på forskellige adhærens sats, og ikke-adhærente celler inden for 24 timer blev overført til en anden fibronectin-coatede kolbe. Efter 14 dages dyrkning, blev EPC’er inkuberet med PE-CD133, FITC-CD34, PE-VEGFR2 eller isotype-matchede IgG kontrol og identificeret ved flowcytometri som beskrevet før.

Cell Proliferation og Migration af EPC’er

Single-cellesuspension af EPC’er blev podet ved 2 × 10

4 celler per brønd i 96-brønds plader og dyrket i M199 indeholdende 0, 20%, og 40% supernatant af sfæroide eller adhærente celler. Celleproliferation blev udført på dag 1, 2, 3, 4, 5, 6, og 7 under anvendelse af celle Counting Kit-8 (Dojindo, Japan). Migration assays blev udført for at vurdere rekruttering af EPC’er af sfæroide eller adhærente celler. Single-cellesuspension af EPC’er blev podet ved 5 x 10

4 celler per brønd på skær i 100 pi serum-frit medium. De nedre kamre blev fyldt med 0,5 ml DMEM /F12 indeholdende 40% supernatant af sfæroide eller adhærente celler. Efter 24 timer blev migrerede celler tælles som beskriver før. Analyser blev udført i tre eksemplarer.

In vitro

kapillarrør Formation

supernatanter af HT29, blev HT29 Sphere, HCT116 og HCT116 Sphere tilføjet til plader med 24 brønde (Corning Inc ) overtrukket med vækstfaktor reduceret Matrigel (BD Biosciences). For at illustrere, hvis dannelse rør kapacitet EPC’er kan påvirkes ved at blokere VEGF, bevacizumab (Avastin, et VEGF monoclone antistof, Genentech Inc.) blev tilsat til supernatanten af ​​sfæroide-celler ved en koncentration på 0,25 mg /ml som yderligere to grupper [30], [31]. Så alt 5 × 10

4 EPC’er var podet og inkuberet ved 37 ° C, 5% CO2 i 3 til 30 timer. Efter 24 timer blev kapillarrør talt i tilfældige felter fra hver brønd. Analyser blev udført i tre eksemplarer.

ELISA

For at demonstrere en parakrin effekt af cancer stamceller og bekræft resultatet af VEGF afsløring fra Westerm Blot analyse, vi undersøgte VEGF-sekretion af cancer stamceller ved hjælp en kvantitativ metode. koncentration VEGF i supernatanten af ​​sfæroid /klæbende celler blev bestemt ved ELISA (R 0,05 eller blev 0,01 betragtet som signifikant eller meget signifikant statistisk

Resultater

Generation og karakterisering af Colonospheres

Både HCT116 og HT29 kolon kræftceller. voksede i store runde, ikke fastgjorte flydende sfæroide kolonier (betegnet colonospheres), når de blev dyrket i serumfrit medium suppleret med 1 x B27, 20 ng /ml EGF, 10 ng /ml bFGF (figur 1). Hyppigheden af ​​sfære-dannende celler blev bestemt ved at udføre en ekstrem begrænsende fortynding analyse (ELDA) for parentale og colonospheres-afledte HCT-116-celler. Frekvensen for at danne sfærer blev fundet at være 5,5 gange højere for celler afledt fra colonospheres end dem fra de parentale cellelinier.

Både HCT116 og HT29 kan danne store runde, ikke fastgjorte flydende colonsphere på 50-100 um ved dyrkning i SFM. Når sfæroide celler blev dyrket i 10% FBS indeholdende medium, de flydende sfæroide celler fastgjort til plast, efterhånden migreret fra colonspheres og transformeret til adhærente celler.

sfæroide celler viste højere niveauer af CD133 og Lgr5 (kendt som kolon CSC markører), men lavere differentieret epitelcelle markør CK20 end de tilsvarende parentale celler. Andelen af ​​CD133-positive celler viste sig at være mindre end 1% i parentale cellelinier, men mere end 80% observeret i kugleformede celler (figur 2). Når colonospheres blev underkastet immunfluorescensfarvning for Lgr5, blev indlysende Lgr5 farvning observeret på overfladen af ​​de fleste sfæroide celler indikerer tilstedeværelsen af ​​CSCS i colonosphere (figur 2). Når sfæroide celler blev dyrket i 10% FBS indeholdende medium, de er knyttet til plast, efterhånden migreret fra kolon sfærer og ændret til adhærerende celler morfologisk. Flowcytometri og immunofluorescens undersøgelse viste nedreguleret CD133 og Lgr5 udtryk med opreguleret CK20 efter 4 ugers dyrkning (figur 2). Resultaterne antyder, at CSCS effektivt blev beriget i kugleformede celler, og de har kapaciteten af ​​forny sig selv og multi-differentiering.

