PLoS ONE: Omfattende Genomisk Analyse af en BRCA2 Mangelfuld Menneskelig Bugspytkirtelkræft Cancer

Abstrakt

Capan-1 er et godt karakteriseret

BRCA2

deficiente human cellelinie isoleret fra en levermetastaser af en pancreas adenocarcinom. Her rapporterer vi en genom-dækkende vurdering af strukturelle variationer og høj dybdegående exome karakterisering af enkelt nukleotid varianter og små indsættelse /sletninger i Capan-1. For at identificere potentielle somatiske og tumorassocierede variationer i fravær af en matchet-normal cellelinje, vi udtænkt en hidtil ukendt fremgangsmåde baseret på en analyse af HapMap prøver. Vi viser, at Capan-1 har en af ​​de mest omlejrede genomer sekventerede til dato. Endvidere er små insertioner og deletioner detekteret hyppigere i forbindelse med korte sekvensgentagelser end i andre genomer. Vi identificerer også en række nye mutationer, der kan repræsentere genetiske ændringer, der har bidraget til tumor progression. Disse data giver indsigt i de genomiske virkninger af tab af BRCA2-funktion

Henvisning:. Barber LJ, Rosa Rosa JM, Kozarewa I, Fenwick K, Assiotis I, Mitsopoulos C, et al. (2011) Omfattende Genomisk Analyse af en

BRCA2

Mangelfuld Menneskelig kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 6 (7): e21639. doi: 10,1371 /journal.pone.0021639

Redaktør: Robert Oshima, Sanford-Burnham Medical Research Institute, USA

Modtaget: Marts 17, 2011; Accepteret: 3 juni 2011; Udgivet: 5 jul 2011

Copyright: © 2011 Barber et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne tak Gennembrud Breast Cancer, Cancer Research UK, og American Association for Cancer Research /Stand Up til kræft for finansiering dette arbejde. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Personer heterozygote for tab af funktion mutationer i tumorsuppressorgen

BRCA2

er stærkt disponeret for en række forskellige cancere. Kvinder, der arver en mutant

BRCA2

allel har en signifikant meget forhøjet levetid risiko for at udvikle brystkræft og ovariecancer [1]. Derudover er mandlige brystkræft og prostatakræft stærkt forbundet med

BRCA2

genmutationer [2]. Hos begge køn,

BRCA2

mangel øger risikoen for at udvikle kræft i bugspytkirtlen, maven, galdeblæren, og galdegang, samt melanom [3]. Behandlingen af ​​kræft i bugspytkirtlen præsenterer betydelige udfordringer som de fleste patienter til stede med lokalt fremskreden eller metastatisk sygdom og konventionelle anticancer behandlingsformer viser begrænsede effektivitet; kun 5% af patienter med kræft i bugspytkirtlen overlever mere end fem år fra den første diagnose [4], [5].

BRCA2 spiller en central rolle i opretholdelsen af ​​genomisk integritet, navnlig gennem regulering af DNA-reparation ved homolog rekombination reparation (HR) [6] en proces, der også styres af en anden tumorsuppressorprotein, BRCA1 [7]. HR er en stort set fejlfri proces, der genskaber den oprindelige sekvens ved stedet for en DNA dobbelt-strenget pauser (DSBs) [8]. DSBs opstår relativt ofte og kan være forårsaget af normale cellulære replikation samt eksogene stress såsom udsættelse for ioniserende stråling [9]. I mangel af HR, for eksempel på grund af tab af BRCA2 funktion, DSBs synes at repareres af flere fejlbehæftede processer, der i sidste instans fører til akkumulering af grove kromosomale rearrangementer [10]. Det menes, at udnyttelsen af ​​fejlbehæftede DNA reparation processer i fravær af BRCA2 funktion sandsynligvis fremmer tumorudvikling [10]. Som en del af sin rolle i HR, BRCA2 styrer lastning og fjernelse af DNA rekombinase RAD51 på DSBs. Den resulterende RAD51-ssDNA filament medierer at finde en homolog DNA-sekvens til skabelon reparation af DSB [11].

