PLoS ONE: FGFR2 forstærkes i NCI-H716 Kolorektal Cancer Cell Line og er nødvendig for vækst og Survival

Abstrakt

Aberrant kinase aktivering som følge af mutation, forstærkning, eller translokation kan drive vækst og overlevelse i et undergruppe af human cancer.

FGFR2

forstærkes i bryst- og mavekræft, og vi rapporterer her den første karakterisering af

FGFR2

genamplifikation i kolorektal cancer i NCI-H716 kolorektal cancer cellelinje.

FGFR2

er stærkt udtrykt og aktiveret i NCI-H716 celler, og FGFR selektiv lille molekyle inhibitorer eller FGFR2 shRNA stærkt hæmmet cellelevedygtighed

in vitro

, der angiver “afhængighed” af NCI-H716 celler til FGFR2. NCI-H716 vækst i en xenograft model blev også inhiberet af en FGFR lille molekyle inhibitor. FGFR2 var nødvendig for aktivering af flere nedstrøms signalering proteiner, herunder AKT, ERK, S6RP og NFKB. Hæmning af downstream kinaser såsom AKT eller ERK alene havde beskeden effekt på spredning, mens kombineret hæmning af AKT og ERK signalering resulterede i et tab af levedygtighed ligner FGFR2 hæmning. Vi identificerede forhøjede

FGFR2

udtryk i en lille delmængde af primær kolorektal cancer, men

FGFR2

forstærkning blev ikke observeret. Selv

FGFR2

amplifikation er ikke almindelige i almen coloncancer eller lymfeknude og levermetastaser, andre delmængder af kolorektal cancer, såsom ascites, hvorfra NCI-H716 cellelinien blev afledt, er endnu ikke testet. Disse resultater tyder på, at nye FGFR inhibitor terapi kan have effekt i en delmængde af tyktarmskræft drevet af

FGFR2

forstærkning

Henvisning:. Mathur A, Ware C, Davis L, Gazdar A, Pan BS , Lutterbach B (2014)

FGFR2

forstærkes i NCI-H716 Kolorektal Cancer Cell line og er nødvendig for vækst og overlevelse. PLoS ONE 9 (6): e98515. doi: 10,1371 /journal.pone.0098515

Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: Februar 14, 2014 Accepteret: Maj 2, 2014 Udgivet: 26 jun 2014

Copyright: © 2014 Mathur et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Merck Research Labs. Den bidragyder ydet støtte i form af løn til forfattere (AM, CW, LD, BP, BL), men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

Konkurrerende interesser: Forfattere undtagen AG er medarbejdere i Merck Research Labs. AM, CW, LD, BP, og BL har konkurrerende interesser som medarbejdere i Merck, men erklærer, at dette tilhørsforhold ikke ændrer deres tilslutning til PLoS ONE politikker på datadeling og materialer. Der er ingen begrænsninger på deling af data og /eller materialer.

Introduktion

Avanceret, er sent colorectal cancer forbundet med betydelig mortalitet og er fortsat et udækket medicinsk behov. Tidlig diagnose resulterer i en yderst gunstig prognose, således at fase 1 og fase 2 sygdom har en 80-90% for fem års overlevelse. Derimod stadie 3 og stadie 4 metastatisk sygdom er forbundet med fem års overlevelse på 60% og 8% [1]. Genetiske afvigelser opstår i tidligt stadie sygdommen omfatter

APC

mutationer, mens

KRAS, BRAF, p53

, og

PIK3CA

mutationer findes i senere stadier af tumor udvikling [2] – [4]. Imidlertid har disse genmutationer ikke påvirket behandling af kolorektal cancer, fordi de enten tab af funktion mutationer (

APC, p53

) eller ikke reagerer på MEK eller PI3K hæmmere (

BRAF, KRAS, PIK3CA

). Selvom tyrosinkinase forstærkning, translokation, eller mutationer er ikke almindelige i kolorektal cancer,

EGFR

forstærkning kan findes i en delmængde af tarmkræft, [5], [6]. EGFR inhiberende antistoffer såsom Cetuximab kan føre til reaktioner og overlevelse fordel i

KRAS

vildtype kræft, men den rolle,

EGFR

forstærkning er ikke klart [7].

ErbB2

forstærkning er også blevet rapporteret [6], [8], og kan være forbundet med respons på Trastuzumab [9].

