PLoS ONE: CIP2A Influences overlevelse i Colon Cancer og er kritisk for Fastholdelse Myc Expression

Abstrakt

kræft inhibitor af protein fosfatase 2A (CIP2A) er en onkogen faktor, der stabiliserer c-myc protein. CIP2A overudtrykkes i flere tumorer, og ekspressionsniveauer er en uafhængig markør for langsigtede resultat. For at afgøre om

CIP2A

udtryk er forhøjet i tyktarmskræft, og om det kan tjene som en prognostisk markør for overlevelse, vi analyserede

CIP2A

mRNA ekspression ved real-time PCR i 104 tyktarmskræft prøver.

CIP2A

mRNA blev overudtrykt i tyktarmskræft prøver og

CIP2A

ekspressionsniveauerne korreleret signifikant med tumor stadie. Vi fandt, at

CIP2A

fungerer som en uafhængig prognostisk markør for sygdomsfri og samlet overlevelse. Endvidere undersøgte vi CIP2A-afhængige virkninger på niveauet af c-myc, Akt og celledeling i tre tyktarmskræft cellelinjer ved lyddæmpende CIP2A hjælp små forstyrrende (si) og korte hårnål (SH) RNA. Udtømning af CIP2A hæmmet væsentligt væksten af ​​kolon cellelinjer og reduceret c-myc-niveauer uden at påvirke udtryk eller funktion af den opstrøms regulatoriske kinase, Akt. Ekspression af CIP2A fandtes at være afhængig af MAPK aktivitet, der forbinder forhøjet c-myc udtryk dereguleret signaltransduktion i tyktarmskræft

Henvisning:. Wiegering A, Pfann C, Uthe FW, Otto C, Rycak L, Mäder U, et al. (2013) CIP2A Påvirker Overlevelse i Colon Cancer og er kritisk for Fastholdelse Myc Expression. PLoS ONE 8 (10): e75292. doi: 10,1371 /journal.pone.0075292

Redaktør: Gnanasekar Munirathinam, University of Illinois, USA

Modtaget: April 23, 2013; Accepteret: August 12, 2013; Udgivet: 1 oktober 2013

Copyright: © 2013 Wiegering et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. AW har støtte fra universitetet i Wurburg for en skærm i sammenligning med APC finansieringen nummer er: IZKF B-186. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet til denne undersøgelse. Denne udgivelse er finansieret af den tyske Research Foundation (DFG) og universitetet i Würzburg i finansieringen programmet Open Access Publishing. Ingen nuværende eksterne andre finansieringskilder til denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den mest. fælles gastrointestinal malignitet. Der er ca 664 tusind nye tilfælde hvert år på verdensplan. Halvdelen af ​​disse patienter vil dø af denne carcinom [1]. I øjeblikket standardbehandling er primær kirurgi og, afhængigt af tumor fase yderligere kemoterapi [2]. På grund af den høje recidivraten, er der behov for nye potentielle mål og prognostiske markører til at identificere patienter, der sandsynligvis vil drage fordel af yderligere behandling.

I 2007 Junttila og Westermarck identificeret kræft hæmmer af protein fosfatase 2A (CIP2A) som menneske oncoprotein. CIP2A overudtrykkes i hoved og hals pladecellecarcinomer og i coloncarcinomer [3]. CIP2A inhiberer proteinphosphatase 2A (PP2A). PP2A igen har en kritisk rolle i omsætningen af ​​c-myc oncoproteinet, da PP2A dephosphorylerer c-myc ved serin-62 (S62). Dephosphorylering ved S62 er påkrævet for ubiquitinering af c-Myc som ubiquitinligase Fbw7 og derfor initierer nedbrydning af c-Myc [4]. Overekspression af CIP2A inhiberer PP2A-aktivitet og derved stabiliserer c-myc. Derfor er dette inducerer immortalisering og malign transformation af humane celler [3]. c-myc selv forbliver det vigtigste onkogene driver i kolorektal cancer [5].