CD133 (kendt som cancer stamcellemarkør) ekspression stiger fra ≤1.2% op til 60 % -80%, når de dyrkes i SFM, men nedsat til 5% -10%, når colonsphere ændret tilbage til adhærente celler. Den samme ændring af Lgr5 (kendt som krypt stamceller markør) udtryk kan findes mens CK20 udtryk, markør for differentierede epitelcelle, viste en negativ udvikling.

klumpformet Cells Display Højere Kapacitet spredning og Klon Dannelse

Vi yderligere besluttet, om de kugleformede celler har kapacitet højere celledeling hjælp CCK-8 assay. De proliferationer af kugleformede celler var højere end deres forældres modstykke efter en periode med tilpasning til serum indeholder medium (figur 3A og 3B). Og kapaciteten af ​​kolonidannelse i kugleformede celler grupper var højere end deres forældres modstykke (figur 3C og 3D).

(A-B) spredning af HCT116 og HT29 sfæroide celler var højere end deres forældres modparter efter en tilpasningsperiode til serum medium. (C-D) Kapaciteten af ​​kolonidannelse i kugleformede celler grupper var højere end deres forældres modstykke.

klumpformet Cells Display Lavere Vedhæftning men Højere

in vitro

migrerende /invasive kapacitet

for at undersøge den maligne profil kugleformede celler, vi gennemførte in vitro-analyser for at evaluere vedhæftning og vandrende /invasive kapacitet kugleformede celler i sammenligning med deres vedhængende modstykker. Resultaterne af celleadhæsionsassay viste, at kugleformede celler har lavere kapacitet både adhæsion til FN (en af ​​de vigtigste ECM komponenter) og adhæsion til deres homogene naboer i forhold til deres parentale celler (figur 4A og 4B). Så CXCR4 og ICAM-1-ekspression i HCT116 /HT29 sfæroide celler blev undersøgt og sammenlignet med deres stamcellerne. ICAM-1-niveau var beskedent nedreguleres, mens CXCR4-ekspression var opreguleret i HCT116 /HT29 sfæroide celler sammenlignet med HCT116 /HT29 monolag celler (figur 4C).

(A-C) Sfæroide celler har lavere kapacitet begge adhæsioner til FN (A) og deres homogene naboer (B) i forhold til deres parentale celler. ICAM-1-ekspression i speroid celler var beskedent nedreguleres, mens CXCR4-ekspression var opreguleret i sammenligning med HCT116 /HT29 monolagcellerne henholdsvis (C). (D og E) HCT116 /HT29 sfæroide celler viste en 3,8-fold (p 0,01) og 4-fold (p 0,001) forøgelse af kemotaktisk potentiale på 24 timer (D). Flere sfæroide celler var naturligvis observeret at invadere Matrigel i forhold til deres forældre modstykker (p 0,001 og p 0,05 henholdsvis E).

Brug Transwell migration kamre, fandt vi, at sfæroide celler vise en signifikant stigning i cellemotilitet. Sammenlignet med HCT116 /HT29 adhærente celler, viste HCT116 /HT29 sfæroide celler en 3,8-fold (p 0,01) og 4-fold (p 0,001) forøgelse af kemotaktisk potentiale på 24 timer, henholdsvis (figur 4D). Disse celler viste også højere kapacitet til at invadere Matrigelcoatede skær i Transwell migration kamre. Flere HCT116 /HT29 sfæroide celler var naturligvis observeret at invadere Matrigel sammenlignet med tilsvarende adhærente celler (p 0,001 og p 0,05, henholdsvis) (figur 4E). Disse resultater indikerer, at kugleformede celler er udstyret med lavere vedhæftning, men højere vandrende /invasive kapacitet, en funktionel fænotype associeret med tumor aggressivitet.

sfæroid Celler Fremmer formering, migrering og Tube Dannelse af EPC’er Gennem opregulering VEGF-ekspression