FGFR2

forstærkning er blevet beskrevet i 5% af gastrisk kræft [10] og 1-4% af brystkræft [11], [12], men er ikke blevet rapporteret i tyktarmskræft. Breast og gastrisk cancer cellelinjer huser

FGFR2

forstærkning er meget følsomme over for

FGFR2

hæmmere i prækliniske modeller [13] – [15], og forstærkning i både bryst og mavekræft er stærkt forbundet med dårligt differentierede, sent stadie tumorer [11], [16]. I mavekræft

FGFR2

forstærkning kan forekomme i en metastatisk tumor, men ikke i den tilhørende primære tumor, også i overensstemmelse med en rolle i metastatisk og sent kræft [16], [17].

Her definerer vi en roman

FGFR2

forstærkning i NCI-H716 kolorektal cancer cellelinje, der blev afledt af ascites fra en dårligt differentieret kolon adenocarcinom.

FGFR2

gen amplificeringen resulterer i FGFR2 overekspression og konstitutiv aktivering. Vigtigere er det, NCI-H716 cellevækst og overlevelse

in vitro

og i en muse xenograftmodel var afhængige af FGFR2. Immunhistokemi afslørede

FGFR2

overekspression i en delmængde af primær tyktarmskræft, men vi havde ikke observere forstærkning. Men disse arrays ikke indeholde ascites-afledte prøver er repræsentative for oprindelsen af ​​NCI-H716 celler. Selvom

FGFR2

forstærkning og overekspression er sjældne i kolorektal cancer, vores

in vitro

in vivo

modeller tyder på, at nye FGFR hæmmere kunne have effekt i en delmængde af kolorektal cancer huser denne forstærkning.

Materialer og metoder

Cellelinjer og reagenser

cellelinier fra American Type Culture Collection (ATCC) og blev opretholdt i RPMI plus 10% føtalt kalv serum og 100 ug /ml Pennicillin /streptavidin (Sigma). PD173074 var fra Sigma (St. Louis, MO). MK2461 var fra Merck [18].

FISH-analyse

DNA FISH blev udført på NCI-H716 celler behandlet med colcemid (0,02 mg /ml i 3 timer) og microarray væv kerner som beskrevet tidligere [19], [20] ved hjælp af bakteriel kunstige kromosom kloner RP11-62L18 for

FGFR2

sonder. Denne FISH-proben indeholder den genomiske sekvens af CHR10: 123,224,100-123,398,498, som omfatter hele den FGFR2 genet ved CHR10: 123,237,844-123,353,481. Sonder blev mærket direkte ved hjælp af Spectrum Orange dUTP og Spectrum Green dUTP (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL).

Immunhistokemi

H80-antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californien) var anvendt i en fortynding på 1:50 på NCI-H716 xenograft og Asterand mavekræft sektioner og fortyndet 1:20 på array-kerner fra US Biomax Inc (Rockville, MD): CO802 (78 primære tumorer, 2 normal), CO702 ( 69 prøver-30 primære tumorer, 25 lymfeknuder, 8 levermetastaser 9 normal), CO992 (33 primære tumorer og 33 lymfeknudemetastaser), BCO5115 (69 i alt, 60 primære tumorer, 7 levermetastaser), i disse arrays, 20 patienter var under 35 år. Farvning blev udført på en Ventana Discovery XT anvendelse af kanin Ultra-HRP. Detektion var med ChromoMap kit (Ventana Molecular Discovery Systems, Tucson, AZ)

shRNA produktion og infektion

shRNA sekvenser var:.

F1: GCCAACCTCTCGAACAGTATTCAAGAGATACTGTTCGAGAGGTTGGC,

F2: GGACTTGGTGTCATGCACCTTCAAGAGAGGTGCATGACACCAAGTCC

F3: GGACTGTAGACAGTGAAACTTCAAGAGAGTTTCACTGTCTACAGTCC

F4: GAGATTGAGGTTCTCTATATTCAAGAGATATAGAGAACCTCAATCTC

Luciferase: CACCGGTGTTGTAACAATATCGACGAATCGATATTGTTACAACACC

AAA. Scrambled: CACCGTCTCCACGCGCAGTACATTTCGAAAAATGTACTGCGCGTG

GAGACAAAA Oligo blev udglødet og 5’BbsI og 3 ‘SpeI bruges til at klone i en proprietær ENTR plasmid efterfulgt af omdannelse til pLenti6 /Block-det-DEST (Invitrogen, Grand Island NY) ved hjælp af Gateway ( Invitrogen, Grand Island NY). Virus produktion og titer bestemmelse var som anvist af Invitrogen. Til dyrkning analyse blev celler podet med 4000 celler /brønd i plader med 96 brønde, mens det for Western-analyse celler blev podet ved 40.000 celler i 12 brønds plader. Virale supernatanter blev tilsat i 20 timer i nærværelse af 8 ug /ml polybren, på hvilket tidspunkt virale supernatanter blev fjernet og erstattet med vækstmedium indeholdende 10% føtalt bovint serum. Lysater blev forberedt til western analyse 48 timer senere.

