PLoS ONE: calbindin 2 (CALB2) Regulerer 5-fluoruracil Følsomhed i kolorektal cancer ved at modulere Intrinsic apoptosecyklus

abstrakt

rolle calciumbindende protein, calbindin 2 (CALB2), i regulering af reaktion af colorektal cancer (CRC) celler til 5-fluoruracil (5-FU) blev undersøgt. Real-time RT-PCR og Western blot-analyse afslørede, at CALB2 mRNA og proteinekspression blev nedreguleret i p53 vildtype og p53 null isogene HCT116 CRC cellelinier efter 48 timer og 72 timer 5-FU behandling. Desuden blev 5-FU-induceret apoptose signifikant reduceret i HCT116 og LS174T CRC cellelinier, hvori CALB2 ekspression var blevet bragt til tavshed. Yderligere undersøgelser afslørede, at CALB2 omplantes til mitokondrierne følgende 5-FU behandling, og at 5-FU-induceret tab af mitokondrie membran potentiale (Δψ

m) blev ophævet i CALB2-tavshed celler. Endvidere CALB2 inaktivering faldt 5-FU-induceret cytochrom c og smac frigivelse fra mitokondrier og faldt også 5-FU-induceret aktivering af caspaser 9 og 3/7. Notatet co-nedregulering af XIAP overvandt 5-FU modstand i CALB2-tavshed celler. Kollektivt antyder disse resultater, at efter 5-FU behandling i CRC cellelinjer, er CALB2 involveret i apoptose induktion gennem den intrinsiske mitokondrie pathway. Dette indikerer, at CALB2 kan være en vigtig mediator af 5-FU-induceret celledød. Endvidere kan nedregulering af CALB2 som respons på 5-FU repræsenterer en iboende mekanisme af resistens over for dette anticancerlægemiddel

Henvisning:. Stevenson L, Allen WL, Proutski I, Stewart G, Johnston L, McCloskey K, et al. (2011) calbindin 2 (CALB2) Regulerer 5-fluoruracil Følsomhed i kolorektal cancer ved at modulere Intrinsic apoptosecyklus. PLoS ONE 6 (5): e20276. doi: 10,1371 /journal.pone.0020276

Redaktør: Andrei L. Gartel, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: December 14, 2010; Accepteret: April 28, 2011; Udgivet: May 24, 2011

Copyright: © 2011 Stevenson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Funding var modtaget fra Cancer Research UK (C212 /A7402); og forskning og udvikling Office Nordirland, Ministeriet for Sundhed, social service og Offentlig Sikkerhed (RRG /3261/05, RRG 6,42). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: Professor Patrick Johnston er grundlægger og direktør for Almac Diagnostics, Craigavon, UK. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den næststørste årsag til kræft-relaterede dødsfald i Europa og USA 5-fluorouracil (5-FU) -baseret kemoterapi forbliver standard behandling for CRC i både adjuvans og avancerede indstillinger sygdom. Men responsrater til 5-FU-terapi er mellem 10-20% ved metastasebehandling [1]. Kombinationen af ​​5-FU med topoisomerase I-inhibitor, irinotecan (CPT-11), eller det DNA-ødelæggende middel, oxaliplatin, er blevet væsentligt bedre responsrater op til 50% [2] – [3]. Hidtil ukendte midler, såsom det monoklonale antistoffer cetuximab, har panitumumab (epidermal vækstfaktor receptor inhibitorer), og bevacizumab (en vaskulær endotelvækstfaktor inhibitor) også vist gunstige virkninger, når de kombineres med kemoterapi [4] – [6]. På trods af dette, er prognosen for de fleste patienter med fremskreden CRC forbliver fattige grundet iboende eller erhvervet kemoresistens. Derfor er identifikation af de signalmolekyler involveret i formidling reaktion CRC til 5-FU nødvendige for at bestemme de underliggende mekanismer af 5-FU resistens.

calbindin-2 (CALB2, også kendt som calretinin) er en 29 kDa calcium (Ca

2+) bindende protein af EF-hand familie [7], som er en familie af proteiner indeholdende Ca

2 + -bindende motiver sammensat af to spiraler (E og F). Ca

2 + inducerede konformationsændringer tyder på, at CALB2 sandsynligvis tilhøre en gruppe af Ca

2+ sensor proteiner i denne familie [8]. Hos mennesker er CALB2 primært udtrykkes af visse celler i nervesystemet, men kan også findes i ovarieceller [9]. Normal kolon epitelceller udtrykker ikke CALB2, men det er fundet i coloncarcinomer [10], cellelinier afledt af primære colontumorer [11] og det er en diagnostisk markør for mesotheliomas [12] – [13]. Rolle CALB2 i modulerende neuronexcitabilitet har konsekvent demonstreret [14]. den fysiologiske funktion af CALB2 i cancerceller er dog stadig, at blive belyst.

