PLoS ONE: Den vandige ekstrakt af Ficus religiosa Fremkalde cellecyklusstop i Human Livmoderhalskræft kræftcellelinjer SiHa (HPV-16 Positive) og apoptose i HeLa (HPV-18 Positive)

Abstrakt

Naturprodukter er bliver i udstrakt grad udforsket for deres potentiale til at forebygge samt behandle kræft på grund af deres evne til at målrette flere molekylære veje.

Ficus religiosa

er blevet vist at udøve forskellige biologiske aktiviteter, herunder apoptose i brystcancercellelinier. I den foreliggende undersøgelse rapporterer vi det anti-neoplastisk potentiale vandig ekstrakt af

F. religiosa Hotel (FR

aq) bark i humane livmoderhalskræft cellelinjer, SiHa og HeLa. FR

aq ændret vækstkinetikken af ​​SiHa (HPV-16 positive) og HeLa (HPV-18 positive) celler på en dosis-afhængig måde. Det blokerede cellecyklusprogression på G

1 /S-fase i SiHa der var kendetegnet ved en stigning i ekspressionen af ​​p53, p21 og pRb proteiner med en samtidig reduktion i ekspressionen af ​​phospho Rb (ppRb) protein. På den anden side, i HeLa, FR

aq apoptose gennem en stigning i intracellulær Ca

2+ fører til tab af mitokondrisk membranpotentiale, frigivelse af cytochrom-c og stigning i ekspressionen af ​​caspase-3. Desuden FR

aq reducerede migration samt invasion evne både livmoderhalskræft cellelinjer ledsaget med nedregulering af MMP-2 og Her-2-ekspression. Interessant, FR

aq reduceret ekspression af virale oncoproteiner E6 og E7 i både den cervikale cancercellelinier. Alle disse data tyder på, at

F. religiosa

kunne udforskes for sin kemoforebyggende potentiale i livmoderhalskræft

Henvisning:. Choudhari AS, Suryavanshi SA, Kaul-Ghanekar R (2013) det vandige ekstrakt af

Ficus religiosa

Fremkalde Cell Cycle Anholdelse i human Livmoderhalskræft kræftcellelinjer SiHa (HPV-16 Positive) og apoptose i HeLa (HPV-18 positiv). PLoS ONE 8 (7): e70127. doi: 10,1371 /journal.pone.0070127

Redaktør: Chunhong Yan, Albany Medical College, USA

Modtaget: Februar 22, 2013; Accepteret: 14 Juni 2013; Udgivet: 26 Jul 2013

Copyright: © 2013 Choudhari et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne tak IRSHA, Bharati Vidyapeeth Universitet og CSIR til at understøtte dette arbejde. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Livmoderhalskræft er den anden største årsag til kræft dødsfald i de kvinder over hele verden [1], [2]. Højrisiko-human papilloma virus (HPV’er) såsom HPV 16, 18, 31 og 33 er blevet tilskrevet at være de vigtigste risikofaktorer for livmoderhalskræft, hvoraf HPV-16 og -18 konto for næsten 70% af de kræftformer [ ,,,0],3]. E6 og E7 er de to virale oncoproteiner er nødvendige for udvikling og vedligeholdelse af den transformerede fænotype i livmoderhalskræft celler. E6 fremmer p53 nedbrydning gennem en ubiquitin-afhængig proteasomforløb mens E7 forbinder med retinoblastoma (pRb) protein og interfererer med dets binding til E2F [4], [5]. Dette resulterer i tab af RB /E2F komplekser fører til frigivelse af transkriptionsfaktor E2F der inducerer ekspression af celleproliferative gener [5].

Selvom de nuværende behandlingsmodaliteter kan helbrede 80-95% af den tidlige fase og 60% af loco-regionalt avancerede kræftformer, den tilbagevendende og metastatisk sygdom er stadig et stort problem [6]. For nylig er komplementær og alternativ medicin (CAM) stigende popularitet som en kemopræventivt tilgang til ledelse samt forebyggelse af kræft tilbagefald [7], [8]. Mere end 60% af tiden anvendte anticancerlægemidler er oprindeligt stammer fra naturlige kilder såsom planter, marine organismer og mikroorganismer [9]. Forskellige videnskabelige undersøgelser, herunder vores, har foreslået potentiale lægeplanter som anti-cancer lægemiddelkandidater [10], [11]. Vi har for nylig rapporteret anticancer potentiale

Cassia Hotel (kanel) i livmoderhalskræft [12].

