PLoS ONE: Identifikation af Mirs-143 og -145, der er forbundet med knoglemetastaser fra prostatacancer og involveret i reguleringen af ​​EMT

Abstrakte

Det største problem som følge af prostatakræft (PCA) er dens tilbøjelighed til at metastaserer til knoglerne. MikroRNA’er (miRNA) spiller en afgørende rolle i mange tumormetastaser. Betydningen af ​​miRNA i knoglemetastaser af PCa er ikke blevet belyst til dato. Vi undersøgte, om ekspressionen af ​​visse miRNA var forbundet med knoglemetastaser af PSA. Vi undersøgte miRNA udtryk profiler af 6 primære og 7 knogle metastatisk PCA prøver ved miRNA microarray analyse. Udtrykket af 5 miRNA faldt betydeligt i knoglemetastaser sammenlignet med primær PCa, herunder Mirs-508-5p, -145, -143, -33a og -100. Vi undersøgte yderligere andre prøver af 16 primære PCa og 13 knoglemetastaser ved hjælp af real-time PCR-analyse. Udtrykkene i Mirs-143 og -145 blev verificeret at nedregulere betydeligt i metastase prøver. Ved at undersøge forholdet mellem niveauerne af Mirs-143 og -145 med klinisk-patologiske funktioner i PCA patienter, fandt vi ned-reglerne i Mirs-143 og -145 negativt korreleret til knoglemetastaser, Gleason score og niveau af frit PSA i primær PCa . Overekspression miR-143 og -145 af retrovirus transfektion reduceret evne migration og invasion

in vitro

, og tumor udvikling og knogle invasion

in vivo

af PC-3 celler, et menneske PCa cellelinien stammede fra en knogle metastatisk PCa prøve. Deres opregulering øgede også E-cadherinekspression og reduceret fibronektin udtryk for PC-3 celler, som afslørede en mindre invasiv morfologisk fænotype. Disse resultater viser, at Mirs-143 og -145 er forbundet med knogle metastaser af PCa og foreslå, at de kan spille vigtige roller i knoglemetastaser og være involveret i reguleringen af ​​EMT Begge kan også klinisk bruges som nye biomarkører i diskriminerende forskellige stadier af menneskets PCa og forudsige knoglemetastaser

Henvisning:. Peng X, Guo W, Liu T, Wang X, Tu X, Xiong D, et al. (2011) Identifikation af Mirs-143 og -145, der er forbundet med knoglemetastaser fra prostatacancer og involveret i reguleringen af ​​EMT. PLoS ONE 6 (5): e20341. doi: 10,1371 /journal.pone.0020341

Redaktør: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, Frankrig

Modtaget: Januar 27, 2011; Accepteret: April 21, 2011; Udgivet: May 27, 2011

Copyright: © 2011 Peng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. NSFC- Guangdong fælles finansiering, Kina (nr u0732001); Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen, Kina (nr 06.021.290); Videnskab og Teknologi projektplanlægning i Guangdong-provinsen, Kina (nr 2008B030301037) og Videnskab og Teknologi Planlægning Projekt Zhuhai, Kina (2009). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatteren Tiejian Liu er ansat af en kommerciel virksomhed, Laura Biotech Co., Ltd ., og sluttede forfatternes forskningsgruppe af private årsager. På grund af sit arbejde i forskningsgruppen, vil han få betydelig erfaring, som vil være nyttige for hans ansøgning om sin ph.d.. Dette papir har ingen kommerciel betydning i form af Laura Biotech, og de oplysninger og resultater, der er beskrevet heri har ingen forbindelse til dette selskab. Forfatterne bekræfte, at dette ikke ændrer deres tilslutning til alle PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den hyppigst diagnosticerede ondartet svulst, og den anden hyppigste årsag til kræftdødsfald i vestlige lande [1]. Hovedproblemet følge af PCa er dens tilbøjelighed til at metastasere til knogle. Skeletale metastaser optræder i så mange som 90% af patienter med fremskreden PSA. Vigtigere er det, når tumorer metastaserer til knogle, de praktisk talt uhelbredelig og medfører betydelig sygelighed forud for en patients død [2], [3]. Det er meget vigtigt at forstå den mekanisme af metastaser formation til at forebygge metastaser og udvikling af anti-metastatiske behandlinger, der kan give yderligere reduktion på sygelighed og dødelighed af PCA patienter.

