PLoS ONE: præklinisk udvikling af et humaniseret anti-CD47 antistof med Anti-Cancer terapeutiske potentiale

Abstrakt

CD47 er en bredt udtrykt celleoverfladeprotein, der fungerer som en regulator af fagocytose medieret af celler i det medfødte immunsystem, såsom makrofager og dendritiske celler. CD47 tjener som liganden for en receptor på disse medfødte immunceller, SIRP-alfa, som igen leverer en inhiberende signal for fagocytose. Vi har tidligere fundet forøget ekspression af CD47 på primær human akut myeloid leukæmi (AML) stamceller, og vist, at blokering af monoklonale antistoffer rettet mod CD47 aktiveret fagocytose og fjernelse af AML, non-Hodgkins lymfom (NHL), og mange faste tumorer i xenograft modeller. Her rapporterer vi udviklingen af ​​et humaniseret anti-CD47-antistof med potent effekt og gunstige toksikokinetiske egenskaber som en kandidat terapeutisk. En hidtil ukendt monoklonalt anti-humant CD47-antistof, 5F9, blev genereret, og antistofhumanisering blev udført ved podning af dets komplementaritetsbestemmende regioner (CDR’er) på et humant IgG4 format. Den resulterende humaniseret 5F9 antistof (Hu5F9-G4) bundet monomer menneskelig CD47 med en 8 nM affinitet. Hu5F9-G4 induceret potent makrofag-medieret fagocytose af primære humane AML-celler in vitro og helt udryddet menneskelige AML in vivo, hvilket fører til langsigtede sygdomsfri overlevelse for patient-afledte xenotransplantater. Endvidere at Hu5F9-G4 synergieffekt med rituximab eliminere NHL indpodning og helbrede xenotransplanterede mus. Endelig toksikokinetiske undersøgelser i primater viste, at Hu5F9-G4 kunne sikkert administreret intravenøst ​​i doser i stand til at opnå potentielt terapeutiske serumniveauer. Således er Hu5F9-G4 aktivt at blive udviklet til og er blevet indgik i kliniske forsøg med patienter med AML og solide tumorer (ClinicalTrials.gov identifier: NCT02216409).

Henvisning: Liu J, Wang L, Zhao F, Tseng S, Narayanan C, Shura L, et al. (2015) præklinisk udvikling af et humaniseret anti-CD47 antistof med Anti-Cancer terapeutisk potentiale. PLoS ONE 10 (9): e0137345. doi: 10,1371 /journal.pone.0137345

Redaktør: Kevin D. Bunting, Emory University, UNITED STATES

Modtaget: Juni 2, 2015; Accepteret: 14. august 2015; Udgivet: 21 September, 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra California Institute for regenerativ medicin og finansiering fra Virginia og DK Ludwig Fund for Cancer Research

Konkurrerende interesser: JL, RM, og ILW har indgivet international patentansøgning WO 2011/143624 A2 overskriften »Humaniserede og kimære monoklonale antistoffer mod CD47 ‘. JL, RM, ILW, SW, JV, MH, og SP har indgivet US patentansøgning nummer PCT /US2014 /018.743 overskriften »Metoder til at opnå terapeutisk effektive doser af anti-CD47 agenternes. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Udviklingen af ​​kræft kræver normale celler til at erhverve metoder til at dysregulate spredning, undgå programmeret celledød, og erhverve mange af de andre kendetegnende for kræft [1]. Desuden skal kræftceller unddrage programmeret celle fjernelse, som er den fagocytiske eliminering af afvigende celler af celler i det medfødte immunsystem, herunder makrofager, dendritiske celler og neutrofiler [2]. Stimuleringen af ​​programmerede fjernelse celle benytter en række profagocytsignaler, hvoraf mange ikke er molekylært karakteriseret, men kan indeholde protein signaler såsom calreticulin [3], phospholipider, såsom phosphatidylserin, og unormal glycosylering. Imidlertid er inhiberingen af ​​programmeret fjernelse celle primært inhiberet af en enkelt dominerende molekyle, CD47. Alle humane cancere undersøgt til dato, herunder både faste tumorer og leukæmi, hurtig CD47, hvilket gør CD47 en universel mål i human cancer.