Ficus religiosa

L. familien Lauraceae, har været flittigt brugt i den traditionelle medicin for forskellige lidelser. Dens forskellige dele har været anvendt medicinsk i forskellige former såvel som i kombination med andre urter [13], [14]. Det er blevet vist at udvise forskellige biologiske aktiviteter [14], herunder sårheling [15], anti-bakteriel [16], anti-konvulsiv [17], anti-diabetiske [18], [19], anti-inflammatorisk [20] , acetyl cholinesterase inhiberende aktivitet [21] og angstdæmpende aktivitet [22]. Acetoneekstrakten af ​​

F. Religiosa

blade er blevet vist at inducere apoptose i brystcancercellelinier [14].

Vi har for nylig rapporteret antioxidanten og cytotoksiske aktivitet af

F. religiosa

bark i livmoderhalskræft celler [23]. I den foreliggende undersøgelse har vi undersøgt den formodede molekylære mekanisme, der ligger det antineoplastiske potentiale af den vandige ekstrakt af

F. religiosa Hotel (FR

aq) bark i livmoderhalskræft. Vores data tyder på, at Ficus hæmmer væksten af ​​cervikal cancer cellelinjer, SiHa og HeLa, ved at inducere cellecyklus og apoptose hhv. Interessant, FR

aq reducerede signifikant ekspression af virale oncoproteiner E6 og E7, hvilket tyder terapeutiske potentiale

F. religiosa

i livmoderhalskræft.

Materialer og metoder

Kemikalier og reagenser

Tissue kultur plastvarer blev købt fra BD Biosciences (CA, USA) og Axygen Scientific Inc ( CA, USA). Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) pulver, penicillin og streptomycin blev erhvervet fra Invitrogen /Gibco (Grand Island, NY, USA). Føtalt bovint serum (FBS), 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenylthiazolium (MTT), FCCP, ionomycin og JC-1 blev erhvervet fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO ). Primært antistof mod p53 (DO-1), p21 (187), caspase-3 (H-277), cyto-c (7H8), Her-2 (F-11), pRb (C-15), ppRb (SER 807/811), HPV16 E6 /18 E6 (C1P5), HPV16 E7 (ED17), HPV18 E7 (N-19) eller tubulin (B-7) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA ). Annexin V-FITC apoptosis kit # 3 blev indkøbt fra Invitrogen (CA, USA). Alle andre almindelige reagenser blev indkøbt fra Qualigens Fine Chemicals (Mumbai, Indien).

Udarbejdelse af vandig ekstrakt af

Ficus religiosa

(FR

aq) og Foreløbige fytokemiske Undersøgelser

barken af ​​Ficus

religiosa

L. blev indsamlet fra Pune District, Maharashtra, Indien og det blev godkendt som tidligere beskrevet [23]. Voucher eksemplar (MPCC 2417) af autentiske plantearter blev deponeret ved herbarium af Lægeplanter Conservation Center (MPCC), Pune, Maharashtra, Indien. Barken blev vejet, pulveriseret og ekstraheret med dobbeltdestilleret vand i et varmt vand emhætte som tidligere beskrevet [23], [24]. Den resulterende ekstrakt blev centrifugeret ved 13000 rpm i 15 min for at fjerne partikler. Supernatanten blev yderligere filtersteriliseret under anvendelse Svinø (porestørrelse, 0,45 um), og den resulterende filtrat blev opbevaret i portioner ved -80 ° C indtil anvendelse. Udbyttet af det tørrede ekstrakt opnået fra udgangsmaterialet rå materiale var 8,6% (vægt /vægt). Frisklavet FR

aq ekstrakt blev kvalitativt testes for tilstedeværelsen af ​​flavonoider, fenoler, saponiner, tanniner og kulhydrater ved hjælp af standard procedurer analyse [25].

Cell Culture

Den menneskelige cervikale karcinom cellelinjer, SiHa (HPV-16), HeLa (HPV-18) og C33A (HPV-negative) blev opnået fra National center for Cell Science (NCC’erne), Pune, Maharashtra, Indien. Cellerne blev dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS, 2 mM L-glutamin og antibiotika (100 enheder /ml penicillin og streptomycin). Cellerne blev inkuberet i en befugtet 5% CO

2 inkubator ved 37 ° C.