Nylige undersøgelser har vist, at CIP2A er overudtrykt i flere humane maligniteter. CIP2A ekspressionsniveauerne korrelerer med samlet overlevelse (OS) og sygdomsfri overlevelse (DFS) i gastriske carcinomer, i serøs ovariecancer, i renalcellecarcinom og brystkræft [6]; [7]; [8]; [9]. Ved kronisk myeloid leukæmi (CML),

CIP2A

ekspression til tiden diagnosetidspunktet er en prognostisk markør for udvikling af en blastkrise senere [10]. Desuden har nogle onkogene faktorer, herunder

Helicobacter pylori

papillomvirus 16 E7, opregulere ekspression af CIP2A og dette kan være afgørende for deres oncogene aktivitet [11]; [12].

For nylig to grupper rapporterede modstridende resultater vedrørende den prognostiske betydning af CIP2A i kolorektal cancer [13], [14]. Böckelman et al. studerede 752 patienter, men kunne ikke bestemme nogen prognostisk betydning; i modsætning Teng et al. undersøgt 167 patienter og identificeret CIP2A ekspression som prognostisk faktor for coloncarcinom.

Formålet med den foreliggende undersøgelse var at behandle relevansen af ​​CIP2A ekspression i colon cancer. Først analyserede vi udtryk for

CIP2A

i en kohorte af 104 kolon kræftpatienter med dokumenteret opfølgning og bekræftede sin overekspression. For det andet undersøgte vi sammenhængen mellem

CIP2A

mRNA-ekspression og klinisk-patologiske variabler; Endelig vi havde til formål at bestemme de molekylære veje, der regulerer CIP2A udtryk og reguleres af CIP2A. Vores data understøtter opfattelsen af, at dereguleret udtryk for CIP2A er en kritisk onkogen begivenhed i colon carcinoma.

Patienter og metoder

Patient prøver

Et hundrede og fire patienter med kolorektal cancer blev inkluderet i undersøgelsen. Alle patienter blev opereret på University Hospital i Würzburg, Tyskland, mellem 2003 og 2012. Ingen af ​​patienterne havde fået kemoterapi eller strålebehandling før operationen. Behandlinger efter operationen blev udført ifølge retningslinjerne for behandling af kolorektal cancer. Diagnosen blev bekræftet ved histopatologisk undersøgelse af enhederne. Efter operationen blev tumorprøver opsamlet og opbevaret i flydende nitrogen. Kliniske data for alle patienter blev indsamlet fra sygehusjournaler og efterfølgende optegnelser blev indsamlet via Comprehensive Cancer Center Mainfranken.

Etik Statement

Etisk godkendelse til denne forskning blev opnået fra Human Research Ethics Committee fra University of Würzburg. Alle patienter, der leveres tumorvæv og normalt tyktarm vævsprøver for denne forskning underskrevet en samtykkeerklæring før kirurgisk fjernelse af tarmkræft.

cellelinjer og Cell Culture

Caco2, HCT116, og SW620 celler blev indkøbt fra American Type Culture Collection. Alle celler blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt kalveserum und 1% penicillin /streptomycin.

Real-time Quantitative Reverse Transcription-PCR-analyse

genekspression af

CIP2A

blev analyseret under anvendelse real-time PCR. Totalt cellulært RNA blev ekstraheret fra tumorprøver og cellelinjer med RNeasy Minikit (Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Primer sæt (Qiagen), der målrettet

CIP2A

RNA blev designet af Biomers (Ulm, Tyskland). Matchet menneskelige kolon cDNA (Pharmingen, Heidelberg, Tyskland) fungerede som en positiv kontrol, standardiseret til baseline. Housekeeping gener, glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (

GAPDH

) og beta-2 mikroglobulin (

b2MG

) blev brugt som interne standarder for relativ kvantificering og cDNA kvalitetskontrol. Alle PCR-reaktioner blev udført med en DNA Engine Opticon 2 System (MJ Research, Biozym, Oldendorf, Tyskland). Relativ kvantificering, baseret på fold forskel, blev beregnet med tærskelcyklus (Ct) -metoden, udtrykt som 2