På trods af den store interesse for BRCA2 funktion og dens rolle i tumorudvikling og DNA-reparation, der er få tumorcellelinier modeller af BRCA2 mangel, der kan anvendes produktivt i laboratoriet. Af disse Capan-1 er den mest velkarakteriserede. Capan-1 blev afledt af en levermetastaser i en 40-årig kaukasisk mand med en primær pancreas adenocarcinom [12], [13]. Disse celler mangler et funktionelt

BRCA2

allel og i stedet bære en

c.6174delT

allel. Den enkelt base sletning ved

c.6174

forårsager en læserammeforskydning, (p.S1982fs * 22), hvilket resulterer i tab af C-terminale 1416 aminosyrer af proteinet [14], [15]. Det resulterende trunkerede protein mangler to BRC-motiver involveret i interaktionen mellem BRCA2 med RAD51 og ssDNA [16], samt C-terminale sekvenser menes at være nødvendig for nuklear lokalisering af BRCA2 og RAD51 /DNA demontering [17], [18] . Denne trunkerede BRCA2 isoform har vist sig at være både cytoplasmiske og dysfunktionel i HR [19], [20]. I overensstemmelse med det koncept, at BRCA2 dysfunktion fører til genomisk ustabilitet, har SKY karyotype analyse viste, at Capan-1 har en hypotriploid genom, med 36 definerede strukturelle omlejringer fordelt over hele genomet [21]. Størstedelen af ​​disse omlejringer sandsynligvis meget komplekse og synes at involvere mere end tre kromosom segmenter, selv om to gensidige translokationer (t (6; 15) og t (7; 10)) er blevet beskrevet (www.path.cam.ac. uk /~ pawefish).

betragtning af den store anvendelse af Capan-1-cellelinien som model ikke blot BRCA2 dysfunktion, men også af pancreascancer, anvendte vi næste generation sekventering teknologi til at studere den genomiske sekvens af dette cellelinje.

Resultater

DNA-sekventering strategi

for at identificere kandidat strukturelle rearrangementer vi først genereret en mellemlang dybde hele genomet sekvens af Capan-1. Vi isoleret DNA fra en Capan-1-celler, og genererede et 500 bp fragment DNA-bibliotek ved anvendelse af en PCR-fri tilgang, der forbedrer bibliotekskompleksitet [22]. Denne DNA-bibliotek blev sekventeret ved hjælp af en parret-end strategi for en Illumina GAIIx Genome Analyser, hvilket giver 365.811.868 rå 76 bp mate-parret læser (27,8 Gb). Efter tilpasning til en reference humane genom (hg19 /build37) og den efterfølgende filtrering for at fjerne PCR dubletter og dårlig kvalitet læser, disse data gav tilstrækkelig genom dækning (90,09%) til undersøgelse af strukturelle omlejringer ved en median dybde på 8,55 fold (tabel 1, tabel S1).

for at undersøge den kodende sekvens af Capan-1 i større dybde, vi brugte en målrettet berigelse strategi baseret på Agilent SureSelect in-løsning capture. Vi udnyttede den SureSelect Humant All Exon kit, designet til at fange større end 38 Mb af humant genomisk DNA svarende til NCBI Consensus CDS database. To uafhængige capture hybridiseringer blev udført på ca. 200 bp fragmenter af Capan-1-genomisk DNA. De resulterende exome biblioteker blev sekventeret på en Illumina GAIIx hjælp parret udgang 2 × 76 bp sekventering kørsler. Dette gav 130.310.847 rå læser (9,9 Gb). I lighed med hele genomanalyse, sekvens læser fra capture-processen blev justeret til en reference humane genom (hg19 /build37) under anvendelse Burrows-Wheeler Aligner (BWA, [23]) og derefter filtreret for at fjerne PCR dubletter og dårlig kvalitet læser. Den procentdel af læser på målet var 65% og nåede en endelig dækning på 98,51% for de agn regioner med en median dybde på 89 gange (Tabel 1, Tabel S2), der langt overstiger de 30 gange dybde skal identificere genetiske varianter i tumorprøver [24].