human akut myeloid leukæmi (AML) er en aggressiv malignitet af knoglemarvsceller progenitorer, kendetegnet ved en stigning i umodne hvide blodlegemer og knoglemarv fiasko. AML er den mest almindelige form for akut leukæmi rammer voksne, med en dårlig prognose og få behandlingsmuligheder. Aktuel standard for pleje af et lægeligt synspunkt egnede AML-patienter består af højdosis kemoterapi, ofte med allogen hæmatopoietisk celle transplantation. Selv med disse aggressive behandlinger, som forårsager betydelig morbiditet og mortalitet, tilbagefald er almindeligt og fem år samlet overlevelse er kun 30-40%. Desuden er størstedelen af ​​patienterne er over 65 år og er ikke kandidater til højdosis kemoterapi, hvilket fører til en femårig samlet overlevelse på 5-10% i denne gruppe [4,5].

Seneste undersøgelser har vist, at AML er organiseret som en cellulær hierarki påbegyndes og vedligeholdes af leukæmi stamceller (LSC), som besidder de kanoniske stamcelle egenskaber af selv-fornyelse og kapacitet til at generere store antal leukæmiske stamfædre og blaster [6,7]. Et centralt implikation af denne kræft stamceller modellen er, at LSC skal elimineres for helbredelse; dog LSC har vist resistens mod standard kemoterapi og strålebehandling [8,9]. Identifikation af celleoverflademolekyler fortrinsvis udtrykt på klinisk relevante AML stamceller tilbyder en attraktiv strategi for udviklingen af ​​nye terapier AML, da disse celleoverflademolekyler kan tjene som potentielle mål for monoklonalt antistof-terapi. Et antal celleoverflademolekyler fortrinsvis udtrykt på AML LSC sammenlignet med normale humane hæmatopoietiske stamceller og progenitorceller er identificeret, herunder CD47 [10].

CD47 besidder en enkelt immunoglobulin variabel region (IgV) -lignende ekstracellulært domæne og regulerer flere cellulære processer involveret i immunresponser [11]. Det er almindeligt udtrykt på hæmatopoietiske og ikke-hæmatopoietiske celler; Men vi tidligere fundet, at CD47 var mere højt udtrykt på AML LSC end deres normale modparter, og at øget CD47-ekspression i AML er forbundet med dårlige kliniske resultater [6,7,12]. CD47 gør en række protein-protein interaktioner, herunder

i cis

med integriner og

i trans

med to ligander, thrombospondin-1 (TSP-1) og signalere regulatorisk protein alfa (SIRPα). SIRPα koder for et Ig-superfamilien receptor hvis cytoplasmatisk region indeholder immunoreceptorfusionsmolekyler tyrosin-baserede hæmning motiver (ITIM’er) og udtrykkes på makrofager, dendritiske celler og neuroner [13-18]. Ved binding CD47, SIRPα initierer en inhiberende signaltransduktionskaskade via rekruttering af src-homologi-2-domænet indeholdende protein tyrosin phosphataser SHP-1 og SHP-2, som igen leverer inhibitoriske signaler til fagocytose [19-22]. I normal fysiologi, blev CD47 opdaget at være en alder markør på muse-RBC’er, som udviser gradvis faldende ekspression af CD47 sandsynligvis fører til deres eventuelle fagocytisk fjernelse ved sinusformede makrofager i milten, hvilket antyder, at mere alderen RBC’er vil sandsynligvis være mest udsatte for ekstravaskulær fagocytose med CD47 blokerende antistoffer [17,18,23].

kompleks proces med fagocytose afhænger af den relative balance mellem pro-fagocytiske og anti-fagocytiske indgange [2]. Baseret på disse observationer, vi foreslået en model, hvor leukæmiceller akkumulerer profagocytsignaler, hvoraf mange ikke er molekylært karakteriseret. Som følge heraf er leukæmiceller, der udtrykker høje niveauer af CD47 sandsynligvis udvalgt til at imødegå profagocytsignaler. På denne måde leukæmiceller er afhængige af CD47-ekspression for at forhindre fagocytisk eliminering af medfødte immunceller [24].