Ca

2+ er blevet identificeret som en budbringer, der koordinerer endoplasmatisk reticulum (ER) -mitochondrial interaktioner, der regulerer apoptose [15]. Mange former for cellulært stress er kendt for at inducere Ca

2+ frigivelse fra ER og efterfølgende Ca

2+ indstrømning i mitokondrier resulterer i tab af mitokondrie membranpotentiale efterfulgt af frigivelse af cytochrom c og smac [16]. Induktion af ER stress er også blevet rapporteret at øge kemoterapi sensibilisering [17]. Mitokondrie Ca

2+ dynamik er også involveret i reguleringen af ​​cellulære energi metabolisme og i processer såsom celle motilitet og neurotransmitter frigørelse. Derfor reguleringen af ​​Ca

2+ frigivelse er under streng kontrol, og mange Ca

2 + -bindende proteiner, såsom CALB2 kan fungere nedstrøms for ER Ca

2+ frigivelse til at modulere apoptose eller andre cellefunktioner.

En DNA microarray undersøgelse foretaget af vores gruppe ved hjælp af HGU133 plus 2,0 array (Affymetrix, UK) undersøgte udtrykket profiler af p53

+ /+ HCT116 CRC celler behandlet med 5-FU [ ,,,0],18]. I denne undersøgelse blev CALB2 identificeret som et potentielt hidtil ukendt regulator af 5-FU respons. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge den mekanisme, hvormed CALB2 regulerer 5-FU respons i CRC celler.

Materialer og metoder

Reagenser

5-FU blev købt fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Stamopløsninger blev fremstillet i sterilt PBS og opbevaret ved 4 ° C før brug. Den CALB2 antistof blev købt hos Chemicon International (Temecula, CA). Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) antistof blev købt hos PharMingen (San Diego, CA, USA). Smac /DIABLO og cytochrom c-antistoffer blev anskaffet fra BD Biosciences (Oxford, UK). Cytochrom c-oxidase-underenhed IV (Cox IV) og X-bundet inhibitor af apoptose protein (XIAP) antistoffer blev indkøbt fra Cell Signaling Technology, Inc (Danvers, MA, USA). Alpha-tubulin-antistof blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA). GAPDH blev købt fra Abd Serotec (Kidlington, UK). Propidiumiodid blev erhvervet fra Sigma (Poole, UK) og FITC-Annexin V blev indkøbt fra BD Biosciences (Oxford, UK). En pan-caspaseinhibitor, Z-VAD (OMe) -FMK, blev købt fra Calbiochem (Darmstadt, Tyskland)

Cell kultur

Parental HCT116 og isogene p53

-. /- og Bax

– /- CRC cellelinjer blev venligst stillet til rådighed af professor Bert Vogelstein (Johns Hopkins University, Baltimore, MD). Den LS174T-cellelinien blev fremskaffet fra ATCC (CL-188 ™). HCT116 cellelinier blev opretholdt i McCoys 5A-medium (Invitrogen, UK) og LS174T-cellelinien blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (Invitrogen, UK). Medier blev suppleret med 10% dialyseret føtalt kalveserum, 50 ug /ml penicillin-streptomycin, 2 mM L-glutamin og 1 mM natriumpyruvat og inkuberet i 5% CO

2 ved 37 ° C.

cellelevedygtighed assay

cellelevedygtighed blev bestemt ved anvendelse af et 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT, Sigma) assay som tidligere beskrevet [19].

Real-time RT-PCR-analyse

Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af RNA STAT-60 reagens (Biogenesis, Poole, UK) ifølge producentens instruktioner. Revers transskription blev udført med 8 ug af RNA under anvendelse af en Moloney Murine Leukæmi Virus (M-MLV) baseret revers transkription (Invitrogen, UK) ifølge producentens instruktioner. Real-time reverse transkription-PCR (RT-PCR) amplifikation blev udført som tidligere [18] beskrevne. Primer sekvenser var som følger: CALB2 (frem) 5′-GCAGAGCTGGCGCAGATC- 3 ‘, CALB2 (tilbage) 5′-GCTCATCGTACGGCCGGTTCG- 3’; GAPDH (fremad) 5 ‘-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT- 3’ og GAPDH (tilbage) 5 ‘- GACAAGCTTCCCGTTCTCAG -3 “. Genekspression blev normaliseret til ekspressionen af ​​GAPDH henvisning genet. Færdige udtryk værdier blev præsenteret i forhold til den ubehandlede tid-matchet kontrol.