Skeletal metastaser af tumor er en kompliceret multi-step proces, der indbefatter cellulær frigørelse og motilitet fra den lokale mikromiljø, nedbrydning af det omgivende ekstracellulære matrix, cellulære bevægelse, standset ved distale kapillærer, ekstravasatet og endelig prolifererer til dannelse fjerne sekundære knogletumorer. Alle disse processer reguleres af flere faktorer og molekylære veje [4]. Selv om grundlæggende viden om denne struktureret proces er steget for nylig, mange af de centrale elementer er stadig dårligt forstået.

MikroRNA’er (miRNA) er en klasse af små ikke-kodende regulatoriske RNA (19-25 nukleotider) udtrykt af planter og dyr, der er involveret i regulering af genekspression. De udøver deres funktion ved binding til 3′-utranslaterede region af en delmængde af mRNA’er resulterer i nedbrydningen eller undertrykkelse af oversættelse [5]. Bioinformatiske analyser har forudsagt, at enkelt miRNA har flere mål, og dermed miRNA kunne mediere reguleringen af ​​et stort antal af protein-kodende gener. De seneste skøn tyder på, at en tredjedel af de menneskelige mRNA kan reguleres ved miRNA [6], [7]. miRNA er blevet vist at interferere cellulære funktioner såsom celleproliferation, celledifferentiering og apoptose [8].

Mange rapporter har belyst rollen af ​​visse miRNA som promotorer eller suppressorer af tumorer [9], [10] , [11]. Et stigende antal observationer giver også en kollektiv beviser, at miRNA koordinere nogle af de indviklede gen-ekspression programmer og spiller en afgørende rolle i tumormetastaser [12]. miRNA kan påvirke flere trin med metastatisk kaskade, såsom tumorcellemigration, invasion og intravasation. For eksempel brystcancer er en af ​​de vigtigste bidragydere af knoglemetastaser [13]. En række microRNA er blevet identificeret som metastase promotorer, herunder lad-7, MIR-9, MIR-10b, MIR-21, MIR-373, MIR-520C, og MIR-103/107 [12], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20]. Omvendt miR-335, miR-206, miR-31, miR-145, miR-661 og miR-126 er blevet identificeret som metastaser suppressor miRNA i human brystcancer [21], [22], [23], [24 ], [25], [26], [27].

I PCa har adskillige miRNA blevet identificeret som mediatorer af metastaser. Det blev påvist, at deregulering af MIR-221 og MIR-222 var forbundet med PCa progression, dårlig prognose, og udvikling af metastase [28]. MIR-21 var også overeksprimeret i PCa og fungerer som en nøgle onkogen regulator, der bidrager til tumorvækst, invasionsevne og metastase [29], [30], [31]. En undersøgelse har vist, at miR-146a henvender rock1, og forhøjede rock1 niveauer fremmer celledeling, invasion og metastase i PCA celler [32]. Derudover genomiske tab af MIR-101 i human PCa, involveret i cancer progression, fører til overekspression af EZH2 [33], [34]. Imidlertid er betydningen af ​​miRNA i knoglemetastaser af PCa ikke blevet belyst til dato.

Epithelial-mesenchymal overgang (EMT) er en vis signal pathway beskrive et nøgletrin af progressionen af ​​tumorcellemetastase som omfatter hinanden følgende processer celle-adskillelse, migrerer, invaderende, dispergeringsmidler og endelig bosiddende [35]. Det er blevet identificeret som et kendetegn for metastase i multiple tumorer, der forbinder til masser af transkriptionelle faktorer [36], [37], [38], [39]. miRNA er også komponenter i det cellulære signalering kredsløb, der regulerer EMT program [40]. Nyligt arbejde har vist flere miRNA, herunder miR-200 familien og miR-205, spillede kritiske roller i EMT [41], [42]. Indtil nu, er stadig uklart, den præcise rolle miRNA i reguleringen EMT.