Fra denne model, forudsagde vi, at blokade af CD47-SIRPα interaktion ville resultere i dominans af pro- fagocytiske signaler resulterer i fagocytose af leukæmiceller. Vi valideret denne hypotese ved at demonstrere, at en tilgængelig blokerer muse-anti-humant CD47-antistof, B6H12, stimuleret fagocytose og reduceret byrden af ​​AML transplantation i primære humane xenograftmodeller [6]. Vores hypotese også, at et blokerende anti-CD47-antistof ville virke synergistisk med et andet antistof i stand til at binde Fc-receptorer og levere en potent pro-fagocytisk signal. I overensstemmelse med denne idé, fandt vi, at B6H12 og rituximab potent synergieffekt i udryddelsen af ​​NHL i xenograftmodeller [25]. Endelig blev CD47-ekspression påvist på cancerceller fra mange hæmatologisk og faste tumorer, og vi fandt, at B6H12 muliggjorde fagocytose af primære humane cancerceller in vitro, hæmmede væksten af ​​orthotopisk xenotransplanted humane tumorer, og forhindrede metastase af humane tumorceller [ ,,,0],26-30].

Kollektivt antyder disse undersøgelser, at et humaniseret, anti-CD47 antistoffet kan være et effektivt anti-cancer terapeutisk både som monoterapi og i kombinationer. I den foreliggende undersøgelse rapporterer vi udviklingen af ​​en hidtil ukendt humaniseret anti-humant CD47-antistof, til udpegede Hu5F9-G4, der genereres af komplementaritetsbestemmende region (CDR) podning på en human IgG4 stillads minimere rekruttering af antistof-Fc-afhængige effektorfunktioner. Hu5F9-G4 induceret potent makrofag-medieret fagocytose af primære humane AML-celler in vitro og helt udryddet menneskelige AML in vivo, hvilket fører til langsigtede sygdomsfri overlevelse for patient-afledte xenotransplantater. Endvidere at Hu5F9-G4 synergieffekt med rituximab eliminere NHL indpodning og helbrede xenotransplanterede mus. Endelig toksikokinetiske undersøgelser i primater viste, at Hu5F9-G4 kunne sikkert administreret intravenøst ​​i doser i stand til at opnå potentielt terapeutiske serumniveauer. Således er Hu5F9-G4 aktivt udvikles til kliniske forsøg i menneskets AML og solide tumorer.

Materialer og metoder

Antistof generation

Et cDNA fragment af humant CD47, der koder for ekstracellulære domæne blev klonet fra en fuld-længde humant CD47-cDNA (Open Biosystems) og blev fusioneret til muse-Fc til at generere en CD47 /mFc fusionsprotein, som blev anvendt til at immunisere mus til at producere monoklonalt muse-anti-humane CD47-antistoffer. Hybridomer blev dannet ved anvendelse af standardprotokoller. Kort fortalt blev 4-6 uger gamle Balb /c-mus immuniseret med oprenset rekombinant huCD47 /mFc fusionsprotein to gange om ugen i i alt 4 uger. Titere blev vurderet derefter, og miltcellerne blev fusioneret med SP2 /0-celler. Hybridomer blev selekteret og supernatanter fra de resulterende kloner blev screenet ved enzymbundet immunosorbent assay (ELISA) og fluorescerende aktiveret cellesortering (FACS).

Antibody V kloning og sekventering

kloningsstrategi anvendt her involverede en initial RNA-isolering fra hybridomceller (Qiagen). CDNA-sekvenser, der koder de tunge og lette kæde variable regioner af 5F9 monoklonalt antistof blev opnået ved anvendelse 5′-RACE-PCR-teknikker (Clontech) og blev sekventeret under anvendelse af standard DNA sekventeringsteknikker.

Molekylær modellering og antistofhumanisering

Humanisering af muse-anti-CD47-antistof 5F9 blev udført ved at installere CDR-rester fra muse-antistof på et humant kimcellelinje ramme (FR) [31]. Kort fortalt blev mus 5F9 humaniseret ved velovervejet rekruttering af tilsvarende CDR-rester. Forskelle mellem mus 5F9 og de menneskelige FR-rester blev individuelt modelleret for at undersøge deres mulige indflydelse på CDR kropsbygning. Humaniserede VH- og VL-gener blev syntetiseret ved McLab (South San Francisco, CA).

Cell transfektion

293F celler blev dyrket under FreeStyle ™ 293 Expression Medium (Invitrogen). Transient transfektion blev udført ved co-transfektion af ekspressionsvektorer, der koder antistof tung kæde og let kæde under anvendelse 293fectin transfektionsreagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Fire til fem dage senere blev supernatanter fra de transficerede celler høstet og testet for antistofsecernering ved ELISA. Kort fortalt blev 96-brønds plader (Nunc, Roskilde, Danmark) coatet med 1 ug /ml gede-anti-humant Fc gamma antistof i phosphatbufret saltvand (PBS) i 16 timer ved 4 ° C. Efter blokering i 1 time med 0,4% BSA i PBS ved stuetemperatur blev isolerede supernatanter tilsat i 1/3 sekventielle fortyndinger og inkuberet i 1 time ved stuetemperatur. Plader blev efterfølgende vasket tre gange og inkuberet med HRP-konjugeret gede-anti-human kappa-specifikt antistof i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask blev pladerne fremkaldt med OPT. Reaktionen blev standset med 2 M H

2SO

4, og OD blev målt ved 490 nM.

Antibody oprensning og karakterisering

Kultursupernatanten blev påført protein A Sepharose-søjler (GE Healthcare). Søjlen blev vasket med PBS, og protein blev derefter elueret med eluering buffer (0,1 M natriumcitrat, pH 3,0). Opsamlede fraktioner blev neutraliseret med 1 M Tris pH 9,0. Endelig blev oprensede prøver dialyseret mod PBS. Renhed af den eluerede antistof fraktion blev analyseret ved natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) på 10% geler under reducerende eller ikke-reducerende betingelser. Bånd blev visualiseret ved Coomassie brilliant blue-farvning.

celleoverfladeantigen-bindingsassay

YB2 /0-celler, der var blevet stabilt transficeret med humant CD47 blev inkuberet med 10 pg /ml Hu5F9-G4 eller HuIgG4 ved 4 ° C i 1 time. Derefter blev cellerne vasket med PBS tre gange, efterfulgt af incabation med 10 ug /ml PE-mærket anti-human Fc gamma specifik antistof (eBiosciences, San Diego, CA, USA) ved 4 ° C i 1 time. Binding blev målt ved anvendelse af et FACSCanto (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA). Un-transficerede YB2 /0 celler blev anvendt som en negativ kontrol.

Konkurrence ELISA

Et kompetitivt bindingsassay blev anvendt til at evaluere antigenbindingsspecificitet af anti-CD47 mAb’er. Kort fortalt blev 96-brønds plader (Nunc, Roskilde, Danmark) coatet med 1 ug /ml huCD47 /mFc fusionsprotein i phosphatpufret saltvand (PBS) i 16 timer ved 4 ° C. Efter blokering i 1 time med 0,4% BSA i PBS ved stuetemperatur, 10 ug /ml biotin-mærket muse 5F9 blev tilsat til pladerne i nærværelse af forskellige koncentrationer af umærket Hu5F9-G4 ved stuetemperatur i 1 time. Plader blev derefter vasket tre gange og inkuberet med HRP-konjugeret streptavidin (Thermo Scientific Pierce) i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask blev pladerne fremkaldt med OPT. Reaktionen blev standset med 2 M H

2SO

4, og OD blev målt ved 490 nM.

måling

antistofaffinitet

En cynomolgus CD47 cDNA blev klonet fra cynomolgus milt cDNA bibliotek (BioChain, Kina). Det ekstracellulære domæne af cynomolgus CD47 blev klonet og fusioneret til muse-Fc til at generere en cynoCD47 /mFc fusionsprotein, som blev anvendt i affinitet måling. Human CD47 /mFc blev fremstillet ved at fusionere det ekstracellulære domæne af humant CD47-cDNA (Open Biosystems) med muse-Fc som beskrevet ovenfor og anvendt til måling dimer bindingsaffinitet til Hu5F9-G4. Desuden human CD47 /hans fusionsproteinet blev fremstillet ved at fusionere det ekstracellulære domæne af human CD47 til His-mærke og anvendes til måling af monomert bindingsaffinitet til Hu5F9-G4. Bindingsundersøgelser blev udført under anvendelse af et Biacore 2000 (GE). Løbebuffer var 10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,005% Tween-20. Data blev indsamlet ved 25 ° C. Hver mAb prøve blev amin blev koblet til en CM4 sensorchip ved anvendelse af standard NHS /EDC-aktivering (7 minutter). Hvert antistof blev fortyndet til 10 ug /ml i 10 mM Na-acetat pH 5,0 og injiceret indtil det ønskede niveau af immobilisering blev opnået. Hver overflade blev derpå blokeret med 1 M ethanolamin i 7 minutter. Hver prøve blev testet in duplo.

CD47-SIRPα interaktion blokeringsassay

96-brønds plader (Nunc, Roskilde, Danmark) blev overtrukket med 1 ug /ml SIRPα /human Fc-fusionsprotein i phosphatpufret saltvand (PBS) i 16 timer ved 4 ° C. Efter blokering i 1 time med 0,4% BSA i PBS ved stuetemperatur blev 1 ug /ml CD47 /muse-Fc-protein tilsættes enten i fravær eller nærvær af stigende koncentrationer af Hu5F9-G4 ved stuetemperatur i 1 time. Plader blev derefter vasket tre gange og inkuberet med et HRP-konjugeret anti-muse-Fc sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask blev pladerne fremkaldt med OPT. Reaktionen blev standset med 2 M H

2SO

4, og OD blev målt ved 490 nM. Hver prøve blev testet i triplikater.

In vitro

fagocytose assay

In vitro fagocytose blev udført som tidligere beskrevet. Kort fortalt, HL-60 eller primære humane AML-celler fra forskellige patienter blev CFSE-mærket og inkuberet med humane perifere blod-afledte makrofager i nærvær af forskellige koncentrationer af muse 5F9, Hu5F9-G4, eller et isotypekontrolantistof i 2 timer ved 37 ° C. Celler blev vasket med IMDM serumfrit medium og resuspenderet i 200 pi medier. Derefter blev cellerne analyseret ved fluorescensmikroskopi for at bestemme fagocytiske indeks (antal celler indtages pr 100 makrofager). Statistisk analyse ved anvendelse Students t-test blev udført med GraphPad Prism.

antistofafhængig cellemedieret cytotoksicitet (ADCC) assay

ADCC blev udført ifølge instruktionerne fra Acella-TOX ™ Bioluminescens Cytotoksicitet kit (Cell Technology). Kort fortalt blev humane PBMC inkuberet natten over ved 10

6 celler /ml i IMDM human komplet medium med 400 enheder /ml IL-2 (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA). Den næste dag, aktiveret PBMC blev anvendt som effektorceller. 5 x10

3 HL60 celler i 25 pi IMDM human komplet medium blev tilsat hver brønd i en plade med U-bund 96. Derefter blev 25 pi IMDM human komplet medium indeholdende forskellige antistoffer ved de ønskede koncentrationer tilsat til hver brønd. Efter 5 minutters inkubering ved 37 ° C, 2,5 x10

5 PBMC i 25 pi IMDM human komplet medium blev tilsat til hver brønd til opnåelse af et forhold mellem effektorceller til målceller på 50: 1. Blandinger blev inkuberet ved 37 ° C i 4 timer, efterfulgt af påvisning under anvendelse af reagenser leveret af kits. Analyser blev gentaget tre gange, og repræsentative tal vises her.

komplement-afhængig cytotoksicitet (CDC) assay

5 x 10

4 målceller i 50 gl IMDM + 10% FBS + pen /Strep blev tilsat i hver brønd i en 96-brønds U-bundplade. 50 pi af antistoffer blev tilsat i forskellige koncentrationer (fortyndet med medium), startende fra 10 ug /ml til 10

-5 ug /ml, med 100 x fortyndingsforhold intervaller. Blandingen blev inkuberet ved stuetemperatur i 5 minutter, og derefter 50 pi humant komplement serum blev tilsat til hver brønd, blandet, og pladen blev inkuberet ved 37 ° C. Efter 2 timers inkubering, 50 pi Alamar blue (ABD Serotec) blev tilsat i hver brønd, blandet, og pladen blev inkuberet ved 37 ° C natten over. Den næste dag blev pladen afkølet til stuetemperatur i 15 minutter og læst af SpectraMax M3 pladelæser for fluorescenssignaler ved excitationsbølgelængde på 530 nm og emissionsbølgelængde på 590 nm. Relative fluorescens enhed (RFU) blev bruger til at indikere relative mængde for levende celler efter assay. Analyser blev gentaget tre gange, og repræsentative tal vises her.

CD47 receptor belægningsprocent assay

CD47 bindende standard kurve på AML-celler blev foretaget ved hjælp af AF488-konjugeret Hu5F9-G4 i forskellige koncentrationer. Receptoroptagethed blev målt ved inkubation af målcellerne med umærket Hu5F9-G4 under forskellige koncentrationer, og derefter blev cellerne enten analyseret i

in vitro

fagocytose eller inkuberet med en mættende koncentration af AF488-Hu5F9-G4 baseret på standardkurve og analyseret for binding ved flowcytometri. Receptor belægning blev beregnet som følger:

Apoptose assay

Humane primære AML-celler blev optøet og levedygtige mononukleære celler blev isoleret ved gradient centrifugering over Ficoll ved hjælp af standard-protokoller. Levedygtige celler blev resuspenderet ved 1×10

6 pr 50 ul i IMDM + 5% FBS. 10 ug /ml Hu5F9-G4 eller isotypekontrolantistof blev tilsat, og cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 3 timer. Staurosporin blev anvendt som en positiv kontrol. Apoptotiske celler blev identificeret ved farvning med Annexin V (BD Biosciences, Cat. # 556.547) ifølge producentens anvisninger og analyseret ved flowcytometri.

In vivo

antistofbehandling af human AML inkorporeret mus

Alle mus forsøg blev udført i henhold til en Institutional Animal Care og brug Udvalg-godkendt protokol (Stanford Aplac # 22264), og i tilslutning til National Institutes of Health

guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr

. Alle mus i denne undersøgelse blev købt fra The Jackson Laboratory eller opdrættet i hus. Ethvert dyr, der udviste vægttab, sløvhed, foroverbøjet kropsholdning, eller pjusket pels, som ikke blev bedre inden for 1 uge af behandlingen med Nutrical og væsker blev aflivet. Vi aflivet dyr, når morbid pr institutionelle protokoller

Der var to grupper af mus i undersøgelserne:. Kontrolgruppen behandlet med muse-IgG og forsøgsgruppen behandlet med Hu5F9-G4 antistof. Dødsfald var forventet i kontrolgruppen på grund af knoglemarvsdepression fra fulminant leukæmi. Forsøgsgruppen overlevede godt og blev aflivet ved afslutningen af ​​undersøgelsen.

Kryopræserverede celler fra human prøve SU028, SU048 og SU266 blev tøet i 10 ml medium (IMDM + 10% FBS + Glutamax + penicillin streptomycin) og 100 ug DNase i (StemCell) til at udføre T-celle depletion. Kort fortalt blev cellerne vasket og resuspenderet i Robosep puffer. Menneskelig CD3 Positive Selection 18051-høj opsving program blev udvalgt, og efter programmet er afsluttet, blev CD3- fraktion opsamles, tælles, og forberedt til intravenøs injektion i HBSS (Life Technology) + 2% FBS buffer (Omega Science). Menneskelig primære AML xenograftmodel blev etableret i NOD /SCID /IL-2Rgnull (NSG) hunmus 8-10 uger gamle. Mus blev konditioneret med 200 rad under anvendelse af en Faxitron CP-160 gamma strålerøret op til 24 timer før intravenøs injektion. 100 pi 5 x 10

6 primære AML-celler blev derefter injiceret i NSG mus ved halevene med en Terumo 29 G nål. Ved 5-uger efter transplantationen blev knoglemarvsceller aspireret fra lårbenet ved hjælp BD 27G nåle og farvet med muse-anti-muse CD45,1 PECy7 (eBiosciences, San Diego, CA, USA), rotte-anti-muse TER119 PECy5 (eBiosciences , San Diego, CA, USA), muse-anti-humant CD45 PB (BD Bioscience, San Jose, CA, USA), muse-anti-humant CD3 APC-Cy7 (BD Bioscience, San Jose, CA, USA), muse anti- humant CD33 PE (BD Bioscience, San Jose, CA, USA), og muse-anti-humant CD19 APC (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Procentdelen af ​​humane CD45 + CD33 + AML-celler blev bestemt ved flowcytometri. Baseret på den humane AML-celle transplantation niveau blev fem mus transplanteret med hver SU028 eller SU048 prøve tildelt til en af ​​to behandlingsgrupper: muse IgG kontrol eller Hu5F9-G4 ved 100 ug dagligt ved intraperitoneal injektion. Behandlingen påbegyndtes på dag 1 og varede i 14 dage i træk. Serum blev opsamlet ved forbehandling og 2 timer efter behandling efter 1., 5., 8., 12., og 14. doser til PK analyse. Knoglemarvsceller blev aspireret på forskellige tidspunkter til analyse AML indpodning. En komplet blodtælling blev analyseret en gang om måneden ved hjælp HemaTrue Hematology Analyzer. På dag 159 blev overlevende mus taget ned til histologi analyse af skinneben knogler. Til behandling af mus transplanteret med SU266 blev fire eller fem tildelt til en af ​​tre behandlingsgrupper: mus IgG kontrol, Hu5F9-G4 ved 100 ug dagligt, og Hu5F9-G4 ved 500 ug to gange om ugen. Behandlingen påbegyndtes på dag 1 og varede i 14 dage. Serum blev opsamlet ved forbehandling og 2 timer efter behandling for PK analyse. Knoglemarvsceller blev aspireret på forskellige tidspunkter til analyse AML indpodning. Alle mus blev fulgt for samlet overlevelse, og p-værdien for overlevelse i Hu5F9-G4 behandlede grupper blev sammenlignet med mus IgG kontrolgrupper. I slutningen af ​​undersøgelsen, blev mus aflivet ved brug af CO2 til gnaver eutanasi.

Synergi af Hu5F9-G4 og rituximab i Raji Luc-EGFP indpodet NSG mus

Mus blev indpodet med Raji Luc-EGFP ved en koncentration på 1 million celler /mus via halevenen injektion. De blev afbildet

in vivo

at bestemme niveauet af transplantation syv dage efter transplantation. Behandlingen begyndte samme dag i 21 på hinanden følgende dage. Alle mus blev injiceret via intraperitoneal injektion. Mus blev afbildet

in vivo

via IVIS Spectrum Imaging System på følgende tidspunkter: Forbehandling på dag 7 i transplantation, post syv doser på dag 14 af transplantation, Indlæg fjorten doser på dag 21 i transplantation Post enogtyve doser på dag 28 og en uge efter behandling på dag 35. Overlevelse vurdering blev foretaget på dag 217. i slutningen af ​​undersøgelsen blev musene aflivet ved anvendelse af CO2 til gnaver eutanasi.

Toksicitet studie i ikke-menneskelige primater

blev udført Alle ikke-menneskelige primater eksperimenter ifølge en Institutional Animal Care og brug Udvalg-godkendt protokol (Stanford Aplac # 26070), og i tilslutning til National Institutes of Health

guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr

. Aberne blev socialt opstaldede (opdatering til 3 dyr af samme køn og dosering gruppe sammen) i rustfrie bure stål udstyret med en rustfri stålnet gulv og en automatisk vanding ventil. Alle primære kabinetter var i overensstemmelse med, som angivet i USDA dyreværnsloven (9 CFR, del 1, 2 og 3) og som beskrevet i vejledningen for den pleje og anvendelse af forsøgsdyr (National Research Council. Guide til pleje og anvendelse af forsøgsdyr Washington, DC:.. National Academy Press Aktuelle udgave). Hver bur var tydeligt mærket med et bur etiket, der angiver undersøgelse, gruppe, dyr nummer, og køn. Temperatur: 64 ° F til 84 ° F (18 ° C til 29 ° C); Luftfugtighed: 30% til 70%; Lys Cycle: 12 timers lys og 12 timers mørke (undtagen under nærmere angivne forsøg); Ventilation: Ti eller flere luftskift i timen med 100% frisk luft (ingen recirkulation)

For dosiseskaleringsstudie blev to hundyr indskrevet og doseres på en uges mellemrum:. Én NHP blev administreret en enkelt dosis af EPO (17.000 U /kg) 5 dage før den første dosis af Hu5F9-G4 (3, 10, 30, 100, og 300 mg /kg), og én NHP blev administreret Hu5F9-G4 (1, 3, 10 , 30, og 100 mg /kg) uden forbehandling af EPO. Blodprøver blev indsamlet til måling af komplette blodtal herunder hæmoglobin og for Hu5F9-G4 serum niveau.

I separate NHP undersøgelser, kvindelige cynomolgusaber blev administreret en enkelt 1-times intravenøs infusion på 0,1, 0,3, 1, 3, 10 eller 30 mg /kg af Hu5F9-G4 eller PBS køretøj som en kontrolgruppe (et dyr pr gruppe) på dag 1, eller en primer-dosis (PD) på dag 1 i doser på 1 eller 3 mg /kg, efterfulgt ved ugentlige vedligeholdelsesdoser (MD) på 10 eller 30 mg /kg Hu5F9-G4 gennem Day var 43. prøver indsamlet i de forskellige undersøgelser som følger:

Hematology. Enkeltdosis: blod blev trukket to gange før injektioner og ved 3, 6, 10 og 14 dage efter administration. PD /MD dosis: blod blev trukket to gange før injektioner og ved 3, 6, 10, 13, 17, 20, 24, 27, 29, 36, og 43 dage efter administration