Western blotting

Western blots blev udført som tidligere beskrevet [19]. Immunodetektion blev udført under anvendelse primære muse monoklonale antistoffer mod CALB2, PARP, Smac, cytochrom c, XIAP, α-tubulin eller GAPDH sammenholdt med peberrod peroxidise-konjugeret fåre-anti-muse-antistof (Amersham, Little Chalfont, Buckinghamshire, England). En kanin polyklonalt antistof mod Cox IV blev anvendt i forbindelse med et æsel-anti-kanin sekundært antistof (Amersham). Det fluorescerende signal blev påvist under anvendelse af Super Signal kemiluminescerende påvisningssystem (Pierce, Rockford, IL) ifølge producentens instruktioner.

Western blot-protein kvantificering

densitometri værdier af proteinbånd blev erhvervet under anvendelse af dokumentationen ChemiDoc-XRS systemer skib systemet (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Bånd blev derefter analyseret ved anvendelse af Mængde One®1-D analyse software (Bio-Rad Laboratories, Inc., version, 4.5.2).

Analyse af subG1 /G0

DNA-indholdet i celler blev bedømt ved propidiumiodid (PI) farvning som tidligere [18] beskrevne. Målinger og analyser blev udført på et FACS Calibur flowcytometer med CellQuest software (BD Biosciences, San Diego).

FITC Annexin V /propidiumiodid analyse

Celler blev høstet og analyseret ifølge fabrikantens instruktioner (BD Biosciences, Oxford, UK). Kort fortalt blev niveauer af apoptose beregnet som summen af ​​FITC-Annexin V positiv /propidiumiodid negativ (tidlig apoptose) og FITC-Annexin V positiv /propidiumiodid positive (sent apoptose) cellepopulation. Målinger og analyser blev udført på et FACS Calibur flowcytometer med CellQuest software (BD Biosciences, San Diego).

Mitokondriel membranpotentiale analyse

For at bestemme tabet af mitokondriemembranen potentiale (Δ

ψ

m), blev celler inkuberet med 25 nM tetramethylrhodamin ethylester percholate (TMRE) ved 37 ° C i 15 minutter og opsamlet ved trypsinering. Cellerne blev pelleteret ved centrifugering ved 800

g

i 5 min ved 4 ° C og resuspenderet i 0,5 ml PBS. Måling og analyse blev udført på et FACS Calibur flowcytometer med CellQuest software (BD Biosciences, San Diego).

siRNA transfektion

CALB2 målretning (siCALB2) og ikke-targeting kontrol (SC) siRNA konstruktioner blev indkøbt fra Dharmacon Inc. (Chicago, IL). De siCALB2 konstruere sekvenser anvendt var GGCUCUGGCAUGAUGUCAAdTdT (sense) og UUGACAUCAUGCCAGAGCCdTdT (antisense). De SC konstruere sekvenser anvendte var UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT (sense) og ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT (antisense). En yderligere 4 CALB2 målretning siRNA sekvens blev købt fra Qiagen: siCALB2_5 (SI02660980), siCALB2_6 (SI03190824), siCALB2_7 (SI04157790) og siCALB2_8 (SI04267697). Pre-designede siRNA for XIAP blev købt hos Cell Signalling Technology (Danvers, MA, USA). siRNA transfektioner blev udført med Oligofectamine reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Efter 5 timer blev cellerne behandlet med forældrenes ~IC

60 (72 h) doser af 5-FU (5 uM for HCT116 og 20 uM for LS174T). Celler blev høstet efter 72 h 5-FU behandling før analyse ved flowcytometri og Western blot.