For at undersøge betydningen af ​​miRNA i knoglemetastaser af PCa og deres forhold til EMT, er det for det første brug for at vide miRNA udtryk profilering i primær og knogle metastatisk PSA. I den foreliggende undersøgelse, vi sammenlignet miRNA udtryk profiler i primær og knogle metastatisk PCa af mennesker og identificerede Mirs-143 og -145 relateret til knoglemetastaser. Desuden vi demonstreret, at upregulations af Mirs-143 og -145 undertrykt migration og invasion

in vitro

, tumor udvikling og knogle invasion

in vivo

, og EMT af PC-3 celler, en human PCa cellelinie stammer fra en knogle metastatiske PCA modellen.

Materialer og metoder

Vævsprøver

Vævsprøver fra to grupper af PCA patienter blev undersøgt. Primære PCA væv var fra prostatektomi eller transuretral resektion i behandlingen af ​​lokale prostatacarcinom. Skeletal metastatiske væv af PCa var fra driften i behandlingen af ​​knoglemetastaser. Alle prøver blev formalin-fikseret og paraffin-indstøbt (FFPE) med standardprocedurer. Regioner af vævsprøver 70% cancervævet blev anvendt til ekstraktion af totalt RNA. Den histologiske diagnose blev foretaget af en patolog og er blevet re-bekræftet af en anden patolog (D.). Knoglemetastaser blev diagnosticeret i henhold til klinisk symptom og tegn, knoglescanning, røntgen, computertomografi, og MR. Ingen af ​​patienterne havde fået neoadjuverende hormon, stråling eller kemoterapi før få tumorvæv. Den kliniske oplysninger blev revideret om alder, knoglemetastaser, total PSA-niveau, frit PSA-niveau og Gleason score i primære PCA patienter. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Etiske Board (IRB) i First Affiliated Sygehus af Sun Yat-sen Universitet og samtykket af patienter, der deltager.

RNA ekstraktion

Alle prøver blev sendt til CapitalBio Corp . og totalt RNA fra FFPE vævsprøver blev isoleret som tidligere beskrevet [43]. Kort fortalt blev vævsprøverne skåret i skiver fra paraffinblokke og anbragt i 1,5 ml nukleasefri mikrocentrifugerør (Eppendorf), derefter deparaffiniseret tre gange i 1 ml Limonene, efterfulgt af vask med 1 ml 100% ethanol to gange og lufttørring ved stue temperatur. Prøver blev derefter inkuberet med digestionspuffer (20 mM Tris-HCI, 10 mM EDTA, 1% SDS) og proteinase K (Merck) ved 55 ° C natten over for at opnå fuldstændig fordøjelse af prøverne. Efterfølgende blev TRIzol-reagens (Invitrogen) tilsat, og den resterende del af protokollen blev udført ifølge producentens instruktioner. RNA-prøver blev resuspenderet i RNase-frit vand efter den endelige udfældningstrin. RNA kvalitet og kvantitet blev vurderet ved hjælp af en biophotometer (Eppendorf).