Compound behandling og vækst analyser

PD173074 (Sigma, St. Louis MO) og MK2461 blev fortyndet i DMSO til at oprette en titrering serie som tidligere beskrevet [ ,,,0],14]. Gleevec, Lapatinib, PHS665753, og PD168393 var fra ChemieTek (Indianapolis IN) Anti IGF1R antistof AF305 var fra R /D-systemer. Cellerne blev behandlet i tredobbelte brønde, og efter 3 dage celleantal blev kvantificeret under anvendelse af Vialight reagens (Vialight assaykit, Cambrex, Rockland ME). Luminescens blev kvantificeret med en Topcount NXT HTS (Perkin Elmer, Waltham, MA) og IC50 afgørelser, der træffes ved hjælp af logistisk 4 parameter kurvetilpasning. Til kvantificering af phosphotyrosin i FGFR2 og blots blev scannet og kvantificeret ved anvendelse af ImageQuant software. Værdier svarende til band intensitet blev plottet mod koncentrationen stof til at etablere en IC50 på narkotika hæmning. ScanMAX profilering af 442 kinaser var på Ambit Biosciences (San Diego, CA).

Western blotting, immunfældning antistoffer, og vækstfaktorer

Lysater udarbejdet i 30 mmol /l Tris-HCI, pH 7,5, 50 mmol /l NaCl, 5 mmol /l EDTA, 50 mmol /l NaF, 30 mmol /l Nappi, 1% Triton, 0,5% IGEPAL, 10% glycerol, 1 mmol /l vanadat, 1 mmol /L bpPhen (Calbiochem), og protease-inhibitor (Roche) og western blotting og immunpræcipitation blev som beskrevet [21], [22]. Antistoffer mod FGFR2 inkluderet N-terminus MAB6841 (R & D Systems, Minneapolis, MN) og H80 (Santa Cruz), C-terminus C-20 (Santa Cruz) og Y653 /654 specifikke 3471 ((Cell Signaling Technology, (CST) , Danvers MA.)). Yderligere antistoffer fra CST var: Pakt S473 (4060), AKT (9272), pERK (4370), ERK (9102), pS6RP S235 /236 (2217), S6RP (2211), kløvet PARP (9542), beta actin (4967 ), p105 NFKB S933, p105 NFKB, GAB1 Y672, FRS2 Y436, SHC Y317 CRKII Y221, PRAS40 T246, PDK1 S241, GSKIII S9, PKC S660, RSK S227 (PDK1 stedet), RSK S359 /363 (ERK stedet), AMPK T172 (LKB site) og GAPDH. 4G10 phosphotyrosin antistof var fra Upstate (Charlottesville VA). Rekombinant FGF2 var fra R &. D Systems (Minneapolis MN)

Flowcytometri

En Becton Dickinson FACS Calibur blev brugt til flowcytometri på NCI-H716 celler. Celler blev fikseret natten over i 1 ml iskold 70% ethanol og derefter vasket i PBS og farvet med PI /RNAse (BD Pharmingen, San Diego) i 3 timer. ModFit software blev anvendt til at bestemme relative fordeling i G1, S, G2 /M, og manuel gating at bestemme subG1 indhold.

xenotransplantat

Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med IACUC (Institutional Animal Care og Brug Udvalg) retningslinjer og eksperimenter blev godkendt af Merck forskning labs etik bedømmelsesudvalg. Systematisk overvågning og registrering af velfærd mus var ifølge ankommer retningslinier for udseende, størrelse, pels, kropsholdning, gangart, aktivitetsniveau, samspillet med miljøet og kliniske tegn. Eutanasi blev coducted ved eksponere dyrene til CO

2, indtil der blev observeret fuldstændig ophør af åndedræt i mindst 2 minutter (i alt ca. 5 til 10 minutter). Dyr blev undersøgt visuelt for fravær af bevægelse og åndedræt. Død blev også sikret ved fjernelse af tumorvæv eller flere organer.