Cell Growth Analysis

Analysen blev udført som tidligere beskrevet [12]. Kort fortalt blev SiHa og HeLa-celler podet ved en densitet på 1 x 10

5 og 1,5 × 10

5 celler /ml, henholdsvis i plader med 24 brønde i tre eksemplarer. Næste dag blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af FR

aq (0-80 ug /ml) i 24, 48 og 72 timer. Cellerne blev høstet og talt for levedygtighed under anvendelse af trypanblåt-udelukkelse farvestof metode [12], [26].

cellevækst i monolag

Analysen blev udført som tidligere [12] beskrevne. Kort fortalt blev SiHa og HeLa-celler udpladet ved en podningsdensitet på 1 × 10

3 celler /ml i plader med 6 brønde. Efter 24 timer blev cellerne udsat for forskellige koncentrationer af FR

aq (0-80 ug /ml) efterfulgt af inkubation ved 37 ° C i en CO 5%

2 inkubator i en uge i nærværelse af ekstrakten . Dette blev efterfulgt af fastsættelse af kolonier med 4% paraformaldehyd og farvning med 0,5% krystalviolet. Kolonierne blev fotograferet med Sony DSC-S75 Cyber-shot kamera.

cellevækst i blød agar-assay

Analysen blev udført som tidligere beskrevet [12], [26]. Kort fortalt, SiHa og HeLa-celler (5 x 10

3 celler /ml) sammen med forskellige koncentrationer af FR

aq (0-80 ug /ml) blev blandet med 0,35% agarose (DNA kvalitet, GIBCO BRL) i fuldføre DMEM medium ved 40 ° C og geleret ved stuetemperatur i 20 minutter over et tidligere geleret lag af 0,5% agarose i komplet medium i plader med 6 brønde. Efter inkubation i to uger blev kolonierne talt i 10 forskellige områder ved hjælp af en Axiovert 200 M mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland) og den gennemsnitlige værdi blev beregnet.

Sårheling Assay

Både SiHa og HeLa-celler blev podet ved en densitet på 4 x 10

5 /ml i plader med 24 brønde og fik lov til at adhærere natten over ved 37 ° C i 5% CO

2 incubator. Næste dag blev cellerne udsultet i serum i 6 timer, efterfulgt af tilsætning af komplet medium med eller uden FR

aq (0-80 ug /ml). En kunstig sår blev foretaget i de plader, der indeholdt behandlede og ubehandlede celler med en 10 pi mikropipettespids og såret fik lov at hele i 24 timer ved 37 ° C i 5% CO

2 incubator. Billederne til 0 timer samt 16 timer blev fanget ved hjælp af Axiovert 200 M mikroskop. Den gennemsnitlige grad af sårlukning blev vurderet ved at måle bredden af ​​såret ved hjælp ImageJ 1.44p [27].

Matrigel transmembrane Invasion Assay

I invasion studier, 24-brønds BioCoat Matrigel Invasion kamre (BD Bioscience, Bedford, MA) blev anvendt [28]. SiHa og HeLa-celler (5 x 10

4) med eller uden FR

aq behandling (0-80 ug /ml) blev podet i serumfrit medium ind i de øverste invasion kamre og fik lov til at invadere hele Matrigel- overtrukket membran i 24 timer. Mediet indeholdende 10% FBS blev tilsat til det nederste kammer, der tjente som en kemo tiltrækningsstof. Efter 24 timers inkubation blev ikke-invaderende celler fjernet fra toppen af ​​hver membran med våde vatpinde; invaderende celler fastgjort til bunden af ​​membranen blev fikseret med 4% formalin og farves med 0,5% krystalviolet. De celletal blev talt i ti tilfældige high-power (× 20) felter ved hjælp Axiovert 200 M mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland) udstyret med et Sony Cyber-shot 3,3 mega pixel kamera.

gelatinezymografi

aktiviteten af ​​MMP-2 i det konditionerede medium blev bestemt ved gelatinezymografi som tidligere [12] beskrevne. Kort fortalt blev SiHa og HeLa-celler podet med en tæthed på 4 x 10

5 celler /ml i plader med 6 brønde og fik lov at adhærere natten over ved 37 ° C i 5% CO