microarray analyse

I alt RNA-prøver blev analyseret af CapitalBio (CapitalBio Corp.) for miRNA microarray eksperimenter. Hver miRNA microarray chip indeholdt 924 sonder i tre eksemplarer, svarende til 677 menneskelige (herunder 122 forudsagt miRNA), 461 mus og 292 rotter miRNA fundet i miRNA Registry (https://microrna.sanger.ac.uk; miRBase Frigivelse 10,0, 2007). Procedurer blev udført som beskrevet i detaljer på hjemmesiden for CapitalBio (https://www.capitalbio.com). Kort fortalt blev lav molekylvægt RNA (LMW-RNA) isoleret under anvendelse PEG-opløsning fældning Fremgangsmåde ifølge et tidligere protokol [44]. LMW-RNA blev dephosphoryleret med alkalisk phosphatase (NEB) ved den første følge protokollen afgivet Wang H et al. [45]. Derefter dephosphoryleret LMW-RNA blev mærket med 500 ng 5′-phosphat-cytidyl-uridyl-cy3-3 «(Dharmacon) med 2 enheder T4-RNA-ligase (NEB) [44]. Mærket RNA blev udfældet med 0,3 M natriumacetat, 2,5 volumener ethanol og resuspenderet i 20 pi hybridiseringsbuffer indeholdende 3 x SSC, 0,2% SDS og 15% formamid. Grupperingen blev hybridiseret ved 42 ° C natten over og vasket med to på hinanden følgende vaskeopløsninger (0,2% SDS, 2 x SSC ved 42 ° C i 4 min, og 0,2% SSC i 4 minutter ved stuetemperatur). Arrays blev scannet med en dobbelt-kanal laserscanner (LuxScan 10K /A, CapitalBio). Indstillingen scanning blev indstillet til opnåelse af en visualiseret samme intensitet af U6 pletter tværs arrays. Dataene er udvundet af TIFF-billeder ved hjælp LuxScanTM 3.0 software (CapitalBio Corp). Rådata blev normaliseret og analyseret ved hjælp af Betydning Analyse af microarrays (SAM, version 2.1, Stanford University, CA, USA) software. Clustering analyse blev udført ved Cluster 3.0 [46]. Alle data er MIAME kompatibel og at den rå data er blevet deponeret i en MIAME kompatibel database (GEO, tiltrædelse ID: GSE26964).

Kvantitativ revers transkription-PCR

cDNA opnået ved hjælp af TaqMan miRNA Q-PCR Detection Kit (GeneCopoeia). Kort fortalt miRNA blev revers transkriberet under anvendelse af sekvensspecifik hårnåle-primere (Invitrogen) til følgende miRNA: HSA-MIR-125b, HSA-MIR-145, HSA-MIR-153, HSA-MIR-210, HSA-MIR-143 , HSA-mIR-100, HSA-mIR-363, HSA-mIR-451, HSA-mIR-572 og HSA-mIR-508-5p, baseret på microarray analyse og deres forudsagte målgener. Reaktionen blev udført med følgende parameterværdier: 15 minutter ved 37 ° C, 10 minutter ved 65 ° C, 5 minutter ved 85 ° C, og -20 ° C indtil anvendelse. Real-time PCR-analyse blev udført på en iQ5 Real Time PCR Detection System (Bio-Rad) med 20 uL volumen reaktion indeholdende 2 pi revers transkription produkt, 10 uL 2 × All-in-One ™ Q-PCR Mix, 2 pi PCR Forward Primer (2 pM), 2 pi Universal adapter PCR Primer (2 pM), 4 pi ddH2O. Reaktionerne blev inkuberet i 96-brønds plader ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler, og trappes derefter fra 66 ° C til 95 ° C til opnåelse smeltekurven. Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer. Nr skabelon og ingen revers transkription blev inkluderet som negative kontroller. U6 snRNA blev anvendt som normalisering kontrol. Relative udtryk værdier fra tre uafhængige forsøg blev beregnet efter 2

-ΔΔCt metode Schmittgen og Livak [47].