i både hele genomet og exome sekventering strategier, mere end 80% af læsninger blev tilpasset i forbindelse med deres respektive mate-par (tabel 1). I tilfælde af hele genomet re-sekventering, 5,63% af læser kortlagt til et andet kromosom end deres mage-pair, og yderligere 10,31% af læsninger blev forældreløse, dvs. hvor mate-parret blev ikke justeret på grund af overdreven N eller fejlparringer /indels (tabel 1). Dette understøtter tidligere lav opløsning spektrale karyotype analyser (SKY) i Capan-1, der tyder på en meget omarrangeret genom [21]. For exome sekvens, lidt færre læsninger blev justeret uafhængigt af deres mate-pair end for hel-exome sekventering, måske antyder, at omrokeringer inden den kodende region forekom mindre hyppigt i Capan-1 end i ikke-fremkaldende regioner (tabel 1).

sekvens dybde tværs genomet blev sammenlignet med data fra række komparativ genomisk hybridisering (aCGH) (fig. S1, tabel S1). Generelt medianen dybde for hvert kromosom identificeret ved sekventering matches kopiantal profil frembragt ved aCGH (fig. S1). For eksempel, kromosomer såsom 4 og 6, at ved aCGH syntes at være til stede i to eksemplarer, viste overvejende selv dybde på tværs hele deres længde. Desuden enkelt kopi X-kromosom returneres cirka halvdelen af ​​antallet af læsninger af kromosomer 4 og 6. Den tidligere rapporteret [21], [25] homozygot deletion af 9p21 involverer

CDKN2A

, og tab af flertallet af kromosom Y, blev også bekræftet ved sekventering. (figur 1A;. figur S1, tabel S1)

A. Genom-dækkende Circos plot af de omrokeringer identificeret i Capan-1 ved breakdancer analyse. En ideogram af en normal karyotype, er vist i den ydre ring, og kopiantallet er repræsenteret ved den blå linje i midten ringe. Den relative position og klasse af hver omlejring er afbildet inden for den indre cirkel, som beskrevet i teksten. B. Sammenligning af det samlede antal inter- og intra-kromosomale omlejringer opdaget af breakdancer analyse i et panel af

BRCA2

,

BRCA1

, og ikke

BRCA

muteret cellelinjer og primære tumorer. C. Prøverne blev klassificeret som

BRCA

-mutated (mut) eller BRCA vildtype (wt), og antallet af inter-, intra-kromosom, og den samlede omlejringer blev sammenlignet. p-værdier refererer til Mann Whitney-analyse med Gaussisk tilnærmelse. D. Sammenligning af procentdelen af ​​hver enkelt klasse af omlægning i hver prøve. Prøver er klassificeret som

BRCA2

,

BRCA1

, og ikke

BRCA

muteret, som i B.

Strukturel variation

for at identificere kandidat strukturelle omlejringer, vi analyserede hele genomet sekvens af Capan-1 ved hjælp breakdancer [26]. Vi anvendte en stringent filtrering metode, der kun blev identificeret omlejringer støttes af mindst ti læser (median dybde tværs genomet var 8.55x). Denne fremgangsmåde identificeret 354 store strukturelle variationer i Capan-1, som blev sub-klassificeret som intrakromosomal deletioner, insertioner, inversioner eller inter-kromosomale direkte eller inverteret translokationer (fig. 1A). Ingen indrykninger blev påvist i denne analyse, da de alle faldt inden for grænserne af normale fragment størrelsesfordelingen (1-1000 bp).

Da Capan-1 er en BRCA2 mangelfuld model, vi undersøgte muligheden for, at mediet dybde, kan hele genomet sekventering anvendes til at skelne BRCA1 og BRCA2 deficiente tumorer fra ikke-familiære former. Til dato har to BRCA2 mangelfulde tumorer, to BRCA1 mangelfuld tumorer og to BRCA1 mangelfuld cellelinjer også været udsat for mellemlange dybde hele genomet sekventering, som en del af en bredere undersøgelse af primære brysttumorer og cellelinier [27]. Vi opnåede de rå data fra denne undersøgelse [27], og behandles det gennem vores egen pipeline, som omfattede analyse med breakdancer. På den måde kunne vi direkte sammenligne hyppigheden og typen af ​​strukturelle omlejringer identificeret i Capan 1 med både BRCA mangelfuld og dygtige primære brysttumorer og cellelinier (fig. 1B-D). Af alle de undersøgte genomer, Capan-1 udviste de mest strukturelle omlejringer, både inter- og intrakromosomal (fig. 1B). Selvom det prøvenummer under undersøgelsen var relativt lav (n = 7

BRCA

mutant tumorer vs. n = 15 ikke

BRCA

mutant tumorer) sammenligning af Capan-1-data med data fra

BRCA2

mutant primære brysttumorer og

BRCA1

mutant primære brysttumorer og cellelinier gjorde foreslå en tendens til BRCA mangelfulde prøver at udstille større antal af strukturelle omlejringer, (median antal for

BRCA

mutant tumorer = 72 omrokeringer, median antal for ikke

BRCA

mutant tumorer = 41;. figur 1C), i overensstemmelse med de roller BRCA1 og BRCA2 at opretholde genomisk stabilitet. Selvom denne observation var ikke statistisk signifikant (p = 0,1368, Mann Whitney), dette kunne tilskrives den lave stikprøvestørrelse. Da mutationer i andre end gener

BRCA1

BRCA2

påvirke HR, er det muligt, at nogle af prøverne er klassificeret som “ikke-

BRCA

” kunne også har en lignende HR-mangel til

BRCA1 /2

mutant tumorer. Den procentdel af de samlede omrokeringer i hver klasse blev også sammenlignet på tværs af

BRCA

-mutant og ikke-mutant grupper (fig. 1D). I Capan-1, som i de fleste af de andre genomer, intrakromosomal deletioner var den hyppigste klasse af omlejring. Der var imidlertid ikke nogen klar type eller mønster af rearrangementer, der var specifikke for

BRCA

-mutant celler, baseret på denne lille sæt prøver.

er tidligere blevet identificeret en række grove strukturelle rearrangementer i Capan-1 ved hjælp af spektrale karyotype (SKY) analyse [21]. Men opløsningen af ​​SKY analyse er forholdsvis lav, og i mange tilfælde koordinere holdninger mange af de formodede omlejringer identificeret med denne form for analyse kan ikke forudsiges med nogen stor tillid. På baggrund af denne, vi kun forsøgt en sammenlignende analyse af NGS data med SKY data hvor koordinere holdninger SKY forudsagde omlejringer kunne gøres inden ~ 10 Mb. Denne sammenlignende analyse antydede, at seks af de tidligere identificerede omlejringer også kunne identificeres ved anvendelse af hele genomet sekventering, men ved højere opløsning (tabel 2). En yderligere kompleks omlejring mellem kromosomer 6, 8, og 17 var tidligere blevet foreslået af SKY analyse, men ikke tilstrækkelig detaljeret at belyse de nøjagtige regioner af hvert kromosom involveret. Vores analyse foreslog også komplekse translokationer mellem kromosomer 6 og 8, og mellem 8 og 17 (tabel 2).

Interessant, elleve af de identificerede interchromosomal omlejringer identificeret i Capan-1 viste sig at falde sammen med fremkaldende regioner ved begge breakpoints, potentielt tyder genfusion hændelser (tabel 3). Ingen af ​​disse fusioner er tidligere blevet beskrevet i Cancer Genome Census [28]. Yderligere 42 omlejringer blev inden for et gen eller opstrøms regulatoriske regioner i den ene breakpoint, som også kunne have skadelige virkninger (tabel S3). En af disse omrokeringer havde et breakpoint i et gen,

ZNF521

, som for nylig blev identificeret som genstand for kromosomale translokationer i akut lymfoblastær leukæmi [29]. Yderligere 118 gener syntes at blive påvirket af intrakromosomal rearrangementer (tabel S4).

Exome enkelt nukleotid variant (SNV) og Indel opdagelse

For at identificere SNVs og små indsættelse /sletning ( InDel begivenheder) i den kodende sekvens af Capan-1, anvendte vi SAMtools [30] for pile-up analyse af den høje dybtgående exome sekvens og efterfølgende SNV kald. Små indels (1-6 bp) blev identificeret ved hjælp af en brugerdefineret rørledning (se metoder). Større Indel opdagelse blev opnået ved hjælp Pindel [31]. I første omgang blev varianter filtreret for at udelukke dem, opdaget i en dybde på mindre end ti læser pr kopi. SNVs og indels refereres som generel population polymorfier i dbSNP blev også set bort fra, da vi var stort set interesseret i at identificere sandsynlige kræft-specifikke ændringer.

Ligesom de fleste tumor-afledte cellelinjer, Capan-1 ikke har et matchet normal cellelinje fra den samme patient, der kunne anvendes til at identificere cancerspecifikke ændringer og fjerne artefakter som følge af både prøve produktion og tilpasning. I lyset af dette, udviklede vi en proces med filtrering for exome resekventering baseret på tværs af sammenligning med data fra det analoge prøveforberedelse og analyse af fire normale genom HapMap prøver (NA11881 (mandlig) NA12761, NA12813, og NA12892 (kvindelige )) (tabel S5). Ved hjælp af disse HapMap prøver, var vi i stand til at fjerne artefakter skyldes både prøve produktion (f.eks variation i hybridisering effektivitet) og tilpasning (f.eks homologe regioner).

Analyse af data fra exome resekventering af HapMap prøver aktiveret os til at fastsætte tærskelværdier for homozygositet (variant læser 88% eller 10% i alt) og heterozygositet (variant læser 33-67% i alt) af varianter. Disse tærskler blev brugt til at filtrere de identificerede SNVs og indels i Capan-1 genomet. Som vi var interesserede i at identificere kandidat tumor-specifikke mutationer, vi bort fra alle mutationer, der blev også påvist i de HapMap prøver, som en omtrentlig normalisering for sandsynligt germlinie variation.

Som en yderligere grad af stringens vi også velovervejet kopi nummer skifter hele Capan-1-genomet, som defineret af aCGH analyse. Dette er især relevant for højt omarrangerede og aneuploide genomer, såsom Capan-1. Baseret på vores erfaring, brug af regionsspecifikke filtre til sekventering dybde letter mere pålidelig variant identifikation. Det er klart, heterozygote varianter kaldes i enkelte kopi regioner er sandsynligvis falsk (sandsynligvis på grund af forskydning), og andre steder, hvor mange læser bærer variant allel kan svinge forskelligt afhængigt af kopien nummer status. Derfor tærskler tillid blev anvendt til både SNV og Indel opdagelse, der kræver et minimum af 10 læser pr genomisk kopi. Desuden læser mindst tre variant skulle kalde en SNV og mindst syv variant læser for indels pr genomisk kopi. Den resulterende katalog over SNVs og indels identificeret i Capan-1 er detaljeret i tabel S6 og S8, henholdsvis.

Karakterisering af kodning SNVs

lille produktion kandidat gen sekventering studier i Capan-1 har tidligere identificeret tre homozygote SNVs i

KRAS

,

Smad4

MAP2K4

. Brug exome sekventering, var vi i stand til at opdage alle tre af disse ændringer:

KRAS

c.35G T mutation, der forårsager det klinisk relevante p.G12V aminosyresubstitution [32], [33], c .1028C G SNV i

Smad4

som resulterer i en tidlig stopkodon [34] og

MAP2K4

c.661G T mutation i Capan-1, hvilket fører til en cancer-associeret proteinafkortning [35]. Fremkomsten af ​​alle tre af disse mutationer i den endelige filtrerede liste over exome varianter, gav tillid til vores analyse rørledninger (tabel S6).

Brug high-dybde exome sekventering, vi identificerede i alt 608 SNVs i Capan -1, der påvirker 1270 forskellige udskrifter (tabel 4). De fleste mutationer (61%) blev fundet i ikke-kodende områder (ikke-kodende gener eller introns), eller var synonyme varianter. Fireogtyve procent af de ramte udskrifter blev ændret af ikke-synonyme kodning ændringer. I alt blev der registreret ikke-synonyme SNVs i 206 forskellige gener, 56 som var homozygot (tabel S6). Tolv gener fik præmature stopkodoner, hvoraf fire var homozygot (

GRIA3

,

GRM1

,

MAP2K4

,

Smad4

). Betydeligt, antallet af sandsynlige somatiske kodende mutationer detekteret for Capan-1 i denne undersøgelse sammenlignede meget positivt med dem der er vist i tidligere undersøgelser, der har undersøgt tumorcellelinjer COLO-829 (172 ikke-synonym SNV) [36] og NCI-H209 (94 ikke-synonym SNV) [24]. Begge disse tidligere undersøgelser identificerede somatiske mutationer ved sammenligning med en matchet normal blod DNA kontrol fra den samme patient, hvilket tyder på, at vores brug af HapMap exomes er et effektivt alternativ til identifikation af somatiske mutationer i Capan-1, og andre “sjældne” celle linjer

Tre af romanen potentiale beskærer mutationer blev valgt til validering af Sanger sekventering:.

GRM1 Hotel (

c.C1458A

, p.Y486 *),

SMAP2 Hotel (

c.C764G

, p.S255 *), og

GLT6D1 Hotel (

c.G593A

, p.W198 *). Alle tre viste sig at være sande SNVs, og det registreres af exome sekventering zygositet blev også bekræftet af Sanger sekventering: homozygot for

GRM1

, heterozygote for

SMAP2

GLT6D1

(fig. 2A-C).

GRM1

koder for en metabotropiske glutamatreceptor, afvigende ekspression er blevet foreslået at spille en rolle i udviklingen af ​​melanom [37]. SMAP2 er en ARF1-specifik GTPase-aktiverende protein involveret i clathrin-afhængig membran handel [38].

GLT6D1

genet koder et endnu ukarakteriseret glycosyltransferase-6-domæne-holdigt protein.

A. Chromatogram skildrer stop-gain SNV i

GRM1

opdaget for Capan-1. Protein- og genomisk reference- sekvenser er vist ovenfor kromatogrammet. Den SNV er fremhævet med blåt i referencesekvensen, og den ramte rest er understreget. B. Som A, for

SMAP2

. C. Som A, for

GLT6D1

. D. Sammenligning af de enkelte basen substitution frekvenser i Capan-1, basal-lignende bryst tumor, NCI-H209, COLO-829, og U87 MG genomer. E. Sammenligning af hele genomet og exome-specifik basis substitution frekvenser observeret i Capan-1.

Alle de nye SNVs identificeret her var krydsrefereret med en række online-databaser (finkæmme [39 ], [40], Mutation Taster [41], [42], DAVID [43], [44], CGC [28], [45]) til at forudsige deres evne til at modificere proteinfunktion. En af de mest interessante kandidater var en homozygot c.

C162A

mutation i

FZD10

, et medlem af frizzlede gen familien, som koder Wnt ligandbindende receptorer [46]. Den homozygote

c.C162A

variant påvist i denne undersøgelse fører til en ikke-synonym aminosyresubstitution (p.N54K) ved en særdeles konserveret rest i den formodede Wnt ligand-bindende site (FZ domæne) [47] , [48]. FZD10 er en positiv regulator af Wnt-βCatenin-TCF signalvej, har vist sig at være opreguleret i primære colorektale tumorer [49], og Wnt-beta Catenin signalering vides at være afvigende i nogle pancreas adenocarcinomer [50].

Tre homozygote varianter var til stede i tumor suppressor

DCC Hotel (

slettet i kolorektal karcinom)

, som koder for en netrin receptor kræves for celledifferentiering [51], og også induktion af apoptose i fravær af ligand [52]. Mutationer og tab af

DCC

tidligere har været impliceret i kræft i bugspytkirtlen, samt en række andre tumortyper [52], [53]. En af de tre hidtil ukendte varianter detekteret i Capan-1 blev anbragt i donorsplejsningssitet af intron 20-21, fire baser nedstrøms for den kritiske GT motiv. De to andre varianter gav anledning til ikke-synonyme protein mutationer (p.L1042 M og p.K1411T). Selvom ingen af ​​disse sidstnævnte ikke-synonyme mutationer er blevet tidligere rapporteret, er begge placeret tæt på rester af interesse: p.F1039S, muteret i adenocarcinom [54]; og p.Y1418, en kritisk rest phosphoryleres af Fyn, og der kræves for DCC-funktion [55].

krydsreferencer af de fundne i Capan-1 med Cancer Gene Consensus (CGC) [28] SNVs, [45] identificeret tolv gener, der tidligere har vist sig at være muteret på andre rester i cancer cellelinjer eller primære tumorer. Ingen af ​​de varianter identificeret i Capan-1 i denne undersøgelse er tidligere blevet beskrevet. Størstedelen af ​​disse ændringer var ikke-kodende eller synonyme ændringer (tabel S7). En heterozygot ikke-synonym mutation blev observeret i genomet stabilitet checkpoint faktor

ataksi Telangiectasia muterede Hotel (

ATM

). Men varianten rest (p.R1585S) ligger uden for nogen kendte funktionelle domæner, og det er derfor vanskeligt at forudsige de funktionelle konsekvenser af denne ændring. En anden roman heterozygot ikke-synonym mutation blev identificeret i

TPR Hotel (

omplantes Promotor Region

), som koder for et protein, der interagerer med den nukleare pore kompleks. Denne mutation (p.V779I) omfatter en konserveret rest inden for et kendt motiv fælles for kromosom segregation proteiner, selvom valin til isoleucin-substitution identificeret her er sandsynligvis være neutral.

Mønstre af uædle substitution

Vi ønskede at vurdere, om mønstret af enkelte basesubstitutioner i Capan-1 afspejlede, at andre kræft genomer. De tidligere offentliggjorte human cellelinie genomer, COLO-829 [36], og NCI-H209 [24] hver udviser en karakteristisk mønster af basesubstitutioner, repræsentant for UV- og tobak kræftfremkaldende eksponering henholdsvis. Vi indsamlet hos disse studier, ud over den for glioblastoma-cellelinien U87 MG [56], og en basal-lignende brysttumor [57], til sammenligning med Capan-1. Sammenlignende analyse af disse sekvenser antydede, at Capan-1 ikke udviste en indlysende mønster af basesubstitutioner eller en entydig signatur repræsenterer et bestemt mutagen. De fleste af de kodende udskiftninger (~45%) i Capan-1 var C T /G A, selv om disse ikke var så dominerende som observeret i COLO-829 celler, hvor C T overgange på dipyrimidine sites, tegn på UV-eksponering , dominerer [36] (fig. 2D). Baseret på det begrænsede antal cancer genomer, der er blevet sekventeret til dato, mønstret af basesubstitutioner observeret for Capan-1 mest ligner den for U87 MG og basal-lignende brystcancer, kun afviger betydeligt i procentdelen af ​​A G /T c. mutationer (. figur 2D)

Vi sammenlignede også mønstret af basesubstitutioner i Capan-1 i hele genomet versus exome. Vi observerede, at mønstret stort set det samme i kodning og ikke-kodende regioner, bortset fra at C T /G A mutationer var repræsenteret ved en højere frekvens i exome, med samtidige lavere antal A C /T G udskiftninger (fig. 2E).

Karakterisering af kodning indels

Som for SNVs, nye indels identificeret i Capan-1-cellelinje blev filtreret efter at kopiere nummer. Vi bemærkede, at 93 gener blev påvirket af små indels, der spænder fra et til seks basepar (tabel S8). Flere deletioner blev identificeret sammenlignet med insertioner (tabel 5), som ville forventes fra brugen af ​​gapped-alignment metoder. 18 af de indels (ni indrykninger, ni deletioner) var homozygote varianter, mens 62 var heterozygot (27 indrykninger, 35 deletioner). I lighed med SNVs blev variation effekter klassificeres efter udskrift (163 tværs af de 93 gener), og størstedelen af ​​indels (72%) blev påvist i ikke-kodende regioner. Blot 13% af indels forårsagede rammeforskydninger og 15% ramte splejsning-sites. Kendetegnet

BRCA2 c.6174delT

mutation i Capan-1 [14], [15] var en af ​​de 15 gener scoret som værende påvirket af rammeskift kodning sletninger.