5 × 10

6 NCI-H716-celler blev implanteret subkutant i BALB /c nøgne mus. Efter at have nået 200 mm

3, tumorer blev behandlet med vehikel, 300 mg /kg eller 800 mg /kg en gang dagligt i 24 dage. 10 mus var i hver gruppe, og tumorstørrelse blev bestemt ved caliper måling. Ingen dyr oplevede mere end 5% vægttab under behandlinger. FGFR2, AKT, og ERK hæmning

in vivo

blev målt ved at dosere dyr og indsamling tumorer på 4 og 24 timer efter behandlingen. Tumorer blev anbragt i flydende nitrogen og behandles af forstyrrelser i 600 ul lysepuffer i et væv Lyzer (Qiagen). Lysater blev kvantificeret og behandlet til SDS-PAGE og western blotting som beskrevet for cellelysater.

Resultater

FGFR2

forstærkes, og aktiveres i NCI-H716 celler

Da

FGFR2

forstærkning kan køre gastrisk og brystkræft cellevækst, søgte vi efter yderligere cellelinjer, som skjuler ens

FGFR2

kopi gevinst. Mikromatrice bekræftet kendt

FGFR2

forstærkning i KATOIII og SNU16 mavekræft cellelinjer [23], [24] og identificeret en roman særdeles samlingspunkt forstærkning i NCI-H716 kolorektal cancer cellelinje (figur S1A i File S1. Den Oncomine database [25] afslørede også høj

FGFR2

Messager RNA-ekspression i NCI-H716 celler. Fluorescerende in situ hybridisering (FISH) afslørede slående

FGFR2

kopi gevinst og gen dobbeltarbejde i homogent farvning regioner (figur 1A). den grønne centromer sonde afslørede ikke kopi gevinst, i overensstemmelse med den meget omdrejningspunkt amplikon på

FGFR2

locus (figur S1A i File S1). En FISH probe til

Met

viste ingen kopi gevinst i NCI-H716 på dette kromosom 7 locus, og

FGFR2

sonde viste ikke forstærkning i DLD1 tyktarmscancerceller mangler

FGFR2

kopi gevinst (data ikke vist). Vi derefter sammenlignet

FGFR2

udtryk og aktivering i NCI-H716 celler i forhold til et panel af ni kolorektal cancer cellelinjer uden

FGFR2

forstærkning, og vi fandt slående FGFR2 overekspression og fosforylering kun i NCI-H716 celler (Figur 1B). FGF2 ikke yderligere aktiverer FGFR2 i NCI-H716 celler, afslører, at receptoren er maksimalt phosphoryleret (data ikke vist). Niveauet af FGFR2 aktivering i NCI-H716 celler svarede til niveauet i

FGFR2

forstærket SNU16 mavekræft cellelinje (figur S2 i File S1). Vi konkluderer, at i vores panel af tyktarmskræft cellelinjer,

FGFR2

er stærkt overudtrykt og aktiveres kun i NCI-H716 celler.

A. NCI-H716-celler blev behandlet med colcemid (0,02 ug /ml i 3 timer), fikseret med methanol /eddikesyre, og falder ned på et mikroskopobjektglas ifølge materialer og metoder. Bakteriel kunstige kromosom klon RP11-62L18 blev mærket med Spectrum Orange dUTP og en centromer probe blev mærket med Spectrum Green dUTP (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL) og hybridiseret til faste celler. Rød indikerer

FGFR2

og grøn indikerer Centromer. B. FGFR2 er overudtrykt og indeholder høje niveauer af tyrosinphosphorylering i NCI-H716 cellelinien. A, Cellelysater (tilberedt efter materialer og metoder) fra ubehandlet eller FGF2 behandlet (30 ng /ml, 5 minutter) blev cellerne lyseret og protein koncentration blev bestemt med BCA kit (Pierce Thermo Fisher Rockford Ill). Lige lysat mængder (50 ug) blev underkastet SDS-PAGE og western blotting med FGFR2 antistoffer fremstillet mod N-terminalen (H80. MAB6841), C-terminalen (C20) og aktivering loop phosphorylering Y653 /654 (3471, s-FGFR2) og actin.

FGFR2 er nødvendig for væksten af ​​NCI-H716 celler

kan være påkrævet FGFR2

forstærkning og aktivering i NCI-H716 celler foreslået denne kinase for celle vækst. Vi behandlede NCI-H716-celler med to FGFR småmolekylære inhibitorer for at teste en rolle for FGFR2 i NCI-H716 cellevækst. I et stort panel af kinses, fandt vi PD173074 at være en meget selektiv hæmmer af FGFR-1, -2, -3 [14], og vi bekræftede yderligere den bemærkelsesværdige selektivitet her med en separat store panel af kinaser (figur S3 i File S1). Vi har også behandlet celler med MK2461, en Met kinase lille molekyle inhibitor som også hæmmer FGFR2 fosforylering og vækst af

FGFR2

forstærkede gastriske og brystcancercellelinier [13]. PD173074 og MK2461 potent hæmmede FGFR2 fosforylering i NCI-H716-celler (figur 2A) med en IC50 på 18 nM (PD173074) og 165 nM (MK2461, figur S4A i File S1). Begge forbindelser potent inhiberede NCI-H716 vækst med IC50-værdier på 25 nM for PD173074 og 130 nM for MK2461 (figur 2B). Vigtigere er det, IC50 for væksthæmning og FGFR2 phosphorylering hæmning var ens, og begge værdier var også lignende værdier, der tidligere er opnået for SNU16 og KATOIII cellelinier [13], [14]. Under observeret kraftig inhibering af NCI-H716 cellevækst, vi næste testet begge forbindelser til inhibering i et panel af coloncancer-cellelinjer. Begge FGFR inhibitorforbindelser vises en slående selektivitet for hæmning af NCI-H716 celler, med mere end 80-fold (MK2461) eller 400 gange (PD173074) lavere IC50 i forhold til ikke-

FGFR2

forstærkede kolon cellelinjer ( Figur 2C). FGFR inhibitor AZD4547 også selektivt inhiberede vækst i NCI-H716-celler (data ikke vist). Endelig blev NCI-H716 vækst ikke hæmmes ved behandling med kinase inhibitor forbindelser mangler FGFR hæmning, herunder Tarceva, Lapatinib, Gleevec, PHA665752 (en Met inhibitor) PD168393 (en irreversibel EGFR inhibitor) og et IGF1R hæmmende antistof (Figur s4b i File S1 ).

A. PD173074 og MK2461 inhibere FGFR2 phosphorylering. Cellerne blev behandlet i 1 time med en titrering af PD173074 som beskrevet i Materialer og metoder. Lysater blev fremstillet og 50 ug protein blev underkastet SDS-PAGE og western blotting med phospho Y653 /654 FGFR og MAB6841 samlede FGFR2 antistof. B. PD173074 og MK2461 hæmme NCI-H716 cellevækst. Cellelinier blev udpladet med 4000 celler /brønd og inkuberet natten over. NCI-H716-celler blev behandlet med en titrering af PD173074 som beskrevet i Materialer og Metoder. Cellevækst blev målt med Vialight reagens, og væksten blev præsenteret i forhold til ubehandlede celler. C. PD173074 og MK2461 selektivt hæmmer væksten af ​​NCI-H716 celler. Colon cancercellelinjer anført blev udpladet med 4000 celler /brønd og 24 timer senere blev behandlet med en titrering af forbindelser. 4 dage senere blev cellevækst målt med vialight og IC50-værdier blev beregnet ud fra grafen pad prisme. D.

FGFR2

shRNA nedsætter FGFR2 protein i NCI-H716 celler.

FGFR2

shRNA var forberedt og NCI-H716 celler blev inficeret som beskrevet i metoder. Venstre, blev FGFR2 ekspression analyseret med phospho Y653 /654 og totalt protein med MAB6841. E. Vækst blev analyseret 5 dage efter infektion med Vialight reagens.

Vi bekræftede endvidere en kritisk rolle for FGFR2 i NCI-H716 cellevækst ved hjælp af

FGFR2

shRNA. Vi identificerede først to hårnåle (F2 og F4, figur 2D) med effektiv

FGFR2

knockdown. Disse shRNA hårnåle forårsaget potent vækstinhibering i NCI-H716 celler (Figur 2E). Derimod kontrol shRNA og shRNA der ikke sænke FGFR2 protein niveauer (V og F1) ikke hæmmer væksten af ​​NCI-H716-celler (figur 2D, E).