2 incubator. Næste dag blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af FR

aq (0-80 ug /ml) fremstillet i serumfrit medium og inkuberet i 24 timer. Den følgende dag blev dyrkningsmediet opsamlet og centrifugeret ved 14.000 rpm i 20 minutter ved 4 ° C for at fjerne cellerester. Det konditionerede medium fra kontrolceller såvel som celler behandlet med FR

aq blev opsamlet og opkoncentreret i Centricon YM-30 rør (Millipore, MA). Prøverne indeholdende en tilsvarende mængde af totale proteiner, blev blandet med prøvepuffer (2% SDS, 25% glycerol, 0,1% bromphenolblåt og 60 mM Tris-HCI pH 6,8) og underkastet under ikke-reducerende betingelser på 7,5% SDS- polyacrylamidgel indeholdende gelatine (0,5 mg /ml). Efter elektroforese blev gelen vasket med 0,25% Triton X-100 og inkuberet natten over ved 37 ° C i buffer indeholdende 150 mM NaCl, 100 mM CaCl

2, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1% Triton X- 100, 0,02% NaN

3. Gelen blev farvet med farveopløsning (0,1% Coomassie Brilliant blue R-250 i 40% isopropanol) og affarvet i 7% eddikesyre. Gelatinolytisk aktivitet blev detekteret som ufarvede bands mod blå baggrund. Kvantificeringen af ​​bands i kontrol og behandlede prøver blev udført ved densitometrisk analyse på Alpha Imager hjælp Alpha Ease FC software, Alpha Innotech.

Immunoblotting

HeLa og SiHa celler blev udpladet ved en seeding tæthed af 4 × 10

5 celler /ml i plader med 6 brønde og fik lov at adhærere natten over ved 37 ° C i CO

2 incubator. Næste dag blev cellerne udsat for forskellige koncentrationer af FR

aq (0-80 ug /ml) og inkuberet i 24 timer. Efter inkubation blev cellerne høstet ved trypsinisering, vasket med 1 × PBS og protein blev ekstraheret som tidligere [12] beskrevne. Kort fortalt blev cellepellets resuspenderes i 60 pi lysepuffer indeholdende 50 mM Tris (pH 7,4), 5 mM EDTA, 0,5% NP40, 50 mM NaF, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 0,5 ug /ml leupeptin (Pro-rent Amersco , Solon, USA), 1 pg /ml pepstatin (Amresco, Solon, USA), 150 mM NaCl, 0,5 ug /ml aprotinin (Amersco, Solon, USA) og protease-inhibitor cocktail (Roche, Lewes, UK) og inkuberet på is i 1 time med intermitterende blanding. Ekstrakten blev centrifugeret i 20 minutter ved 4 ° C ved 12000 rpm. For cytochrom-c-frigivelse, blev cytosoliske og mitokondriske fraktioner fremstillet som tidligere [29] beskrevne. Proteinet blev estimeret under anvendelse Bradford reagens (Biorad Laboratories Inc., CA, USA). Samme mængde protein blev lastet på enten 10% eller 12% (for E6 protein) SDS-polyacrylamidgel og overført elektroforetisk til Amersham Hybond-P PVDF-membran (GE Healthcare, UK) i natriumphosphatpuffer (pH 6,8). Membranen blev blokeret i 5% BSA i TST og inkuberet ved 4 ° C natten over med primært antistof mod p53, p21, caspase-3, cyto-c, Her-2, pRb, ppRb, HPV16 E6 /18 E6, HPV16 E7, HPV18 E7 eller tubulin (Santacruz, CA, USA) ved en 1:500 fortynding. Membranen blev vasket i TST og inkuberet med sekundære IgG HRP konjugat ved 1:5000 fortynding. Proteiner blev visualiseret med en kemiluminescenskittet (Amersham ECL Advance western blotting afsløring kit, GE Healthcare, UK) og densitometrianalyse blev udført på scannede immunoblot billeder ved hjælp af billedet J gel analyse værktøj.

Vurdering af cellecyklusstop

cellecyklusanalyse, HeLa, SiHa og C33A cellelinjer blev udpladet i en podningsdensitet på 5 × 10

5 celler /brønd i plader med 6 brønde og fik lov til at klæbe i 24 timer ved 37 ° C i CO

2 inkubator. Næste dag blev cellerne behandlet med FR

aq (0-80 ug /ml) i 24 timer. Cellerne blev høstet ved trypsinisering og fikseret i iskold 70% ethanol ved -20 ° C i 30 minutter. Efter vaskning med 1 × PBS, blev cellerne behandlet med RNAse A (100 mg /ml) ved stuetemperatur i 30 minutter og farvet med PI (20 pg /ml). Farvede celler blev analyseret for DNA-PI-fluorescens ved anvendelse af et flowcytometer (FACS Calibur, BD). Mindst 10.000 begivenheder blev talt pr prøve; Data blev analyseret under anvendelse af FACS Calibur-celle quest software (Becton Dickinson) for andelene af celler i G

0 /G

1, S-fasen og G

2 /M-faser af cellecyklus.