Oprensede EPC’er blev opnået fra humant navlestrengsblod. Flowcytometri-analyse viste, at EPC’er i senere trin vises en vis ekspression af CD34 og CD133, men højniveauekspression af VEGFR2 (figur 5A-5C). Celledeling og migrering af EPC’er fremkaldt af supernatanter af kugleformede celler var højere end deres kolleger (figur 5D og 5E). Røret formation assay viste, at flere rør dannet i sfæroid celler gruppen end adhærente celler gruppe. Derudover, når 0,25 mg /ml bevacizumab (Avastin, et VEGF monoklonalt antistof) blev tilsat i supernatant af kugleformede celler blev dannelsen rør kapacitet EPC’er undertrykt (figur 6A). Derefter blev påvist VEGF sekreter i supernatanter af sfæroid /vedhæftende celler ved hjælp af ELISA. Resultaterne viste, at koncentrationen af ​​VEGF i supernatant af adhærente celler var lavere end kugleformede celler (figur 6B). Ekspressionen af ​​sfæroid /adhærente celler blev vurderet ved Western blot (figur 6C). Resultaterne er illustreret, at VEGF kan spille en vigtig rolle i effekten af ​​sfæroide celler på EPC’er, som foreslået, at kugleformede celler kan fremme angiogenese af EPC’er gennem op- regulering VEGF-ekspression.

(AC) EPC’er overholde Fn- belagt kolbe efter 72 timer og EPC’er kloner kan ses efter en uge (A), og til stede brosten-lignende tegn efter to uger (B). EPC’er i senere tidspunkt vise en vis ekspression af CD34 og CD133, men højniveauekspression af VEGFR2 (C). (D, E) celleproliferation (D) og migration (E) af EPC’er behandlet med supernatanter af kugleformede celler var højere end deres modpart.

(A) Tube dannelse af EPC’er behandlet med supernatanter af sfæroide celler var højere end deres kolleger. Og rør dannelse af EPC’er blev undertrykt, når vi blokere funktionen af ​​VEGF ved bevacizumab. (B) VEGF koncentrationer i supernatanter af kugleformede celler var højere end de adhærente celler. (C) Højere VEGF-ekspression blev observeret i kugleformede celler sammenlignet med deres kolleger.

klumpformet Celler Besidder Højere Tumorgenetisk og metastatisk potentiale

in vivo

og EPC’er kan øge disse Kapacitet

sfæroide celler viste signifikant højere tumorigencity end adhærente celler (Figur 7A, 7B og 7E). Når 2 × 10

6 celler blev inokuleret i nøgne mus, alle mus udviklede tumorer. Transplanterede tumorer blev bekræftet som tyktarmskræft med hæmatoxylin-eosin-farvning. Og i produktionen af ​​subkutan tumor i kugleformede celler grupper var signifikant højere end for adhærente celler grupper. Desuden mængderne af subkutan tumor i kugleformede celler plus 1/10 EPC’er grupper var højere end for rene sfæroide celler grupper (figur 7C, 7D og 7F). Men ingen signifikant forskel blev fundet mellem rene sfæroide celler og sfæroide celler plus 1/100 EPC’er (data ikke vist). Derefter blodkar densitet i tumorvæv blev vurderet ved anvendelse CD31 immunfluorescensfarvning. Flere blodkar blev fundet i sfæroid gruppe celler sammenlignet med vedhængende gruppe celler, og blev observeret endnu mere angiogenese i tumorvæv i den kombinerede gruppe af HCT116 sfære plus 1/10 EPC’er (figur 7G-7j). Og MVD blev talt efter den ikke-specifikt polyklonalt CD31 antistof. For at bestemme EPCs bidrag, udførte vi IF farvning under anvendelse af humant monoklonalt CD31-antistof. Resultatet viste flere blodkar i den kombinerede gruppe af HCT116 sfære plus EPC’er end rene sfæroide celler (Figur 7K-L).

(A-F) den sfæroide celler viste signifikant højere tumorigenecity end adhærente celler (A, B, E). Og mængden af ​​subkutane tumorer i kugleformede celler plus EPC’er grupper var større end kugleformede celler grupper (C, D, F). (G-J) mikrokar densitet (MVD) af tumor udviklet af HCT116 sfæroide celler (H) var højere end for HCT116 (G). Den højeste MVD blandt disse grupper blev fundet i tumorvæv udviklet fra HCT116 sfære plus 1/10 EPC’er (i, j). Og mere blodkar udvikles fra humane EPC’er i HCT116 sfære plus EPC’er gruppe (L) findes end rent sfæroide celler gruppe (K). (M) De HCT116 sfæroide celler udviklet mere liver metastatiske foci end HCT116.