Flere signalering proteiner, herunder AKT, ERK og NFKB aktiveres af FGFR2

Vi har tidligere rapporteret, at

FGFR2

aktiveret AKT og ERK signalveje i FGFR2 forstærket gastrisk cancer cellelinjer [14]. Vi definerede derfor FGFR2 signaleringsnetværket i NCI-H716-celler ved at analysere phosphorylering af multiple adapter proteiner og signalveje efter FGFR2 inhibering. Efter to timers behandling med en titrering af MK2461 og PD173074 observerede vi tab af fosforylering i kinase adapter proteiner GAB1 /2, FRS1 /2, og SHC. Vi observerede også tab af ERK og AKT phosphorylering (figur 3A). Interessant, mål nedstrøms for AKT og ERK såsom PRAS40 og S235 /236 i S6RP (og S9 i GSKIII, data ikke vist) forblev fosforyleret på denne 2 timers tidspunktet. Vi næste anlayzed inhibering af AKT og ERK-mål på senere tidspunkter efter behandling med 100 nM PD173074. Vi undersøgte også flere andre veje til at bestemme, om forsinkede kinetik inhibering også foregik. I modsætning til de 2 timers tidspunktet, blev både S6RP og PRAS40 phosphorylering stærkt hæmmet 12 timer efter tilsætning af forbindelse (figur 3B). Vi fandt også en tilsvarende forsinket hæmning af serin-933-phosphorylering i NFKB p105, hvilket antyder, at NFKB-signalering er en del af NCI-H716 vækst (figur 3B). NFKB P50 og P105 proteinniveauer blev kun faldt efter 72 timer. Mens hæmning 12 timer efter behandling kan skyldes en forlænget halveringstid af de signalproteiner, inhibering på senere tidspunkter, såsom 72 timer kan være sekundær til vækstinhibering (og celledød som beskrevet nedenfor i figur 4). CRKII Y221, AMPK T172, og PDK1 S241 blev hæmmet kun på 48-72 timer efter behandling, igen antyder, at tabet af disse steder kan være sekundær til væksthæmning. CRKII, havde AMPK, og PDK proteinniveauer ikke falde i tidsforløbet (data ikke vist). Endelig andre steder såsom GSKIII S9 (en AKT fosforylering stedet), PKC S660, RSK S227 (en PDK1 fosforylering site) forblev fosforyleret selv efter 72 timer (figur 3B). Dette resultat viser, at PDK1 forbliver aktivt og i stand til at phosphorylere målsteder trods cellevækstinhibering. Selvom S227 PDK1 phosphorylering site på RSK ikke blev inhiberet, ERK phosphoryleringssite serin-359 /363was inhiberet inden for 2 timer PD173074 behandling (fig S5 i File S1). GSKSIII Serin-9 forblev også phosphoryleret på senere tidspunkter, og det kan være muligt, at andre kinaser bortset fra AKT opretholde phosphorylering på dette sted. Endelig fordi MEK hæmning påvirket NCI-H716 vækst, vi yderligere defineret MEK signalering netværk ved hjælp af 100 nM af allosteriske MEK inhibitor PD0325901 [26]. Serin-933 i p105 NFKB og serin-265 i FRA1 er beskrevet som ERK phosphoryleringssteder og vi bekræftede tab af disse websteder. Serin-235/236 i S6RP er også en MEK mål i NCI-H716-celler (figur 3C). Vi konkluderer, at FGFR2 inhibering resulterede i en bifasisk mønster af pathway hæmning, med ERK og AKT inhiberes ved tidlige tidspunkter, mens PRAS40, S6RP og transkriptionsfaktorer, såsom NFKB p105 udviste en forsinket hæmning. Andre signalproteiner såsom PDK1 og PKC-isoformer forblev phosphoryleret selv på senere tidspunkter. Men det er stadig muligt, at trods fosforylering proteiner såsom PKC isoformer kan være inaktiv på grund af andre faktorer såsom cellulær mislocalization. Samlet disse resultater advarer om, at analyse af en signalering netværk kun på tidlige tidspunkter efter hæmmer behandling ikke fuldt ud kan definere forskellige signalsystemer effektorer.