-ΔΔCt (primersekvens i tabel S1).

immunoblotanalyse

dyrkede celler blev skyllet tre gange med iskold PBS, høstet, og lyseret direkte i RIPA-prøvebuffer for Immunblotanalyse. Cellerester blev fjernet ved centrifugering ved 12.000 g i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatanten blev anvendt som totalt protein lysat. For hver prøve, 10 ug totalt protein lysat blev underkastet 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE), efterfulgt af Immunblotanalyse. Immunblots blev undersøgt med antistoffer mod CIP2A (A301-454A; Bethyl Laboratories), c-myc C33 (C33, # 42, Santa Cruz), beta-actin (AC-15 /A5441, Sigma), vinculin (V9131, Sigma), AKT, Pakt

473 (cs-9271), GSK3 (cs-9315), pGSK serin-9 (cs-9336), S6 (cs-2212), PS6 (cs-2215); pmTOR (cs-2917), og mTOR (cs-2972). Alle antistoffer var fra cellesignalering og blev anvendt ifølge producentens instruktioner. Blottene blev visualiseret med sekundære antistoffer (GE Healthcare) mod mus (NA9310) eller kanin (NA9340) primære antistoffer.

Immunhistokemi

CIP2A antistof var den samme som for Immunblotanalyse, isotypekontrol antistof blev købt hos eBioscience (San Diego, USA). Det sekundære antistof var et Cy3-konjugeret AffiniPure anti-kanin IgG ved en 1:200 fortynding. CIP2A farvning blev udført på frysemikrotomsnit af snap-frosne tyktarmskræft prøver udtrykker forskellige CIP2A mRNA-niveauer med nabolandet normal colon væv og 10 normale colon prøver. Cryostatsektioner (5 um) blev inkuberet med det primære antistof eller kontrol-antistof efterfulgt af inkubering med det sekundære Cy3-konjugeret antistof. Objektglas blev modfarvet med DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindoldihydrochlorid) (Sigma-Aldrich, Steinheim, Tyskland) og dækket med polyvinyl-alkohol monteringsmedium (DABCO, Sigma-Aldrich) og analyseret under anvendelse af et Zeiss-kamera (Oberkochen, Tyskland).

siRNA transfektion

For at lukke munden på genekspression, blev celler transficeret med små interfererende RNA (siRNA’er). On target plus SMART pool (Dharmacon) siRNA at målrette CIP2A (L-014135-01-005) og en kontrol siRNA (D-001810-10-05) blev anvendt. SiRNA pools (slutkoncentration 100 nM) blev transficeret ind i cellerne med RNAimax kit ifølge producentens protokol. Celler blev høstet 72 timer senere; ekspression af proteiner blev bestemt ved Immunblotanalyse.

shRNA og lentivirus

For at lukke munden CIP2A mRNA udtryk med korte hårnål RNA (shRNA) sekvenser, målretning

CIP2A

blev klonet ind i en lentivirusvektor (plko1 puro) ifølge fabrikantens protokol. Vektoren blev forbigående transficeret ind i HEK293T celler sammen med pakke plasmider. Efter 48 og 72 timer blev supernatanter indeholdende virusset opsamlet og filtreret. Tyktarmskræft cellelinjer blev inficeret med CIP2A lentivirus og 24 timer senere blev inficerede celler udvalgt med puromycin. Eksperimenter blev udført med de markerede celler.

Colony Formation Assay

2,5 × 10

3 celler inficeret med shRNA CIP2A eller Scr. blev udpladet på seks brønds plader. Kolonier blev farvet med 0,5% krystalviolet i 20% ethanol. Billeder blev taget og relativ massefylde bestemmes med ImageJ.