Vurdering af apoptose

for at bestemme antallet af celler, som undergår apoptose ved FR

aq behandling, HeLa, SiHa og C33A blev udpladet ved en podning densitet på 5 × 10

5 celler /brønd i plader med 6 brønde og lodes vokse natten over ved 37 ° C i CO

2 incubator. Næste dag blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af FR

aq (0-80 ug /ml) og inkuberet i 24 timer. Celler blev farvet med Annexin V-FITC ifølge producentens instruktioner (Annexin V-FITC apoptosis kit # 3, Invitrogen, Grand Island, NY). I alt 10.000 hændelser blev erhvervet og dual parameter punktdiagram over FL2-H (X-aksen, PI-fluorescens, lineær skala) versus FL1-H (Y-akse, Annexin V-FITC-fluorescens, linearscale) blev registreret. Dataene blev analyseret ved anvendelse af FACS CaliburCell Quest software (Becton Dickinson).

Analyse af mitokondrie membranpotentiale (A ^ m)

Flowcytometri analyse blev udført på celler under anvendelse af JC-1 farvestof som tidligere beskrevet [12]. HeLa-celler blev udpladet ved en podning densitet på 5 x 10

5 celler /brønd i plader med 6 brønde og fik lov at adhærere natten over ved 37 ° C i CO

2 incubator. Næste dag blev cellerne behandlet med FR

aq (0-80 ug /ml) i 24 timer. Dette blev efterfulgt af høst af cellerne, vask to gange med 1 × PBS efterfulgt af inkubation med frisk dyrkningsmedium indeholdende JC-1 farvestof (2,5 ug /ml) i 30 min ved 37 ° C i mørke. Farvede celler blev vasket to gange med iskold 1 × PBS, resuspenderet i 1 ml 1 × PBS og analyseret for Δψ

m

ved flowcytometri. FCCP (10 uM) blev anvendt som en positiv kontrol. Mindst 10.000 begivenheder blev talt per prøve og fluorescensintensiteterne blev målt ved 527 nm (grøn) og 590 nm (rød).

Påvisning af intracellulært calcium under anvendelse Fluo-3 /AM

HeLa-celler blev udpladet ved en podningsdensitet på 5 × 10

5 celler /brønd i 6-brønds plade og får lov at adhærere natten over. Næste dag blev cellerne behandlet FR

aq (0-80 ug /ml) i 24 timer ved 37 ° C i 5% CO

2. Efter inkubationen blev intracellulær Ca

2 + niveauer analyseret ved flowcytometri som tidligere [12] beskrevne. Kort fortalt blev cellerne belastet med 5 uM Fluo-3 /AM (Sigma, St. Louis, MO) og 100 ug /ml Pluronic F127 (Sigma, St. Louis, MO) i centrifugeglas og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO

2 i 1 time i mørke. Cellerne blev resuspenderet efter hver 20 min for at sikre jævn dye loading. Cellepellets blev vasket to gange med 0,9% saltvand og resuspenderet i 3 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) i FACS-rør. Lonomycin (30 uM) blev anvendt som en positiv kontrol. Fluorescensintensiteter blev målt ved 525 nm ved FACS Calibur (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) til opnåelse baseline aflæsninger. Middelkanalfluorescens intensiteter blev beregnet ved anvendelse af CellQuest software.

Statistical Analysis

Alle forsøgene blev udført tredobbelt og gentaget mindst tre gange, og data er blevet præsenteret som middelværdi ± SD. Statistisk analyse blev gennemført med SigmaStat 3.5-programmet (Systat Software, Inc.) ved hjælp af en-vejs ANOVA med α = 0,05.