A. Lysater anvendt i fig. 2A blev analyseret ved Western blotting for phosphorylerede eller totale proteiner efter en 2 timers behandling med angivne forbindelse titrering. “P” angiver phosphoprotein, og phosphoryleringssteder er angivet i Methods. B. Tidsforløb for inhibering for flere signalproteiner. NCI-H716-celler blev behandlet med 100 nM PD173074 til de angivne tidspunkter og signalveje blev analyseret ved SDS PAGE og western blotting. 100 nM PD173074 blev valgt, fordi dette beløb skyldes fuld hæmning af pERK på 2 timers tidspunkt. “P” angiver phosphoprotein, og phosphoryleringssteder er angivet i Methods. Terminologi på højre side af figur grupper proteinerne ifølge det tidspunkt, hvor inhibering eller protein tabet opstår. C. NCI-H716-celler blev behandlet med 100 nM PD0325901 i den angivne tid. Lysater blev fremstillet til SDS PAGE og western blotting med de angivne antistoffer. D. NCI-H716-celler udpladet med 4000 celler /brønd blev behandlet 24 timer senere med 1 uM L-547 (akti), 100 nM PD0325901 (Meki), 5 nM Rapamycin (rapamycin), 100 nM PD173074 eller 1,5 uM MK2461, eller den angivne kombinationer. Efter 5 dage forbindelse og medier blev fjernet og erstattet med frisk forbindelse og medier. Efter yderligere 5 dage (10 dage i alt assay) i forhold cellevækst blev bestemt ved anvendelse Vialight reagens.

A. Lysater fra figur 3B viser øgede PARP-spaltning. Phospho S6RP er medtaget som reference og GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. B. Cell cyklus profil af behandlede celler. 1 × 10exp6 NCI-H716-celler blev behandlet med 100 nM PD173074, MEK-inhibitor (100 nM) eller MEK + AKT-inhibitor (L-547, 1 uM) eller DMSO (ubehandlet) blev isoleret i de angivne tidspunkter og behandlet for propidiumiodid farvning og FACS-analyse som beskrevet i Materialer og metoder. B. indikerer en tabellarisk repræsentation af cellecyklus profiler som bestemt ved manuel gating for G1, S, G2 /M og subG1 områder. C er cellecyklus-profiler.

Kombineret hæmning af AKT og ERK er forpligtet til fuldt ud at hæmme NCI-H716 vækst

I NCI-H716 celler ERK, AKT og S6RP fosforylering kræver FGFR2 , og vi næste brugte selektive allosteriske inhibitorer af MEK, AKT, og mTOR at definere den rolle, disse veje i NCI-H716 vækst. Selvom MEK-inhibitor PD0325901 faldt NCI-H716 vækst med en IC50 på 60 +/- 14 nM, et tidsforløb viste, at NCI-H716 celler forblev i progressiv vækst (figur 3D, turkis linje). Vi fandt, at en uM AKT-inhibitor L-547 eller 5 nM rapamycin alene eller i kombination havde kun mindre effekt på vækst trods kraftig hæmning af AKT og S6RP fosforylering (Figur S6 i File S1). Derimod kan en kombination af AKT-inhibitor og MEK-inhibitor blokeret vækst og forårsagede et fald i celleantal ligner FGFR inhibering (figur 3D). Derfor både AKT og ERK er kritiske effektorer af FGFR2 i NCI-H716 celler. Derimod kan en kombination af MEK-inhibering og rapamycin var ikke bedre end MEK-inhibering alene. Dette er konsistent med vores biokemiske resultater (figur 3C), som S6RP er nedstrøms for MEK i denne cellelinie, således at ERK inhibering allerede fører til hæmning af S6RP. Desuden manglen på en fænotype med rapamycin antyder, at flere effektorer af ERK skal inhiberes i kombination for at efterligne vækstinhibering observeret med MEK-inhibitor.

Apoptose er mekanismen til vækstinhibering

udgangsforbindelsen celletal blev reduceret i celler behandlet med PD173074 og med AKT og MEK-inhibitor kombination, hvilket tyder disse inhibitorer forårsagede celledød. Spaltet PARP, en markør af apoptose, var stærkt induceret efter PD173074 behandling (figur 4A) og med MK2461 (ikke vist). Flowcytometri og cellecyklus indhold afslørede vækststandsning efter 24 timers behandling med FGFR inhibitorer eller MEK /AKT inhibitor kombinationer som set i tab af S-fasen population (figur 4B, C) efter 48 timer og senere tidspunkter på vækststandsning blev fulgt ved fremtrædende induktion af en subG1 population. Faktisk 4 dage efter behandling repræsenterede subG1 fraktion halvdelen af ​​cellepopulationen. Derimod MEK-inhibering faldt celler i S-fase ved 24 timer, men hverken slået S-fase celler på senere tidspunkter eller ofre for de samme fremtrædende celledød (figur 4B, C). Endelig billeder af NCI-H716-celler afslører udbredt celle fragmentering efter 72 timers behandling med PD173074 eller 1 uM MK2461, i overensstemmelse med celledød (figur S7 i File S1). Disse resultater viser, at NCI-H716 celle overlevelse er afhængig af FGFR2, og også støtte forudgående dokumentation for, at både AKT og ERK aktivitet er nødvendige for overlevelse.