Låst nukleinsyre (LNA) in situ hybridisering

Proceduren var udført som tidligere beskrevet [48]. Kort fortalt blev paraffinindlejrede vævssnit afparaffineret, dehydrerede, derefter behandlet med proteinase K (20 ug /ml; Roche) ved 37 ° C i 30 minutter. Efter vasket med 0,2% glycin /PBS i 1 min og fikseret med 4% paraformaldehyd, blev sektionerne inkuberet i hybridiseringsbuffer (50% formamid, 5 x SSC, 0,1% Tween, 9,2 mM citronsyre til justering til pH 6,0, 50 ug /ml heparin, 500 ug /ml gær-RNA) ved 37 ° C i 2 timer. Digoxigenin-mærkede, LNA-modificerede prober MIR-143 (20 nmol /l; 5′-GAGCTACAGTGCTTCATCTCA-3 ‘, Exiqon) og MIR-145 (20 nmol /l; 5′-AGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC-3’, Exiqon) blev tilsat henholdsvis og inkuberet ved 55 ° C i 18 timer. Snit blev vasket med 2 x SSC to gange, derefter med 2 x SSC og 50% formamid ved 50 ° C tre gange (30 minutter hver). Den anti-DIG-AP (1:1000, Roche) blev tilsat efter PBS-T (0,1% Tween 20) vask og inkuberet ved 4 ° C natten over. Snit blev vasket fire gange med PBS-T, og nitroblue tetrazolium chlorid /5-brom-4-chlor-3-indonyl phosphat blev anvendt til farvning.

Cellekultur

Metastatisk PCA cellelinier inkluderet PC-3 og LNCaP i den foreliggende undersøgelse. PC-3 blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC) og opretholdt i F-12 dyrkningsmedium (Hyclone) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone). LNCaP blev købt fra Shanghai Cell Bank, Chinese Academy of Sciences, og vedligeholdes i RPMI-1640 dyrkningsmedium (Gibico, Invitrogen) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone). Stabilt-transficerede celler blev opretholdt i medier med tilstedeværelsen af ​​puromycin (Sigma-Aldrich). Celler blev dyrket ved en fugtig atmosfære af 5% CO

2 ved 37 ° C.

Dannelse af stabilt transficerede cellelinjer

Sekvensen af ​​PRI-MIR-143 og PRI-miR -145 blev klonet ind pMSCV-puromycin plasmid med restriktionsenzym Bgl II og EcoR i (New England Biolabs). 293FT celler blev derefter transficeret med ovennævnte konstruerede plasmider kombineret med PIK vektor eller blank pMSCV-vektor som kontrol under anvendelse af calciumphosphatmetoden som tidligere [49] beskrevne. Efter inkubation ved 37 ° C i 6 timer efter transfektion blev mediet ændret, og cellerne blev inkuberet natten over. For at producere nye virus blev medierne opsamlet tre gange om dagen, indtil 293FT cellerne når til total konfluens. Virus anvendes til at inficere PC-3 og LNCaP-celler. 24 timer efter tilsætning af virus, blev inficerede celler udvælges ved tilsætning puromycin til vækstmediet. Stabile cellelinjer blev verificeret ved QRT-PCR. Både pMSCV og PIK plasmider blev ydet af generøse Prof. Song LB, Sun Yat-Sen University Cancer Center, Guangzhou, Kina.

Sårheling assay

En dag før bunden, stabil cellelinier af PC-3 og LNCaP-celler blev trypsinbehandlet og podet ligeligt i 6-brønds vævskulturplader, og voksede til at nå næsten total konfluens i 24 timer. Når ikke-serumudsultning holdes i 24 timer efter cellemonolaget dannet, blev en kunstig homogen sår skabt på monolaget med en steril 100 pi spids. Efter ridser, blev cellerne vasket med serumfrit medium. Billeder af celler migrerer ind i såret blev taget til fange på tidspunkter af 0 h, 6 h, 12 timer og 24 timer ved omvendt mikroskop (40 ×).

In vitro

invasion assay

invasion assay blev udført ved anvendelse af Transwell kammer bestående af 8 um membran filterindsatse (Corning) overtrukket med Matrigel (BD Biosciences) som beskrevet tidligere [50]. Kort beskrevet blev celler trypsiniseret og suspenderet i serum-frit medium. Derefter 1,5 × 10

5-celler blev tilsat til det øvre kammer, hvorimod nedre kammer blev fyldt med medium med 10% FBS. Efter inkuberet i 48 timer blev celler invaderet gennem den belagte membran til den nedre overflade, hvor celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd og farvet med hematoxylin. Celletallet blev udført under mikroskop (100 x).