Klinisk kemi.. Enkeltdosis: blod blev trukket to gange før injektioner og efter 6 og 14 dage efter administration. PD /MD dosis: blod blev trukket to gange før injektioner og ved 6, 13, 20, 29, 36, og 43 dage efter administration

Urinanalyse.. Enkeltdosis: op til 14 ml urin blev opsamlet to gange før injektionen og ved 3 og 10 dage efter injektionen. PD /MD dosis: op til 14 ml urin blev opsamlet to gange før injektionen og ved 3, 10, 17, og 24. dag efter injektionen

Farmakokinetisk analyse.. Blod blev opsamlet ved venepunktur i rør uden antikoagulant på forskellige tidspunkter som angivet i fig 4B og 4D. Serumniveau af Hu5F9-G4 blev målt ved ELISA som beskrevet ovenfor under anvendelse CD47 /muse-Fc fusionsprotein som coatingen reagens, efterfulgt af påvisning med et HRP-konjugeret anti-humant Kappa sekundært antistof.

Alle dyr blev overvåget to gange dagligt for dødelighed og hendøen kontrol. Krop vægte blev målt mindst en gang forundersøgelse og derefter ugentligt startende på dag 7.

Resultater

Generering af monoklonale antistoffer mod humant CD47

Et cDNA fragment af humant CD47 koder for det ekstracellulære domæne blev fusioneret til muse-Fc til at generere en hCD47 /mFc fusionsprotein, som blev anvendt til at immunisere mus til at producere monoklonalt muse-anti-humane CD47-antistoffer. Specificiteten af ​​udvalgte hybridomakloner blev undersøgt ved FACS binding til enten forældre eller humane CD47-transficeret rotte YB2 /0-celler. En af de positive kloner blev opnået og betegnet som 5F9. Anvendelse af universelle antistof-primere, blev tung og let kæde variable regioner af 5F9 med succes klonet. Multiple kloner af hvert V-genproduktet blev sekventeret for at overvåge PCR-inducerede fejl, og aminosyresekvenserne af VH og VL af 5F9 blev bestemt (fig 1A og 1B). DNA-sekvensanalyse viste, at den tunge kæde af 5F9 anvender en V segment af IGHV1 familien, og at den lette kæde tilhører IGKV1 undergruppe.

(AB) Sammenligning af muse og humaniserede 5F9 variable tunge (A) og lys (B) regioner. CDR’er er markeret som angivet. (C) Rotte YB2 /0-celler stabilt transficeret med humant CD47 og parental YB2 /0-celler blev farvet med humant IgG4 isotype kontrol eller Hu5F9-G4 og analyseret for overfladen binding ved flowcytometri. (D) Biotinyleret muse 5F9 binding til humant CD47 /mFc blev detekteret ved ELISA i fravær eller nærvær af stigende koncentrationer af umærket Hu5F9-G4 eller isotypekontrol. Hver prøve blev analyseret in duplo og SEM-værdier præsenteres. Indiceret p-værdier blev bestemt ved Two-Way ANOVA i sammenligning. (E) Binding af Hu5F9-G4 til monomer eller dimer CD47 blev analyseret ved overfladeplasmonresonans opnåelse de angivne spor og bindende konstanter. Data blev behandlet ved at fratrække svar fra reference overflade samt et gennemsnit af buffer injektioner. Svarene var globalt egnet til en 1: 1 interaktion model herunder en betegnelse for massetransport. Tallet i parentes repræsenterer standardafvigelsen i den sidst rapporterede ciffer.

Molekylær modellering og humanisering af 5F9 antistof

For at menneskeliggøre 5F9, flere 3D-modeller af Fv af target antistof blev bygget ved hjælp af kombinationer af kendte strukturer. 2PCP og 2JEL udviser 93% og 95% identitet med 5F9 henholdsvis blev anvendt til VL modellering. 2PCP og 1CIC udviser 70% og 78% identitet med 5F9 henholdsvis blev anvendt til VH modellering. At vælge humane antistof skeletregioner (FR), der skal anvendes som skabeloner til CDR-podning blev de muse 5F9 VL og VH-regioner sammenlignet med dem af humane kimcellelinjesekvenser. Forsøget blev gentaget 3 gange. Forsøget blev gentaget 3 gange.