Sub-cellulær fraktionering

Celler blev opsamlet ved centrifugering, vasket i 1 ml iskold mitokondrie isolation buffer (200 mM Mannitol, 70 mM saccharose, 1 mM ethylenglycol bis (α-aminoethylether) –

N

,

N

,

N

1

,

N

1

, -tetraeddikesyre, 10 mM HEPES, 0,5 mg /ml bovint serumalbumin; pH 7,4) før Dounce homogenisering. Cellerester blev opsamlet ved centrifugering ved 800

g

i 10 min. den mitokondriske fraktion blev pelleteret ved centrifugering ved 10.000

g

i 10 min. Supernatanten indeholdende den cytosoliske fraktion blev overført til et frisk rør og det mitokondrielle pellet blev resuspenderet i 50 pi RIPA buffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton-X100, 0,1% SDS) indeholdende protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland).

caspaseaktivering assays Salg

caspaseaktivering blev målt under anvendelse Caspase Glo 3/7, 8 og 9 assays (Promega) ifølge producentens anvisninger.

Statistisk analyse

Resultaterne blev opsummeret som en middelværdi ± standardafvigelse af middelværdien (SEM) af 3 uafhængige forsøg. Den statistiske signifikans af dataene blev testet under anvendelse af en 2-vejs ANOVA (GraphPad Prism® version 5.01).

microarray analyse

5-FU-resistente HCT116 delaktionslinje blev genereret på vores laboratorium som tidligere beskrevet [20]. HCT116 parentale celler og HCT116 5-FU-resistente datterceller blev behandlet med 5 pM 5-FU i 24 timer for at identificere gener, der blev differentielt udtrykte. Totalt RNA blev isoleret fra de

in vitro Salg forsøg under anvendelse af RNA STAT-60 total RNA-isolering reagens (Tel-Test) ifølge producentens instruktioner. Totalt RNA (5 ug) blev sendt til Almac Diagnostics for cDNA syntese, cRNA syntese, fragmentering, og hybridisering på kolorektal sygdomsspecifikke Array (DSA, Almac Diagnostics) microarrays. Alle

in vitro Salg assays blev udført in triplo. Alle microarray data MIAME kompatibel og alle rå data er blevet deponeret i en MIAME kompatibel database (ArrayExpress tiltrædelse nummer: E-MEXP-1691)

Generation af gen lister

I første omgang hvert array var. normaliseret til medianen signal intensitet alle arrays. For lægemiddelbehandlede arrays, 24 h 5-FU-behandlede prøver blev derefter normaliseret til de ubehandlede kontrolprøver. I tilfældet med den basale eksperiment blev 5-FU-resistente arrays normaliseret til HCT116 parentale arrays. Alle microarray data (E-MEXP-1691) blev derefter filtreret efter følgende kriterier: Affymetrix flag opkald (P /M i alle prøver), Cross Gene Error Model (gennemsnitlig base /proportional cut-off), fold ændring (1,5 gange ) og t-test (p 0,05), blev der kun gener passerer alle 4 filtre bevares og anvendes som de endelige arbejder genelists. Tre

in vitro

genelists blev skabt: 5-FU-inducerbart i forældrenes, 5-FU-inducerbart i 5-FU-resistente og konstitutivt dereguleret i 5-FU-resistente

Identifikation af. pathways associeret med 5-FU-resistens

Kegg stifunktionen inden Genespring GX (v7.3.1) blev anvendt til at identificere deregulerede veje passerer en 1,5 gange ændring og t-test (p 0,05) fra microarray

in vitro

genelists.

Foreningen af ​​CALB2 udtryk med klinisk respons

Vi hentede CALB2 udtryk data fra offentlige microarray datasæt. GraphPad Prism 5 software blev anvendt til at generere Kaplan-Meier-overlevelseskurver baseret på median CALB2 ekspression over hver tumor stadium eller kombineret stadieinddeling. Disse datasæt omfattede en CRC kohorte (GSE12945; PMID: 19.399.471) af 62 patienter (13 trin 1, 23 trin 2, 21 fase 3 og 5 trin IV) gennemgår elektiv standard onkologisk resektion [21] og en brystkræft kohorte (GSE9893; PMID: 18347175) af 132 tamoxifen-behandlede patienter) [22]

Resultater

CALB2 udtryk i HCT116 celler nedreguleres med 5-FU behandling

En tidligere. microarray undersøgelse af vores gruppe rapporterede CALB2 genekspression i HCT116 cellelinie at være opreguleret efter 24 h 5-FU behandling i forhold til en ubehandlet 0 h kontrol [18]. yderligere analyser viste imidlertid, at konstitutiv CALB2 udtryk stiger over tid (fig. S1), derfor har vi igen analyseret 5-FU-inducerede mRNA ændringer i CALB2 genekspression niveauer i forhold til en ubehandlet, tid-matchede kontrol. I modsætning til vores tidligere undersøgelse, denne metode viste, at behandling med en ~IC