Statistisk analyse

univariate analyser til bestemmelse association med overlevelse blev vurderet med Kaplan-Meier kurver, og sammenligninger blev udført af Mann-Whitney U test. Multivariate analyser blev udført med en Cox proportionel risiko regressions model. P-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Angivelse af CIP2A og klinisk-patologisk variabler for tyktarmskræft Patienter

Angivelse af

CIP2A

mRNA. blev oprindeligt vurderet anvende ekspressionsvektorer datasæt afledt af en offentliggjort microarray analyse, som oprindeligt blev udført for at identificere prognostiske markører for colorektale carcinomer ifølge lymfeknudemetastase status [15]. Komplette datasæt (DFS, Tumor stadier), sammenligning

CIP2A

mRNA-ekspression i karcinom som i matchede tilstødende væv, var tilgængelige for 226 karcinomer.

CIP2A

udtryk blev testet ved hjælp af to uafhængige sonder til stede på dette array. Vi fandt ingen sammenhæng mellem

CIP2A

udtryk og alder ved diagnose, eller køn i dette datasæt, men

CIP2A

mRNA blev udtrykt ved højere niveauer i kolorektal cancer væv end i de matchede tilstødende væv i begge probesæt (data ikke vist). Interessant, høj

CIP2A

mRNA-ekspression korrelerer signifikant med reduceret sygdomsfri overlevelse (DFS) (fig. S1A, B). I separate analyser af patienter i Union for International Cancer Control (UICC) fase I (tumor infiltration til muscularis propria), II (tumor infiltration over muscularis propria) eller III (lymfeknude metastaser), kun patienter i stadie UICC III viste en signifikant korrelation mellem

CIP2A

udtryk og DFS. Til sammenligning patienter i stadie UICC I og II viste kun en svag sammenhæng mellem lav

CIP2A

udtryk og forlænget overlevelse, der ikke nåede statistisk signifikans. Dette kan skyldes det lille antal prøver og færre tilbagefald begivenheder i sammenligning med patienter i stadium UICC III (fig. S2A-C). Da DFS ikke kunne nås på scenen UICC IV (fjernmetastaser), var det ikke muligt at analysere sammenhængen af ​​

CIP2A

udtryk for overlevelsen af ​​patienter i stadie UICC IV med dette datasæt.

Vi yderligere analyseret

CIP2A

mRNA-niveauer i et uafhængigt sæt af 104 kolorektal cancer vævsprøver ved hjælp af en RT-QPCR tilgang. Ekspressionen af ​​

CIP2A

mRNA blev bestemt i forhold til to husholdningsgener, beta-2-mikroglobulin (

b2MG

) og glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (

GAPDH

). Ekspressionsniveauerne blev sammenlignet med medianen

CIP2A

mRNA-ekspression i normale slimhindevæv.

CIP2A

udtryk i forhold til

b2MG

eller i forhold til

GAPDH

viste en høj korrelation (R

2 = 0,86) (fig. S3). I overensstemmelse med tidligere resultater om CIP2A udtryk i kræft, fandt vi

CIP2A

mRNA-ekspression i 93 af 104 (89,4%) kræft prøver at være mindst fire gange højere end hos normale kolon slimhindevæv. Endvidere

CIP2A

ekspressionsniveau blev signifikant korreleret til UICC stadium lymfeknudemetastase, fjernt metastase, og histologisk tumor grading (fig. 1). Vi fandt ingen sammenhæng mellem

CIP2A

udtryk og patientens alder, køn eller cancer placering (højre vs. venstre colon) (tabel S2).

Panelerne viser kasse og knurhår plots dokumenterer relative

CIP2A

mRNA-niveauer i tumorer stratificeret efter UICC stadium (A) (UICC jeg vs. II p 0,0001 II vs. III p = 0,0046; III vs. IV p = 0,0002), i henhold til lymfeknuder node metastase (B N- vs. N + p .0001) ifølge fjernmetastaser (C; M0 vs. M1 p .0001), og i henhold til histologisk klassificering (D: G2 vs. G3 p = 0,0084) .

CIP2A mRNA ekspression og Postoperativ overlevelse for tyktarmskræft patienter

Samlet overlevelse (OS) blev anvendt til at overleve analyse. Samlet overlevelse blev defineret som tidsintervallet mellem kirurgi og tumor-associerede dødsfald. Univariate 1-, 3- og 5-års OS analyser viste, at patienter med en fremskreden primær tumor stadium, lymfeknudemetastase, fjernt metastase, avanceret UICC-stage, og høje histologiske kvaliteter havde værste resultater (tabel 1). For yderligere analyse, blev patienterne inddelt i to grupper, med

CIP2A

udtryk ovenfor (høj) eller under (lav) median værdi. Patienter med højt

CIP2A

mRNA-ekspression havde signifikant lavere OS end dem med lav

CIP2A

mRNA-ekspression (fig. 2A, B). Sammenligning patienter i UICC stadier I-IV separat med høj og lav

CIP2A

mRNA-ekspression, kun i UICC III fase, patienter med højt

CIP2A

niveauer havde en reduceret OS (Fig. 2C, D). Desuden en multivariat analyse viste, at et avanceret UICC-scenen og høj

CIP2A

udtryk (

CIP2A

over median og

CIP2A

udtryk brugt som en kontinuerlig markør) var uafhængige prognostiske faktorer for dårligt resultat hos patienter med tyktarmskræft (tabel 2).

graferne viser Kaplan-Meier kurver for OS efter

CIP2A

mRNA-ekspression. (Red:

CIP2A

mRNA-ekspression under medianen fold udtryk værdi på 10,5 over normal væv), grøn:

CIP2A

mRNA ekspression over medianen fold udtryk værdi på 10,5 over normal væv) (A B) Alle patienter med hensyn til

CIP2A

mRNA-ekspression normaliseret til husholdning gen (n = 75) (A: b2MG; B: GAPDH) (C) patienter i Stage UICC II med hensyn til

CIP2A

mRNA-ekspression normaliseret til husholdning gen GAPDH (n = 29) (D) Patienter i Stage UICC III med hensyn til

CIP2A

mRNA-ekspression normaliseret til husholdning gen GAPDH (n = 21).

For at teste, om

CIP2A

mRNA-ekspression er korreleret med CIP2A proteinekspression i CRC, ti normale slimhinde vævssnit, fire CRC vævsprøver udtrykker lav

CIP2A

mRNA-niveauer og fem vævsprøver udtrykker høj

CIP2A

mRNA niveauer blev farvet for CIP2A proteinekspression. I normale slimhinde vævssnit, ingen eller kun kunne konstateres en meget svag farvning for CIP2A (data ikke vist). Kræft udtrykker lave niveauer af

CIP2A

mRNA viste en svag farvning for CIP2A protein, at kræfttilfælde udtrykker høj

CIP2A

mRNA niveauer viste en stærk farvning for CIP2A protein. Denne Resultaterne viser, at CIP2A protein og mRNA niveauer korrelerer tæt

in vivo

. (Fig. 3).

paneler viser repræsentative eksempler på immunfluorescensfarvning, viser CIP2A proteinekspression i cancerceller fra patienter med lav (A + B) eller høj

CIP2A

(C + D ) mRNA-ekspression (A + C x100, B + D x200 forstørrelse).

effekter af CIP2A Udtømmelse på cellevækst og Myc Expression i CRC

Vi ønskede yderligere at afklare indflydelsen af CIP2A på sit mål proteiner i CRC-cellelinjer. Protein udtryk for CIP2A blev bemærkelsesværdigt reduceret i tre colon cellelinier (Caco2, HCT116 og SW620) efter behandling med specifikke siRNA mod

CIP2A

. Desuden CIP2A knockdown medført væsentlige begrænsninger i c-myc niveauer i alle tre cellelinier (figur 4A;. N = 3 for hver celle-linje). Dette skyldtes posttranskriptionel regulering af c-myc protein niveauer, da vi har registreret nogen ændring i

MYC

mRNA-ekspression (figur 4B,. N = 3). Tidligere undersøgelser indikerede, at CIP2A knockdown førte til en reduceret aktivitet af Akt, vist ved reduceret fosforylering på serin 473 (Pakt

473), og dermed, hæmmede PI3K /mTOR pathway. Men vi ikke afsløre eventuelle væsentlige ændringer i phosphoryleret Akt efter CIP2A knockdown i Caco2, HCT116 eller SW620 celler. Desuden fosforylering af de nedstrøms Akt mål, herunder pmTor, PS6, og pGsk3, blev ikke ændret signifikant efter knockdown af CIP2A (figur 4C;. N = 3 for hver cellelinie). Samlet set viser, at c-myc protein er under kontrol af CIP2A i CRC, mens PI3K /mTOR synes at være uafhængig af CIP2A.

(A) Immunoblotanalyse af CIP2A og c-myc proteinekspression i Caco2, HCT116 og SW620 celler transficeret med siRNA targeting CIP2A eller kontrol siRNA. Celler blev høstet 72 timer efter transfektion (n = 3 for hver cellelinie). (B) Real-time PCR-analyse af

CIP2A

og

c-myc

mRNA-ekspression i HCT116 celler transficeret med siRNA rettet mod CIP2A eller styre siRNA (n = 3). (C) Udtømning af CIP2A ændrer ikke aktiveringsstatus for AKT eller dens downstream targets. Panelerne viser immunblots af de angivne proteiner og phosphorylerede proteiner (p) i Caco2, HCT116 og SW620-celler transficeret med siRNA targeting CIP2A eller kontrol siRNA som før (n = 3 for hver cellelinie).

Fordi siRNA’er er typisk tabt over tid, og at udelukke off-target effekter, vi testede to forskellige shRNAs rettet

CIP2A

at evaluere væksthæmmende effekt af CIP2A knockdown. HCT116 celler blev inficeret lentiviral med vektorer, som bærer shRNAs mod

CIP2A

. Immunoblot analyser viste betydelig knockdown af CIP2A protein med tilsvarende reduktion i c-myc protein niveauer (figur 5A;. N = 2). Følgelig blev celleproliferation markant ændret hos celler inficeret med shRNA mod

CIP2A

(figur 5B;. N = 2).

(A) Immunoblotanalyse af CIP2A og c-myc proteinekspression i HCT116 celler inficeret lentiviral med shRNA målrettet CIP2A eller en ctr. shRNA. Tallene under linjer angiver c-myc proteinekspression i forhold til c-myc-niveauer i kontrolceller (n = 2). (B) Colony dannelse af HCT116 celler efter 7 dage. (

Top

), tæthed af kolonier farvet med krystalviolet; (

bund

), repræsentant for de angivne kulturer (n = 3).

CIP2A Expression er Nedstrøms MEK kinase i CRC

For at identificere potentielle opstrøms regulatorer af

CIP2A

ekspression behandlede vi Caco2, HCT116 og SW620 celler med UO126, en velkarakteriseret MEK1 /2-inhibitor [16]. Behandling med UO126 i 24 timer førte til en signifikant reduktion i

CIP2A

mRNA og CIP2A proteinekspression sammenlignet med DMSO-behandlede celler (fig 6A, B;. N = 3 for hver cellelinie). Denne effekt var mere udtalt i celler, der nærede en MAPK pathway mutation, såsom SW620 (

KRAS

) og HCT116 (

KRAS

), end i Caco2 celler, der er vildtype for

KRAS

.

Caco2, HCT116 og SW620-celler blev behandlet med DMSO eller MEK-inhibitor UO126 i 24 (n = 3 for hver cellelinie). (A) Immunoblotanalyse af CIP2A og p-ERK proteinekspression i Caco2, HCT116 og SW620. (B) Real-time PCR-analyse af

CIP2A

mRNA-ekspression (* 0,05; ** 0,005)

Diskussion

For nylig “The. cancer Genome Atlas Network “viste, deregulerede c-Myc-ekspression er kendetegnende for stort set alle CRCs, uafhængigt af sættet af specifikke mutationer, som er til stede i hver tumor [5]. For eksempel mutationer i tumor suppressor

APC

onkogenet

KRAS

føre til en opregulering af

MYC

mRNA [5]. På posttranskriptionel niveau, tabet af miR34 familien ved hypermethylering, som forekommer i over 90% af alle CRC, stabiliserer

MYC

mRNA [17], [18]. Desuden en musemodel for tyktarmskræft drevet af tab af

APC

viser, at kolon tumor dannelse afhænger af kontinuerlig c-myc udtryk [19].

Indtil videre lidt om den posttranslationelle regulering af c-myc-niveauer i CRC. I den foreliggende undersøgelse, vi demonstreret, at

CIP2A

ekspression er forhøjet i colon carcinoma prøver, sammenlignet med dets ekspression i normale, tyktarm væv, og at

CIP2A

ekspression er negativt korreleret til både OS og kliniske patologiske parametre. Da der ikke er validerede cut-off point for

CIP2A

ekspressionsniveauerne at afklare høj vs. lav udtryk grupper, vi brugte medianen mRNA udtryk niveau som cut-off point. Trods et relativt lavt antal patienter i vores undersøgelse, og derfor et relativt lavt antal kræftrelaterede dødsfald i undergruppe analyser, kunne vi vise en signifikant sammenhæng af

CIP2A

niveauer med tumor-associerede overlevelse.

To tidligere undersøgelser analyserede ekspressionsniveauer af CIP2A i CRC og demonstrerede forbedrede niveauer i CRC i forhold til normal slimhinde, i overensstemmelse med resultaterne rapporteret her [13], [14]. Endvidere har en tæt sammenhæng mellem CIP2A og Myc niveauer blevet bemærket før [3], [13] og vi viser her, at forhøjede niveauer af CIP2A er forpligtet til at opretholde Myc udtryk i CRC-cellelinjer. Overraskende korrelation med OS blev set i kun én af de tidligere undersøgelser [14]. Selv om vi ikke kender den præcise årsag til uoverensstemmelsen, vi bemærke, at både Teng et al. [14] og vores undersøgelse tildelt en relativt høj procentdel af patienter til lav ekspression gruppen (68 og 50%), hvorimod Böckelman et al. [13] defineres kun 15% af patienterne så lave CIP2A udtryk tumorer. Vi foreslår, at disse forskelle i lagdeling af patienter i henhold til CIP2A niveauer kan forklare de forskellige resultater. Forestillingen om, at CIP2A er overudtrykt i tyktarmskræft, og dermed forbedre Myc protein niveauer og påvirke tumor relateret overlevelse, er i overensstemmelse med tidligere resultater i andre faste [6] tumorer; [7]; [8]; [9]. En prospektiv undersøgelse vil være forpligtet til at vurdere, om CIP2A udtryk på mRNA eller protein-niveau kan tjene som en prædiktiv markør for overlevelsen af ​​patienter med CRC.

Det blev vist tidligere, at CIP2A stabiliserer c-myc ved at hæmme dets PP2A medieret nedbrydning i tumorceller [3]. I overensstemmelse med denne model, den foreliggende undersøgelse viser, at nedregulering af c-myc-proteinet iagttages, når CIP2A er bragt til tavshed med siRNA’er eller shRNAs i colorektale carcinomaceller. På grund af det faktum, at vi brugte cellelinjer huser forskellige mutationer for onkogen vej almindeligvis muteret i CRC (Caco2: APC

mut, KRAS

vægt, PI3K

vægt; HCT116: APC

vægt, SS catenin

mut, KRAS

mut, PI3K

mut; SW620: APC

mut, KRAS

mut, PI3K

wt), vi postulerer, at afhængigheden af ​​c-myc proteinekspression på CIP2A er uafhængig af tilstedeværelsen af ​​mutationer i WNT, PI3K /mTOR eller MAPK-veje, men det bliver nødt til at blive evalueret yderligere. Vi fandt også, at shRNA-medieret nedbrydning af CIP2A i HCT116 coloncarcinomceller markant reduceret deres vækstpotentiale. Dette er i overensstemmelse med rapporter om, at CIP2A hæmning resulterede i vækst anholdelse og formindsket klonogenisk potentiale i flere andre maligniteter [6]; [7]; [8].

PP2A dephosphorylerer Pakt og CIP2A forbedrer PI3K /mTOR signalering ved at hæmme PP2A medieret dephosphorylering af Pakt i hepatocellulære karcinomer (HCC) [20]; [21], [22]. Vores resultater viser, at udtømning af CIP2A udtryk i kolorektal cancer celler ikke påvirker Akt signalering, i modsætning til observationer i HCC celler. Vi fandt også ingen eller kun mindre ændringer i Pakt niveauer eller kendte Akt downstream mål. Mest sandsynligt, derfor PP2A aktivitet mod nogle af sine substrater (AKT) varierer mellem forskellige væv.

vides kun lidt om den mekanisme, der ligger til grund fremme ekspressionen af ​​de CIP2A i maligne celler. I mavekræft,

Helicobacter pylori

infektioner opregulere

CIP2A

udtryk gennem en Src /Erk afhængige vej [11]. Den humane papillomavirus 16E7 oncoproteinet opregulerer

CIP2A

i livmoderhalskræft [12]. Det er i øjeblikket uklart, hvad der bidrager til CIP2A overekspression i tyktarmskræft. To resultater støtter den hypotese, at CIP2A udtryk i tyktarmskræft er nedstrøms for MAPK pathway. Først viste tidligere arbejde, at CIP2A udtryk er positivt korreleret med EGFR [13]. Den MAPK-vejen er en af ​​de vigtigste mål for EGF-signalering. For det andet viste vi, at CIP2A nedreguleres efter inhibere MAPK-vejen i tre coloncarcinom cellelinier; nedregulering i cellelinjer huser en

KRAS

mutation (HCT116, SW620) er mere udtalt end i Caco2 ikke huser en MAPK-pathway mutation. Induktion af CIP2A kan derfor være en kritisk mediator, der forbinder dereguleret mitogenisk signalering til øget c-myc-ekspression i CRC.

Som konklusion, at resultaterne af denne undersøgelse viser, at

CIP2A

er forbundet med kolorektal cancer relateret overlevelse. Høj udtryk for

CIP2A

mRNA er korreleret med reduceret DFS og OS. Derfor

CIP2A

repræsenterer en ny prognostisk faktor i diagnosen af ​​kolorektal cancer. Derudover kan CIP2A være en lovende terapeutisk mål i udviklingen af ​​behandlinger for tarmkræft.

Støtte oplysninger

figur S1.

Kaplan-Meier kurver for sygdomsfri overlevelse for alle patienter (n = 226) med hensyn til

CIP2A

mRNA-ekspression status i offentliggjorte microarray analyse. (A B) DFS af alle patienter i henhold til microarray sonde sæt

doi: 10.1371 /journal.pone.0075292.s001

(EPS)

Figur S2..

sygdomsfri overlevelse for patienter med tyktarmskræft i UICC I-III fase, grupperet efter

CIP2A

mRNA udtryk status. (A) UICC I; (B) UICC II; . (C) UICC III

doi: 10,1371 /journal.pone.0075292.s002

(EPS)

Figur S3.

Lineær regressionsanalyse af relativ

CIP2A

mRNA-ekspression normaliseret til to husholdning gener, b2MG og GAPDH (n = 104; R

2 = 0,86). Den lineære regression er stærkt signifikant (p 0,001)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0075292.s003

(PSD)

tabel S1. .

Primer sekvenser

doi: 10,1371 /journal.pone.0075292.s004

(DOCX)

tabel S2.

Karakteristik af patienter med CRC og association mellem

CIP2A

udtryk og clinicopathologic variabler (lymphovascular invasion og placering blev dokumenteret for 100 patienter)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0075292.s005

(DOCX)

tak

Vi takker Christian Jurowich, Christoph Isbert og Andreas Thalheimer til indsamling tumorprøver.