Adhæsion assay

Bindingsanalysen blev udført som tidligere beskrevet [51]. Kort fortalt blev 96-brønds plader coatet med 50 pi fibronectin (50 pg /ml) i original medier ved celle-inkubator i 1 time. Efter vasket med varme medier blev pladerne blokeret med 1% BSA ved 37 ° C i 1 time og vasket to gange. Efter trypsinisering blev suspenderede celler podet i hver brønd med serumfrit medium ved en tæthed på 1,5 x 10

4 celler pr. Når de inkuberes pladerne i 30 minutter, blev ikke-adhærente celler fjernet, og pladerne blev forsigtigt vasket to gange med PBS. Adhærerende celler blev fikseret i 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved stuetemperatur, derefter farvet med hematoxylin og talt under omvendt mikroskop (100 x).

Western blotting

Til ekspression analyse af EMT- relaterede proteiner, blev immunoblotting assay udført. Alle de stabile cellelinjer, herunder PC-3 /vektor, PC-3 /MIR-143, PC-3 /MIR-145, LNCaP /vektor, LNCaP /MIR-143 og LNCaP /MIR-145, blev podet i 100 mm vævskulturskåle. Efter 24 timer blev cellerne vasket med forafkølet PBS når sammenløbet nået til 60-70%, efterfulgt af høsten i prøvepuffer [62,5 mmol /L Tris-HCI (pH 6,8), 2% SDS, 10% glycerol og 5 % 2-β-mercaptoethanol]. Lige store mængder protein fra supernatanten blev påført per bane og løses ved SDS-polyacrylamid-elektroforese. I rækkefølge, blev proteinet overført til PVDF-membran (Millipore), blokeret med 5% fedtfri mælk i 1 time ved stuetemperatur, og probet med primære antistoffer (1:1000) i 3 timer, herunder muse-anti-E-cadherin (BD Biosciences ), muse-anti-Fibronectin (BD Biosciences) og muse-anti-vimentin (BD Biosciences). Membraner blev vasket tre gange (10 min hver) i TBS-T buffer og inkuberet i 40 minutter ved stuetemperatur med peberrodsperoxidasekonjugeret anti-muse sekundære antistoffer. Blots blev vasket tre gange (10 min hver) i TBS-T og fremkaldt under anvendelse af ECL-systemet. Protein lastning blev normaliseret ved Fornyet probing blots med muse-anti-α-tubulin antistof (ABCAM).

In vivo

modeller af prostatakræft knoglemetastaser

Intra-tibial injektion model blev anvendt. ti mandlige svær kombineret immundefekt (SCID) mus af 3~4 uger gamle blev købt fra HFK Bio-Technology.CO., LTD (Beijing, Kina). Før podning blev PC-3-celler resuspenderet i 40 pi serun-free F-12-medium med en densitet på 2 × 10

5 celler pr 40 pi og injiceret med en 26-gauge kanyle i tibia under anvendelse af en boring bevægelse . Dyrene blev randomiseret i to grupper ligeligt, hvor hver 5 dyr blev behandlet med PC-3 /miR-143 eller PC-3 /miR-145 på højre skinneben hhv. Alle 10 mus blev injiceret med PC-3 /vektor på venstre skinneben som selvkontrol. Mus blev overvåget ugentligt i tumorvækst. I uge 5, blev baglemmer radiograferet under anvendelse af et Faxitron X-ray maskine (Faxitron X-ray Corp., USA) for at detektere knoglelæsionerne. Derefter blev musene aflivet, og skinneben blev opsamlet, afkalket og fikseret i formalin til yderligere histologisk analyse. Bone læsioner blev vurderet og beregnet som beskrevet som tidligere beskrevet [52], hvor 0 klasse for ingen læsion, en for mindre læsioner, 2 for små læsioner, 3 for betydelige læsioner med mindre pause margener, og 4 for betydelige læsioner med stor pause i perifere læsioner.

Statistisk analyse

for at bestemme forskellige udtryk for miRNA i Microarray, betydning analyse af microarrays (SAM, version 2.1) blev udført ved hjælp af to klasse uparrede sammenligning i SAM procedure. Markant differentielt udtrykte miRNA blev valgt som følgende standarder: