PLoS ONE: Mekanismer af topoisomerase I (TOP1) Gene Copy Number Stigning i et fase III Kolorektal Cancer Patient Cohort

Abstrakt

Baggrund

topoisomerase I (Top1) er målet for Top1 inhibitor kemoterapi.

TOP1

gen, som ligger ved 20q12-q13.1, ofte opdages ved forhøjede kopi numre i kolorektal cancer (CRC). Den foreliggende undersøgelse udforsker den mekanisme, frekvens og prognostisk effekt af

TOP1

gen afvigelser i fase III CRC og hvordan disse kan påvises ved fluorescerende in situ hybridisering (FISH).

Metoder

Ni CRC cellelinje metafasespredninger blev analyseret ved FISH med en

TOP1

sonde i kombination med en henvisning sonde dækker enten centromerregionen af ​​kromosom 20 (CEN-20) eller kromosom 2 (CEN-2) . Vævssnit fra 154 tidligere havde modtaget kemoterapi fase III CRC patienter, der tidligere studerede med

TOP1 /

CEN-20, blev analyseret med

TOP1 /

CEN-2. Forholdet mellem biomarkør status og samlet overlevelse (OS), tid til tilbagefald (TTR) i CRC og tid til lokalt recidiv (LR, kun endetarmskræft). Blev bestemt

Resultater

top1

afvigelser blev observeret i fire cellelinje metafaser. I alle cellelinjer blev fundet CEN-2 at afspejle kromosomale ploidi niveauer og derfor

TOP1

/CEN-2 sonde kombination blev valgt til at identificere

TOP1

gen gevinster

(TOP1 /

CEN-2≥1.5). Et hundrede og tre patienter (68,2%) havde

TOP1

gevinst, hvoraf 15 patienter (14,6%) nærede en forstærkning (

TOP1 /

CEN-20≥2.0).

TOP1

gen gevinst havde ikke nogen tilknytning til kliniske endpoints, mens

TOP1

forstærkning viste en ikke-signifikant tendens til længere TTR (multivariat HR: 0,50, p = 0,08). Når forstærkede sager blev adskilt fra andre tilfælde af gen-gevinst, ikke-forstærkede gen stiger (

TOP1

/CEN-2≥1.5 og TOP1 /CEN-20 2,0) viste en tendens mod kortere TTR (univariat HR: 1,57, p = 0,07).

konklusioner

TOP1

genkopitallet stigning forekommer hyppigt i fase III CRC i en mekanisme, der ofte inkluderer CEN-20. Brug CEN-2 som en måling for tumor ploidi niveauer, var vi i stand til at skelne mellem forskellige ordninger for gen-gevinst, som syntes at være forskellige i prognostisk betydning.

TOP1

FISH retningslinjer er blevet opdateret

Henvisning:. Smith DH, Christensen IJ, Jensen NF, Markussen B, Rømer MU, Nygård SB, et al. (2013) Mekanismer af topoisomerase I (

TOP1

) Gene Copy Number Stigning i et fase III kolorektal cancer Patient Kohorte. PLoS ONE 8 (4): e60613. doi: 10,1371 /journal.pone.0060613

Redaktør: Anthony WI. Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: December 19, 2012; Accepteret: 28 februar 2013; Udgivet: April 5, 2013 |

Copyright: © 2013 Smith et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af den danske agentur for Videnskab, Teknologi og Udvikling gennem ErhvervsPhD-ordningen. Nils Brünner og Hans Jørgen Nielsen blev støttet af Det Danske Strategiske Forskningsråd, Simon Fougner Hartmanns Family Foundation, IMK Almene Fond, Kathrine og Vigo Skovgaards Foundation, Tømrermester Johannes Fog Foundation, Fabrikant Einar Willumsens Memorial Trust, danske Kræftens Bekæmpelse, Dansk Medicinsk Forskningsråd, The Hede Nielsens Fond, direktør Ib Henriksens Fond, Savværk ejer Jeppe Juhl og Hustru Ovita Juhl Foundation, The Kornerup fonden, Aase og Ejnar Danielsens Fond og The Aage og Johanne Louis-Hansens Fond. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. David Hersi Smith, Sven Müller og Kirsten Vang Nielsen er ansat hos Dako A /S . Nils Brünner er medicinsk rådgiver for Dako A /S. Ib Jarle Christensen er en ekstern konsulent for Dako A /S. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en førende årsag til kræft død på verdensplan. I 2011 CRC tegnede sig for en anslået ni procent af nye kræfttilfælde, samt ni procent af kræftdødsfald i USA [1]. Til behandling af fremskreden CRC (stadie IV), to kemoterapeutiske muligheder: 5-fluorouracil (5-FU, capecitabin) i kombination med irinotecan (FOLFIRI) eller oxaliplatin (FOLFOX) plus biologiske midler. Flere undersøgelser rapporterer lignende responsrater mellem de to regimer i første linie behandling af fremskreden sygdom [2] – [4], med en enkelt undersøgelse rapporterer en signifikant højere responsrate med FOLFOX [5]. Interessant, en af ​​disse undersøgelser rapporteret en anden linje 6% objektiv respons på FOLFIRI behandling efter mislykkedes FOLFOX og en 21% objektiv respons på anden linje FOLFOX behandling efter mislykkedes FOLFIRI, indikerer ikke-komplet modstand krydsning mellem irinotecan og oxaliplatin [4]. Dette fund rejser spørgsmålet om, hvorvidt en undergruppe af patienter, der fik FOLFOX som første linie behandling ville have nydt godt af FOLFIRI som første linie behandling, eller omvendt. Vi mener derfor, at indsatsen rettet mod opdagelsen af ​​en prædiktiv biomarkør profil for FOLFOX /FOLFIRI udfald behandling berettiget.