Resultater

Ficus modulerer Vækst Kinetics af livmoderhalskræft celler

Vi har tidligere rapporteret, at

F. religiosa

udstillet betydelig antioxidant potentiale samt cytotoksicitet i livmoderhalskræft cellelinjer, HeLa og SiHa [22]. Baseret på det, vi valgte ikke-cytotoksiske koncentrationer af FR

aq (0-80 ug /ml) i SiHa (HPV-16) og HeLa (HPV-18) i vores assays. Det blev observeret, FR

aq faldt væksten af ​​cellerne i en dosis- og tidsafhængig måde. I SiHa, FR

aq faldt cellevæksten ved 80 ug /ml koncentration af ~4.78- (p = 0,008), ~4.72- (p = 0,001) og ~3.42-fold (p = 0,053) ved 24, 48 og 72 timer, sammenlignet med de ubehandlede kontrolceller (figur 1A). Ligeledes ved 80 ug /ml koncentration af FR

aq, HeLa-celler udviste ~5.53- (p≤0.001), ~5.94- (p = 0,010) og ~6.37-fold (p = 0,001) fald i cellevæksten 24, 48 og 72 timer, sammenlignet med de ubehandlede kontrolceller (figur 1b). Dette blev yderligere understøttet af kolonidannelse og blød agar-assays, hvori en dosisafhængigt fald i antallet af kolonier blev observeret i både de cervikale cancercellelinier (figur 1C og D, henholdsvis). Interessant, ved 80 pg /ml koncentration, FR

aq reducerede signifikant antallet af kolonier i HeLa (~4.97 fold; p≤0.001) og SiHa (~2.95 fold; p≤0.001) sammenlignet med deres respektive ubehandlede kontrolceller ( Figur 1D). Således Ficus reguleret vækstkinetikken af ​​livmoderhalskræft celler på en signifikant måde. Som en negativ kontrol, tog vi C33A (HPV negative) cellelinie og analyseret cytotoksiciteten af ​​FR

aq i den. Ficus inducerede ikke nogen cytotoksicitet op til 160 mg /ml koncentration i C33A celler, som var magen til den observeret i SiHa og HeLa (figur S1). Men ved højere koncentrationer, FR

aq induceret cytotoksicitet i alle tre cellelinier, hvori HeLa og C33A celler viste lignende cytotoksisk virkning.

SiHa (A) og HeLa (B) blev behandlet med FR

aq (0-80 ug /ml) i 24-72 timer, og antallet af levedygtige celler blev talt under anvendelse af trypan blå farvestof ekskluderingsmetode. Data repræsenterer gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. (C) De cervikale cancercellelinier (SiHa og HeLa) blev behandlet med FR

aq (0-80 ug /ml) i en uge. Kolonierne blev farvet med krystalviolet og fotograferet. Forsøgene blev gentaget tre gange. (D) Både SiHa og HeLa (5 x 10

3) langs med FR

aq (0-80 ug /ml) blev dyrket i blød agar i to uger. Kolonier blev talt fra mindst 10 forskellige områder og gennemsnittet af hver er blevet afbildet. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD af fem uafhængige forsøg.

Ficus inducerer G

1 Phase Anholdelse i SiHa og Ændrer Angivelse af cellecyklus regulerende proteiner

For at analysere den mekanisme bag Ficus medieret regulering af vækstkinetik i cervicale cancerceller, undersøgte vi cellecyklusfordeling i SiHa, HeLa og C33A. Flowcytometri-analyse viste, at i nærvær af FR

aq, SiHa udviste en stigning i G

1 population med en samtidig reduktion i S-fase i en dosisafhængig måde (figur 2A). Interessant, ved 80 pg /ml koncentration, var der en stigning i procentdelen af ​​celler i G

1 fase (59,88-72,33%) med en samtidig reduktion i S-fasen befolkning (fra 15,98 til 8,50%, p 0,050). På den anden side, i HeLa, var der en signifikant stigning i sub-G

0 populationen (fra 3,65 til 87,38%, p 0,001), hvilket indikerer apoptotisk population (figur S2). Interessant, ved ikke-toksiske doser, FR

aq påvirkede ikke væksten af ​​HPV negative C33A celler (figur S2).

SiHa-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af FR

aq (0- 80 ug /ml) i 24 timer. (A) Udvidet akkumulering af cellerne i G

1 fase med et samtidigt fald i S-fase population blev observeret efter behandling med Ficus (som angivet ved histogrammer). Western blot viser ekspressionsniveauer af p53 og pRb (B) såvel som p21 og ppRb (C). Tubulin blev anvendt som en loading kontrol. (D, E) Densitometrisk analyse af western blot viser fold ændring i protein niveauer på FR

aqtreatment. Båndene blev kvantificeret ved densitometri scanning ved hjælp ImageJ 1.44p (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij). Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg.