60 (72 h) dosis (5 uM) 5-FU faktisk resulterede i en signifikant, tidsafhængig nedregulering af CALB2 genekspression i p53

+ /+ HCT116 cellelinie (fig. 1A). I p53

– /- HCT116 cellelinie, CALB2 genekspression blev ikke ændret signifikant efter 24 h 5-FU behandling, men var signifikant nedreguleret ved 48 timer og 72 timer (fig 1B.). Western blot analyse viste, at denne nedregulering blev afspejlet i nedsat CALB2 proteinekspression i 5-FU-behandlede celler (fig. 1C). Disse resultater antyder, at CALB2 ekspression i HCT116 celler er akut nedreguleret i respons til 5-FU behandling, og at denne modulation ikke er afhængig af p53.

Real-time RT-PCR kvantificering af CALB2 mRNA-niveauer i isogene (A) p53

+ /+ og (B) p53

– /- HCT116 celler efter 24 timer, 48 timer og 72 timer 5-FU behandling (parental ~IC60

(72 h) dosis på 5 uM). Gange ændring i ekspression værdier er i forhold til den ubehandlede tid-matchet kontrol. Fejl- søjler repræsenterer middelværdi ± SEM, NS: ingen signifikant forskel, ** p 0,01, *** p 0,001. (C) Western blot-analyse af CALB2 i HCT116 cellelinier efter 72 h 5-FU (5 um) Behandling og tilsvarende densitometridata af CALB2 ekspression i forhold til GAPDH ladningskontrol.

5-FU inducerede nedregulering af CALB2 er caspase-uafhængig

for at afgøre, om faldet i CALB2 protein i respons til 5-FU var caspase-afhængig, blev HCT116 parentale celler behandlet med et ~IC

60 (72 timer ) dosis (5 uM) af 5-FU alene eller i kombination med en 10 uM dosis af en pan-caspaseinhibitor (Z-VAD) i 72 timer. Inhibering af caspase-aktivitet efter Z-VAD-behandling blev valideret ved anvendelse af en caspase 3/7-specifik aktivitet assay (fig. 2A). 5-FU behandling signifikant (p 0,05) øget caspase 3/7 aktivitet ved -4 gange, sammenlignet med de ubehandlede kontroller, og dette blev fuldstændigt ophævet ved Z-VAD. Vigtigere er, at Z-VAD co-behandling ikke inhiberer 5-FU-induceret nedregulering af CALB2 genekspression (fig. 2B) eller protein-ekspression (fig. 2C), hvilket indikerer, at CALB2 nedregulering ikke caspase-afhængig.

p53

+ /+ HCT116 celler blev behandlet med en ~IC60

(72 timer) dosis af 5-FU alene eller kombineret med en 10 pM dosis af pan-caspaseinhibitor Z-VAD (OMe ) -FMK (Z-VAD) i 72 timer (a) Caspase 3/7 aktivitet blev kvantificeret ved anvendelse af en luciferase reporter assay. Værdier er RFU read-outs forhold til cellelevedygtighed, som bestemt ved MTT. (B) Real-time RT-PCR kvantificering af CALB2 mRNA (fold-ændring i forhold til den ubehandlede, tid-matchet kontrol). (C) Western blot analyse af CALB2 udtryk og tilsvarende densitometridata af CALB2 udtryk i forhold til GAPDH lastning kontrol.

CALB2 lyddæmpning giver 5-FU modstand

Da CALB2 er down- reguleres efter 5-FU behandling, undersøgte vi dens rolle i mediering 5-FU-respons. Et gen silencing fremgangsmåde blev anvendt til at bestemme funktionen af ​​CALB2 i 5-FU-induceret apoptose. CALB2 banke ned af siRNA blev bekræftet ved Western blot (fig. 3A). siRNA-medieret inaktivering af CALB2 ekspression blev yderligere forstærket af 5-FU co-behandling, sandsynligvis på grund af undertrykkelsen af ​​CALB2 mRNA i respons til 5-FU-behandling (fig. 1A). PARP-spaltning, en indikator for celledød, blev observeret i kontrolgruppen siRNA-transficerede p53

+ /+ HCT116 celler efter 5-FU-behandling. Dette var helt ophævet i CALB2-lyddæmpet celler, hvilket indikerer reduceret 5-FU-induceret død. Disse resultater blev understøttet af flowcytometri data, som viste, at niveauet af 5-FU-induceret apoptose blev betydeligt reduceret (p 0,05) fra -30% i siRNA kontrolcellerne til ~17% i CALB2-lyddæmpet p53

+ /+ HCT116 celler (fig. 3B). I p53

– /- HCT116 cellelinie, 5-FU-induceret apoptose blev også signifikant reduceret (p 0,05), fra ~14% i siRNA kontrolcellerne til -9% i CALB2-lyddæmpet celler (Fig . 3C). Den reducerede følsomhed p53

– /- HCT116 celler til 5-FU har tidligere blevet bemærket af vores gruppe og andre [23], [24]. Lignende effekter blev observeret i en anden CRC cellelinje, lyddæmpning LS174T, hvor apoptose blev øget betydeligt efter en ~IC

60 (72 timer) dosis på 20 uM 5-FU og CALB2 væsentligt reduceret dette (Fig 3D, s. 0,01 ). CALB2 vælte blev bekræftet ved Western blot (fig. 3D indsat) og som i HCT116 cellelinier, CALB2 proteinniveauer var nedreguleret efter 5-FU-behandling. For at udelukke ikke-tilsigtede virkninger af CALB2-targeting siRNA anvendte vi Annexin /PI flowcytometri for at bestemme virkningen af ​​yderligere 4 CALB2 målretning siRNA-sekvenser på 5-FU-induceret apoptose i p53

+ /+ HCT116 celler (fig. 3E). En betydelig reduktion i 5-FU-induceret apoptose blev observeret med alle 4 yderligere CALB2 siRNA sekvenser og CALB2 silencing blev bekræftet ved Western blot-analyse (indsat).

(A) Western blot-analyse af CALB2 og PARP i p53

+ /+ HCT116 cellelinie efter transfektion med kontrol siRNA (-) eller CALB2-targeting siRNA (+) og 72 h co-behandling med ~IC60

(72 h) dosis af 5-FU. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. Propidiumiodid flowcytometrisk analyse, som viser procentdelen af ​​cellepopulation i sub-G1 /G0 for (B) p53

+ /+ og (C) p53

– /- HCT116 celler efter transfektion med kontrol siRNA (SC) eller CALB2 målretning siRNA (siCALB2) og 72 h co-behandling med 5 uM 5-FU. (D) Annexin V /propidiumiodid flowcytometrisk analyse af LS174T CRC cellelinje efter transfektion med kontrol siRNA (SC) eller CALB2 målretning siRNA (siCALB2) og 72 h co-behandling med ~IC60

(72 h) dosis af 5-FU (20 uM). ** P 0,01, fejl søjler repræsenterer gennemsnit ± SEM. (Indsat) Western blot analyse af CALB2 udtryk i LS174T. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. (E) p53

+ /+ HCT116 celler efter transfektion med kontrol siRNA (SC), CALB2 målretning siRNA (siCALB2) eller yderligere CALB2-targeting siRNA-sekvenser (siCALB2_5, siCALB2_6, siCALB2_7 og siCALB2_8) og 72 h co-behandling med 5 uM 5-FU. (Indsat) Western blot-analyse af CALB2 ekspression efter 72 timer transfektion med kontrol siRNA (SC) eller CALB2 målretning siRNA’er i p53

+ /+ HCT116 celler. α-tubulin blev anvendt som en belastning kontrol.

5-FU modstand er forbundet med de-regulering af Ca

2+ signalering

Identifikationen af ​​CALB2 rolle i formidlingen 5-FU-induceret apoptose sammen med dens Ca

2+ bindende egenskab førte os til at undersøge virkningen af ​​5-FU på Ca

2+ signalering i almindelighed. Transskriptionsprofilering eksperimenter blev udført i HCT116 parentale og 5-FU-resistente datterceller linjer før og efter behandling med 5 uM 5-FU i 24 timer. Microarray analyse identificeret 1389 gener i HCT116 parentale celler og 922-gener i datterceller 5-FU-resistente der er blevet omformet (≥1.5-fold, s 0,05) efter 5-FU-behandling. Også, 1329 gener identificeret som konstitutivt ændret (≥1.5-fold, s 0,05) mellem HCT116 parentale celler og 5-FU-resistente datterceller. De resulterende genelists blev derefter anvendt til pathway analyse under anvendelse af Kegg stifunktionen inden Genespring GX (v7.3.1). Pathway analyse identificeret 60 veje i HCT116 parentale celler og 24 veje i datterceller 5-FU-resistente der er blevet omformet (≥1.5-fold, s 0,05) efter 24 h 5 uM 5-FU behandling. Også, blev 49 veje identificeret som konstitutivt ændret (≥1.5-fold, s 0,05) mellem HCT116 parentale celler og 5-FU-resistente datterceller (tabel S1). Resultaterne fra pathway analyse viste, at 11 veje almindeligvis blev ændret i hvert af de tre genelists (tabel 1). Af særlig relevans for den aktuelle undersøgelse var Ca

2+ signal- og apoptoseveje, som er blevet omformet i både de parentale og 5-FU-resistente celler efter 5-FU behandling og også basalt dereguleret i 5-FU-resistente celler sammenlignet med de parentals. Dette antyder, at Ca

2+ signalering og apoptose kan være mediatorer af 5-FU følsomhed /resistens i denne indstilling.

CALB2 lyddæmpning ophæver 5-FU-induceret apoptose gennem indre vej

Da Ca

2+ bindende egenskaber CALB2 og integrerende rolle Ca

2+ signalering i den indre apoptotiske vej, rolle CALB2 i mediering 5-FU-induceret, mitokondrie-regulerede apoptose blev undersøgt yderligere. En gennemgang af de HCT116 subcellulære fraktioner viste, at i ubehandlede celler blev CALB2 placeret i cytosolen og var ikke forbundet med mitokondrier (fig. 4A). Men efter 72 h 5-FU behandling, CALB2 niveauer i cytosolen faldet, mens mitokondrielle CALB2 niveauer steg, hvilket viser 5-FU-induceret CALB2 translokation til mitokondrierne. Western blot analyse af α-tubulin og CoxIV demonstrerede renheden af ​​disse sub-cellulære fraktioner (fig. S2). Disse resultater viser en inducerbar associering mellem CALB2 og mitokondrierne som respons på 5-FU-behandling.

(A) Western blot-analyse af CALB2 i mitokondrie og cytosoliske fraktioner af p53

+ /+ HCT116 celler efter transfektion med kontrol siRNA (-) eller CALB2-targeting siRNA (+) og 72 h co-behandling med 5-FU. Cox IV blev anvendt som en mitokondrie ladningskontrol og a-tubulin blev anvendt som en cytosolisk loading kontrol. (B) TMRE flowcytometrisk analyse viser procentdelen af ​​isogene p53

+ /+ og p53

– /- HCT116 celler med tab af Δψ

m (% depolariseret) efter transfektion med kontrol siRNA (sc) eller CALB2 målretning siRNA (siCALB2) og 72 h co-behandling med 5 uM 5-FU. ** P 0,01, fejl søjler repræsenterer gennemsnit ± SEM. (C) TMRE flowcytometri eksperiment gentages med en anden siCALB2 sekvens. (D) Western blot-analyse af smac og cytochrom C i mitokondrie og cytosoliske fraktioner af 5-FU behandlede p53

+ /+ HCT116 celler. Cox IV og α-tubulin blev anvendt som indlæsning kontroller. (E) Caspase aktivitetsassays i p53

+ /+ HCT116 celler. RFU værdier var normaliseret til cellernes levedygtighed (MTT assay) og udtrykt som fold-change RFU i CALB2 tavshed celler i forhold til siRNA kontrol (SC) celler. Fejlsøjler repræsenterer middel ± SEM. (F) Annexin V /propidiumiodid flowcytometrisk analyse af apoptotisk p53

+ /+ HCT116 celler efter CALB2 eller XIAP silencing alene eller i kombination. Celler blev co-behandlet med 5 pM 5-FU i 72 timer som angivet. * P 0,05, ** p 0,01, fejl søjler repræsenterer gennemsnit ± SEM. (Indsat) Western blot-analyse af XIAP-ekspression efter transfektion med 10 nM kontrol siRNA (-) eller 10 nM XIAP målrettet siRNA (+). GAPDH blev anvendt som en loading kontrol.