Da levermetastaser angik, fire mus (4/5) udviklede levermetastaser i sfæroid gruppe celler, men kun en mus (1/5) gjorde i vedhængende gruppe. Metastatiske tumorer blev også bekræftet som tyktarmskræft med hæmatoxylin-eosin-farvning (figur ikke vist). Resultatet af leveren metastatiske foci optælling viste lignende resultater (figur 7M). De generelle betingelser for musene i sfæroid gruppe celler er værre end i vedhængende gruppe celler, og nogle af dem udviklede ascites og svær afmagring. Og der var ingen signifikant forskel mellem kugleformede celler plus EPC’er (med forholdet 10:01 og 100:1) grupper og sfæroide celler grupper (data ikke vist).

Klinisk evidens for Cancer Stamceller Fremme Angiogenese i Human tyktarmskræft

for at understøtte vores eksperimentelle resultater, undersøgte vi, om tyktarmskræft stamceller fremmer angiogenese inden humane coloncancerformer, og den normale slimhinde fra den samme patient som kontrol. Den immunfluorescensfarvning af CD133 /Lgr5 (tyktarmskræft stamcellemarkør) og blodkar EF markør CD31 blev udført. Som vi alle ved, er der flere mikrokar i kræftvæv end normalt væv. Ud over dette har vi fundet, at højere mikrokar densitet i området berigende cancer stamceller i de friske prøve af human coloncancer (figur 8).

(A) Flere mikrokar i kræftvæv end normalt væv blev observeret ved immunfluorescensfarvning af CD133 og CD31 af normal slimhinde og tyktarmskræft. Og højere MVD blev fundet i området berigende CD133

+ cancer stamceller i tyktarmskræft væv. (B) Højere MVD (CD31

+), blev fundet i området berigende Lgr5

+ cancer stamceller i tyktarmskræft væv.

Diskussion

I 70’erne af det sidste århundrede, Fidler IJ et al. [32] foreslog begrebet tumor heterogenitet, som formoder der var forskellige fænotyper i tumorvæv. Kræften stamceller teori blev formet baseret på dette begreb. Kræft stamceller er generelt defineret som en lille sub-population af tumorceller, der bærer selvfornyelse og multi-retningsbestemt differentiering potentiale [11]. Hidtil har eksistensen af ​​cancer stamceller blevet bekræftet i flere faste tumorer, herunder coloncancer. Ifølge denne hypotese, den lille subpopulation af cancer stamceller var forsynet med det hele karakteristisk for malignitet, herunder uendelig proliferation, invasion og metastase, tilbagefald og resistens over for behandling.

I dag er udbredt anvendt metode til at isolere eller berige kolon cancer stamceller er cellesortering baseret på celleoverflademarkører, såsom CD133, Musasai-1, CD44, EpCAM, Lgr5 osv Ricci-Vitiani L et al. rapporterede CD133

+ celler, som tegner sig for omkring 2,5% af tumorcellerne er tumorgenic celler i tyktarmskræft [33]. Subkutan injektion af tyktarmskræft CD133

+ celler let gengivet den oprindelige tumor i immunsvækkede mus, hvorimod CD133

– celler udviklede ikke tumorer. Men der var stadig mange forskellige meninger om disse kræft stamceller markører. For eksempel foreslog, Shmelkov SV at CD133 udtryk ikke er begrænset til stamceller, og begge CD133

+ og CD133

– metastatiske kolon kræftceller indlede tumorer [12]. Nogle forskere rapporterede DYE-effluxing side population celler, der udtrykker ABCG2, en ATP-bindende kassette halv-transporter, kunne isoleres som cancer stamceller [34], [35], [36]. Viste imidlertid flere undersøgelser beviser mod en associering mellem De SP befolknings- og cancer stamceller. SP celler isoleret fra MKN28 gastrisk cancerceller producerede ikke tumor i en xenograft model [37]. Endvidere SP og ikke-SP celler af colon cancer cellelinjer have tilsvarende multipotente differentiering kapacitet og lignende tumorigenicitet i xenograft model [38].

I den foreliggende undersøgelse, vi opnåede tumor kugler fra HCT116 og HT29 coloncancercelle linjer ved at dyrke disse celler i serumfrit medium [39], [40]. Og den følgende analyse viste, at CD133 og Lgr5 udtryk for disse sfæroide celler var højere end deres forældres modstykke, mens CK20 udtryk var lavere som repræsenterer den differentierede endotelceller. De modstridende fænotyper blev påvist, når de sfæroide cellerne blev induceret til at differentiere i FBS indeholdende medium.