Vi undersøgte mekanismen for G

1 /S fasen anholdelse i SiHa ved at vurdere ekspressionen af ​​G

1 checkpoint proteiner såsom p53, pRb, phospho Rb (ppRb) og p21. Der var en signifikant stigning i ekspressionen af ​​p53 (figur 2B og D) samt dets nedstrøms effektor, p21 (figur 2C og E) efter behandling af cellerne med FR

aq. Ekspressionen af ​​pRb blev analyseret da dephosphoryleret pRb er kendt for at danne komplekser med E2F at undertrykke transskriptionen af ​​celleproliferative gener [30]. FR

aq, signifikant øget ekspression af pRb (figur 2B og D) med en samtidig reduktion i niveauerne af ppRb (figur 2C og E) i en dosis-afhængig måde. Disse resultater tyder på, at Ficus induceret G

1 /S anholdelse i SiHa ved at modulere ekspressionen af ​​de cellecyklus regulerende proteiner.

Ficus fremkalder apoptose i HeLa gennem Stigning i Cyt c og caspase 3 Expression

Vi fandt, at i HeLa, Ficus behandling resulterede i forøgelse af antallet af celler i sub-G

0 fase, indikerer apoptotisk population (figur S2). På farvning med Annexin V-FITC viste cellerne en dosisafhængig stigning i både tidligt og sent apoptotisk celle population (figur 3A). Interessant, ved 80 pg /ml FR

aq koncentration, var der ~4.4-fold (p≤0.050) og -5,5-fold (p≤0.050) stigning i både tidligt og sent apoptotisk cellepopulation, sammenlignet til de ubehandlede kontrolceller. På den anden side blev der ikke apoptose observeret i FR

aq behandlet SiHa eller C33A celler (Figur S3).

(A) repræsentative FACS piktogrammer af celler behandlet med FR

aq (0-80 ug /ml) er vist. Procent af annexin V-positive (tidligt-apoptotiske celler, nederste højre kvadrant) og Annexin V /PI-double-positive celler (sen-apoptotiske celler, øverste højre kvadrant) er angivet. (B) Flowcytometrisk analyse af den hurtige calciumfrigivelse i HeLa-celler efter behandling med FR

aq (0-80 ug /ml) har vist sig. Ionomycin blev anvendt som en positiv kontrol. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. (C) FACS-analyse efter JC-1-farvning af HeLa viste ændring af mitochondriemembranpotential efter FR

aq (0-80 ug /ml) behandling sammenlignet med ubehandlede kontrolceller. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg. (D) Western-blot viser ekspressionen af ​​cytochrom c fra cytosolisk fraktion. Tubulin blev anvendt som en loading kontrol. (E) Totalt protein blev isoleret og analyseret for ekspression af p53 og caspase 3 ved immunblotting. Tubulin blev anvendt som en loading kontrol. (F og G) Densitometrisk analyse af western blot, der viser gange ændring i proteinniveauer. Båndene blev kvantificeret ved hjælp af ImageJ 1.44p (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij).

Vi studerede Ca

2+ signalering mekanisme i celler behandlet med FR

aq og observerede, at det inducerede en dosisafhængig stigning i den intracellulære calciumniveauer (figur 3B). Ionomycin blev anvendt som en positiv kontrol. Interessant stigningen i intracellulært calcium resulterede i afbrydelse af det mitokondrielle membranpotentiale (A ^ m), som blev observeret ved fald i rød fluorescens intensitet, efter farvning af cellerne med JC-1 farvestof (figur 3C). Der var -3 gange reduktion i rød fluorescens intensitet (p≤0.001) ved 80 ug /ml koncentration af FR

aq. FCCP blev anvendt som en positiv kontrol i undersøgelsen. Mitokondriemembranen depolarisering var forbundet med en dosisafhængig stigning i cytosolisk cytochrom c (figur 3D og F), som blev ledsaget af en stigning i ekspressionen af ​​caspase 3 og p53 (figur 3E og G). Disse resultater indikerer, at Ficus induceret apoptose i HeLa gennem mitokondrie afhængige vej.