En delmængde de yderst overbevisende kodende rammeskift blev valideret ved PCR og konventionel Sanger sekventering, under anvendelse af en biologisk replikat genomisk DNA-prøve. Otte nye rammeforskydninger (homozygot:

PAPLN

; Heterozygot:

EPHB2

,

LRRC7

,

DDIT4L

,

ADD 3

,

SF1

,

C17orf57

, og

ZNF599

) til stede i Capan-1, men ikke påvist i HapMap genomer blev bekræftet af Sanger sekventering, ud over yderligere 17 rammeforskydninger og 10 tre basepar indels fælles for både Capan-1 og HapMap. Alle de hidtil ukendte rammeforskydninger, samt i-ramme indels, blev bekræftet af Sanger-sekventering (fig. 3A-D og data ikke vist). Fem af de lavt forrentede rammeforskydninger der ikke har bestået de strenge filtre kunne ikke bekræftes, at støtte gyldigheden af ​​vores analyse. Nogle af de, der berøres af rammeforskydninger, såsom gener

EPHB2

, tidligere har været forbundet med tumorudvikling i andre organer [58], øge muligheden at en række af disse kan repræsentere nye driver mutationer.

A. Chromatogram skildrer sletning af C (markeret med blåt) i

PAPLN

opdaget for Capan-1. Den genomiske referencesekvens er vist over kromatogrammet. Pilen angiver placeringen af ​​sletningen. B. Som A, til sletning af C i

EPHB2

. C. Som A, T C SNV og sletning af T i

DDIT4L

. D. Som A, sletning af AG i

ZNF599

. E. Sammenligning af procentdelen af ​​indels af 1, 2, 3 eller 4 bp længde, der er flankeret af homologi i Capan-1, COLO-829, COLO-829BL, PD3689a, og PD3690a. Homologi defineres som har den samme sekvens som de indsatte eller slettede baser enten umiddelbart 5 ‘eller 3’ til Indel, som repræsenteret ved eksemplerne.

Sequence forbindelse indels

det er blevet fremsat den hypotese, at defekter i homolog rekombination, såsom dem, der skyldes tab af BRCA2 funktion, kan føre til en stigning i små deletioner [10], [59]. Disse kan være flankeret af repetitive sekvenser, hvis alternative processer DNA dobbelt-strenget pause reparation, såsom ikke-homolog ende sammenføjning eller enkeltstrenget annealing er involveret i restaurering [10], [15], [59]. På dette grundlag undersøgte vi den umiddelbare sekvens forbindelse med de små indels detekteret i Capan-1-genomet, og sammenlignet disse til de to

BRCA2

deficiente tumorer sekventeret i Stephens datasættet [27], ud over de

BRCA

-proficient COLO-829 og COLO-829BL matchede par [36]. Indels blev kategoriseret efter længde (1, 2, 3 eller 4+ bp), og scorede for, om den flankerende sekvens enten 5 ‘eller 3’ til Indel var identisk med den indsatte sekvens /deleteret (fig. 3E). I Capan-1 /HapMap sammenligning, mere end 60% af de detekterede i Capan-1 indels var identiske med flankerende sekvens. Det er væsentligt mere end det kunne forventes ved et tilfælde alene (50, 12,5, 3, og 0,8% for henholdsvis et 1, 2, 3, og 4 bp Indel) og var betydeligt højere end observeret i in COLO-829 /Colo- 829Bl sammenligning, hvor formentlig HR er aktiv. Capan-1 udviser en større frekvens af indels forbundet med homologi end COLO829 trods af den meget højere dybde af genomiske sekvens genereret for COLO829. er derfor bemærkningerne til Capan-1 usandsynligt, at være en artefakt som følge af forskellene i sekventering dybde. Endvidere er fortsat høj for alle længder af indels i Capan-1, som kontrast til de andre cellelinjer (Fig. 3E) sammenhængen mellem indels og flankerende homologi.

BRCA2

deficiente tumorprøver PD3689a og PD3690a har lavere frekvenser af indels flankeret af homologi, selv om det er muligt, at disse priser er underrepræsenteret grund af den lave sekvens dybde anvendes i deres analyse (fig. 3E) . Tilsammen denne observation antyder, at

BRCA2

deficiente tumorceller kan være disponeret for en hyppigere forekomst af indels i korte repetitive sekvenser.

Diskussion

Her har vi genereret den første omfattende genom sekvens analyse af en

BRCA2

deficiente cellelinje. Det repræsenterer også den første sådan sekvens af et meget anvendt cellelinie afledt fra et pancreas-tumor.