Sammenhængen mellem CALB2 og mitokondrier følgende 5-FU behandling fik os til at yderligere at undersøge den rolle, som den indre apoptotiske vej i 5-FU-resistens. Den pro-apoptotiske Bcl-2 familiemedlem, Bax er et vigtigt initiator af mitokondrie-medieret apoptose. Vi undersøgte derfor HCT116 parentale og isogene Bax nul-celler efter behandling med den parentale ~IC

60 (72 h) dosis af 5-FU i 72 timer. Den parentale ~IC

60 (72 h) dosis af 5-FU forårsagede en -3-fold stigning i apoptose i HCT116 parentale cellelinje (p 0,01), men havde ingen effekt på niveauet af apoptose i Bax nul-celler (data ikke vist). Disse resultater bekræfter tidligere resultater [25], [26], at Bax og den iboende apoptosecyklus er store effektorer af 5-FU-induceret apoptose.

Tab af mitokondrie membran potentiale (Δ

ψ

m) med samtidig frigivelse af smac og cytochrom c efterfulgt af caspase 9 og observeres 3/7 aktivering under apoptose via den indre vej. Derfor blev TMRE, et fluorescerende farvestof til måling membranpotentiale af mitokondrier anvendes til at bestemme Δ

ψ

m ved flowcytometri (fig. 4B). 5-FU-induceret tab af Δ

ψ

m, som angivet ved ikke-fluorescerende celler, var signifikant reduceret (p 0,001) i CALB2-lyddæmpet p53

+ /+ HCT116-celler . 5-FU-induceret tab af Δ

ψ

m blev også signifikant reduceret (p 0,05) i CALB2-lyddæmpet p53

– /- celler. Denne effekt blev bekræftet med en anden CALB2 siRNA sekvens (fig. 4C), udelukker off-target effekter af CALB2 siRNA. Desuden Western blot-analyse af sub-cellulære fraktioner afslørede, at 5-FU-induceret tab af smac og cytochrom c fra mitochondriefraktionen blev ophævet i CALB2-lyddæmpet celler (Fig. 4D). Dette var samtidig med reducerede niveauer af smac og cytochrom c frigives til cytosolen i afhængighed af 5-FU i den CALB2-lyddæmpet celler. Endvidere 5-FU-induceret aktivering af caspase 9 og 3/7, målt ved luciferase reporter-baserede aktivitetsassays, blev signifikant reduceret i CALB2-lyddæmpet celler (Fig. 4E). Der blev ikke observeret nogen signifikante forskelle i caspase 8-aktivering mellem CALB2-lyddæmpet celler og siRNA kontroller efter 72 h 5 uM 5-FU behandling (data ikke vist). Disse resultater antyder endvidere en rolle for CALB2 ved regulering af 5-FU-induceret, er iboende apoptotiske vej.

5-FU følsomhed i CALB2-lyddæmpet celler gendannet ved XIAP co-silencing

ovenfor beskrevne forsøg viser, at opretholdelsen af ​​mitokondriel membranpotentiale, bevarelse af smac og cytochrom c fra mitochondrierne med ledsagende reduktion i caspaseaktivitet er alle forbundet med øget 5-FU resistens i CALB2-lyddæmpet celler, hvilket antyder dysfunktionel signalering via den intrinsiske apoptotiske vej. En tidligere undersøgelse fra vores gruppe viste, at kan omgås apoptose modstand knyttet til et kompromitteret iboende apoptosecyklus efter XIAP lyddæmpning. XIAP inhiberer caspase 9-aktivering gennem sin BIR3 domæne og caspase 3-aktivering gennem sin BIR2 domæne. Smac frigivelse forstyrrer interaktionen af ​​XIAP med caspase 9 og caspase 3 [27], hvilket fører til aktivering af disse caspaser og efterfølgende apoptose. Vi antaget at silencing XIAP kan overvinde resistens mod 5-FU forårsaget af CALB2 silencing ved bypass af blokeret den indre apoptotiske vej. Derfor blev effekten af ​​co-lyddæmpning XIAP og CALB2 på 5-FU respons undersøgt. XIAP silencing i HCT116-celler ved anvendelse af en XIAP målretning siRNA blev bekræftet ved Western blot (fig. 4F indsat). Den apoptotiske fraktion af celler blev identificeret ved flowcytometri med Annexin V og propidiumiodid. Denne gang vist, at 5-FU-induceret apoptose blev reduceret signifikant (p 0,05) i CALB2-lyddæmpet celler (Fig 4F.) Henviser til, at 5-FU induceret apoptose blev forøget betydeligt i XIAP-tavshed celler (p 0,05). Vigtigt er det, blev modstanden til 5-FU-induceret apoptose tillagt ved CALB2 silencing overvindes ved co-silencing XIAP (p 0,01). GAPDH blev anvendt som en loading kontrol.