Ficus Fald invasion og Migration af SiHa og HeLa

sårheling assay blev udført i både cellelinier og det blev observeret, at Ficus inhiberede effektivt migrationen af ​​både SiHa (figur 4A) og HeLa (figur 4B) på en dosis- og tidsafhængig måde sammenlignet med de ubehandlede kontrolceller. Efter 16 timer, de ubehandlede SiHa og HeLa-celler var i stand til at dække op ~82% af såret, mens 80 ug /ml FR

aq behandling, dækket cellerne op såret ved ~33% (p 0,001 ) og 22% (p 0,001), henholdsvis (figur 4C). På denne særlige dosis, Ficus reducerede invasiv evne af både SiHa og HeLa ved ~2.45- (p≤0.001) og ~3.8-folder (p≤0.001), sammenlignet med de ubehandlede kontrolceller (figur 4D).

Analyse af cellemigrering i SiHa (A) og HeLa (B) behandles med FR

aq (0-80 ug /ml) blev målt ved sårheling assay. Det øverste panel af billedet viser såret foretaget ved 0 timer. Det nedre panel viser migreringen af ​​celler, der svarer til den afstand, ved 16 timer. (C) Grafisk fremstilling af sårlukning i SiHa og HeLa-celler ved 16 timer efter FR

aq behandling er blevet vist. Værdier blev repræsenteret som procent sårlukning og udtrykt som middel ± SD for tre uafhængige forsøg. (D) celleinvasion assay viser procentdelen af ​​celler invaderet pr felt i nærvær eller fravær af FR

aq. De invaderede celler blev talt i ti tilfældige felter, og værdierne er blevet udtrykt som middel ± SD for tre uafhængige forsøg. (E) gelatinezymografi viser nedregulering af MMP-2-ekspression i FR

aq (0-80 ug /ml) behandlet SiHa og HeLa. (F) Western blot-analyse, der viser fald i Her-2 ekspression i SiHa og HeLa behandlet med FR

aq (0-80 ug /ml). Tubulin blev anvendt som en loading kontrol. (G) Densitometrisk analyse af western blot viser fold ændring i HER-2 protein niveauer i SiHa og HeLa. Båndene blev kvantificeret ved densitometri hjælp ImageJ 1.44p (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij).

Det er velkendt, at øget ekspression af MMP’er i tumorvæv er associeret med cancer cell matrixnedbrydning, invasion samt metastase [31]. Vi observerede, at FR

aq betydeligt nedreguleret ekspression af MMP-2 i både SiHa og HeLa-celler (Figur 4E) sammenlignet med de ubehandlede kontrol celler.

HER2 /

neu

er blevet rapporteret at forbedre metastatiske potentiale cancerceller [32] og er positivt korreleret med MMP-2-ekspression [33]. Vi fandt, at FR

aq faldt ekspressionen af ​​Her-2 på en dosis-afhængig måde i både SiHa og HeLa (Figur 4F og G). Data tyder på, at Ficus reducerede migration samt invasion af livmoderhalskræft celler ved at modulere ekspression af Her-2 og MMP-2 proteiner.

Ficus Reducerer Angivelse af virale oncoproteiner E6 og E7

Da, Ficus udviste signifikant antineoplastisk potentiale i både HPV16 (SiHa) og HPV18 (HeLa) positive cellelinier, undersøgte vi ekspressionen af ​​de virale proteiner E6 og E7 i de behandlede og ubehandlede celler. Det blev observeret,, FR

aq reducerede signifikant ekspression af E6 og E7 oncoproteiner i både SiHa og HeLa (figur 5A og B, henholdsvis). Ved 80 ug /ml FR

aq koncentration, blev ekspressionen af ​​E6- og E7-proteinerne faldt med ~3.0- (p≤0.001) og 3,7-folder (p≤0.001) henholdsvis i SiHa (figur 5A og C) og ved ~3.2- (p≤0.001) og 4,0-folder (p≤0.001) henholdsvis i HeLa sammenligning med de ubehandlede kontrolceller (figur 5B og D). Således Ficus faldt ekspressionen af ​​de virale oncoproteiner E6 og E7, hvilket potenserer dets terapeutiske signifikans i regulering cancer.

Ekspressionen af ​​E6 og E7 oncoproteiner blev bestemt ved immunoblotting med E6 og E7 antistoffer i SiHa (A) og HeLa (B) behandles med FR

aq (0-80 ug /ml). Tubulin blev anvendt som en loading kontrol.