FGFR2 er nødvendig for NCI-H716 xenograft tumorvækst

Potent NCI-H716 følsomhed over for FGFR hæmmere

in vitro

foreslog, at xenograft tumorvækst også kan hæmmes

in vivo

. NCI-H716 blev afledt af en ascites, og i overensstemmelse med tilpasning til dette miljø, cellelinien prolifererer løstliggende i suspension. Vi forsøgte derfor at skabe en ascites model ved hjælp luciferase udtrykker NCI-H716-celler injiceret i peritonealhulen. Men luciferase imaging afslørede en mangel på tumorcelle ekspansion (data ikke vist). Vi har derfor testet for tumorvækstinhibering i en standard subkutan xenograft model. Fordi PD173074 har dårlige farmakokinetiske egenskaber, vi behandlede mus med MK2461. Når tumorerne nåede 200 mm

3 i størrelse, blev MK2461 doseret én gang dagligt (QD) med enten 300 eller 800 mg /kg. I de sidste 21 dages-undersøgelsen, 800 mg /kg behandling forårsagede fuld inhibering af tumorvækst, mens 300 mg /kg resulterede i delvis inhibering, der ikke var statistisk signifikant (figur 5A). Hverken dosis resulterede i vægttab på over 5% (data ikke vist). Både høje og lave doser af MK2461 forårsagede fuld inhibering af FGFR2, ERK, og AKT phosphorylering i tumorer 2 timer efter dosering (figur 5B). Men ved 23 timer efter dosering, kun dosen 800 mg /kg havde signifikant inhibering af FGFR2 og ERK-phosphorylering. Manglende evne til /kg dosis 300 mg til at forårsage vedvarende inhibering af FGFR2 og ERK-signalering kan forklare den manglende tilknyttede virkning. Selvom 800 mg /kg forårsagede fuld vækstinhibering, blev der ikke spaltede PARP observeret

in vivo

, i modsætning til

in vitro

behandling med MK2461 (data ikke vist). Manglen på spaltet PARP

in vivo

er også i overensstemmelse med fraværet af regression i xenograft model, og kan skyldes en manglende potent inhibering af AKT-phosphorylering. For eksempel når kun ERK blev robust inhiberet

in vitro

(med MEK-inhibitor PD0325901), der blev nedsat vækst, men ikke celledød. Derfor manglen på potente AKT inhibering kan forklare, hvorfor regression ikke blev observeret i xenograft model. Årsagen til manglende AKT hæmning

in vivo

er ikke klart, men potentielt kunne skyldes kompenserende pathway aktivering af endogene murine vækstfaktorer eller cytokiner ikke er til stede i vævskultur medier.

A. 5 × 10exp6 NCI-H716-celler blev implanteret subkutant i Balb /C nøgne mus og behandlet med MK2461 med enten 300 mg /kg eller 800 mg /kg på en QD doseringsplan. Relativ tumorvækst er angivet på Y-aksen. B. tumorbærende mus blev behandlet med en enkelt dosis af MK2461 med enten 300 mg /kg eller 800 mg /kg. Tumorer blev isoleret ved enten 4 eller 24 timer efter behandling, og anbragt i flydende nitrogen. Tumorer blev behandlet ved hjælp af vævet Lyzer (Qiagen) som beskrevet i materialer og fremgangsmåder og analyseret ved SDS-PAGE og western blotting med det angivne phospho og total antistoffer.

FGFR2 overekspression men ikke amplifikation er fundet i en delmængde af primær tyktarmskræft og lymfeknudemetastaser

Vi definerede forekomsten af ​​FGFR2 overekspression og forstærkning i primær tyktarmskræft ved hjælp af immunhistokemi (IHC) for FGFR2 udtryk og FISH for

FGFR2

forstærkning. Fordi der er præcedens for selektiv

FGFR2

forstærkning i en metastase, men ikke i den primære tumor, vi analyserede også 15 lever og 58 lymfeknudemetastaser sammen med deres tilhørende primære tumorer. Fordi tidligere beskrevne C-terminus antistoffer ikke detektere FGFR2 isoformer i NCI-H716 celler ved western blotting eller IHC (data ikke vist), vi optimeret IHC-farvning med N-terminalen H80 antistof. Vi bekræftede stærk IHC reaktivitet i NCI-H716 xenograft og med en

FGFR2

forstærket mavekræft tumor (figur 6).