Irinotecan, et pro-drug af SN-38, fungerer ved at hæmme enzymet topoisomerase I (Top1) [6]. Top1 spiller en væsentlig rolle ved at mindske de topologiske spændinger, der opstår under DNA replikation og transkription ved nicking, afslappende og re-ligering af det dobbeltstrengede DNA struktur. SN-38 binder Top1 og stabiliserer de mellemliggende DNA-Top1 komplekser. Efterfølgende re-ligering inhiberes, hvilket i sidste ende resulterer i celledød på grund af DNA beskadigelse under DNA-replikation eller transkription [6], [7]. Top1 har på grund af sin rolle som et mål for SN-38 blevet foreslået som en mulig prædiktiv biomarkør for FOLFIRI udfald behandling. Ved fremskreden kolorektal cancer, to store retrospektive studier, der undersøger sammenhængen mellem top1 protein niveauer og irinotecan behandlingsresultat producere modstridende resultater [8], [9]. Mens disse bestræbelser har været rettet mod at undersøge top1 protein niveauer, forskning i kromosomale forandringer involverer topoisomerase I genet (symbol:

TOP1

) er begrænsede. Beliggende på 20q12-q13.1, en del af den ofte vundet 20Q region impliceret i adenom til carcinom progression [10] – [13],

TOP1

findes ved forhøjede kopiantal i en stor del af fase III CRC prøver, når opdaget af Fluorescent in situ-hybridisering (FISH) [14], [15],

i vores undersøgelse af

TOP1

, har vi tidligere vist, at i en fase III CRC tidligere havde modtaget kemoterapi patient kohorte (n = 154), øget

TOP1

genkopitallet var signifikant associeret med længere overlevelse (OS) [15]. Interessant, en anslået 71% af patienterne nærede en

TOP1

gen kopi stigning, mens kun 10% af patienterne nærede en

TOP1

forstærkning [

TOP1

/CEN-20 ( centromer 20) Ratio ≥2.0] [15], hvilket indikerer, at genamplifikation er ikke den mest almindelige mekanisme til at generere yderligere kopier af

TOP1

. En stærk korrelation mellem

TOP1

og CEN-20 blev fundet, afslører en sammenhæng mellem

TOP1

og CEN-20 kopi øges. Dette tyder på, at gen-gain mekanismer, der involverer både den

TOP1

locus og kromosomet 20 centromerregionen også forekomme, eventuelt ved gevinst på hele 20Q armen ved f.eks isokromosom dannelse eller hel kromosom 20 forstærkning (aneusomy). Denne type genkopital stigning sker ved mekanismer relateret til kromosom missegregation og ikke genamplifikation. Måling genkopiantallet ændringer ved FISH traditionelt bygger på anvendelsen af ​​en samme kromosom henvisning probe, fx hjælp CEN-20 til måling af gener på kromosom 20, vi derfor sat sig for at udvikle en ny FISH analyse at skelne tumor prøver med

top1

kopi tal stiger på grund af amplificeringer fra dem med stiger på grund af 20Q gevinst eller aneusomy ved anvende en reference sonde rettet mod en uafhængig kromosom.

formålet med den aktuelle undersøgelse er at bestemme hyppigheden af ​​

top1

ændringer, kort eventuelle prognostiske virkninger af disse gen-afvigelser, identificerer cut-offs der afspejler de underliggende genetiske mekanismer i

top1

kopi nummer ændringer og opdatere FISH scoring retningslinjer for at reducere observatør arbejdsbyrde. For at nå disse mål, mekanismen for

TOP1

gen kopi gevinst blev undersøgt i et panel af CRC-cellelinjer med henblik på at identificere en reference sonde, der virkelig afspejler ploidi niveauer, således at

TOP1

bør detekteres kopi antallet stiger i forhold til det samlede antal kromosomer (ploidi niveau), og dette gøres bedst ved hjælp af et gen til centromer forhold. En roman sonde kombination, der består af

TOP1

en centromer 2-specifik (CEN-2) sonde, blev derefter anvendt på de tidligere testede fase III CRC patientprøver til at skelne mellem patienter huser

TOP1

kopi nummer stiger som følge af mekanismer, der involverer kromosom missegregation og dem, der skyldes genamplifikation. Forholdet mellem de forskellige ordninger for

top1

kopi nummer stigning og patient prognose blev undersøgt. Derudover er baseret på alle fisk data, kunne vi opdaterer

TOP1

FISH scoring retningslinjer.

Materialer og metoder

2.1 Patienter og klinisk materiale

Én hundrede fireoghalvtreds CRC patienter med histologisk verificeret stadium III adenokarcinom og opnåelige FFPE tumorprøver blev selekteret som tidligere beskrevet (se fig. 1) [15]. Alle patienter havde kirurgiske resektioner af deres CRC og modtog ingen adjuverende radio- og /eller kemoterapi, da dette ikke var en del af standard CRC behandling i Danmark på det tidspunkt (april 1991 til august 1993). Patienterne blev randomiseret til enten at modtage Ranitidin eller placebo i op til fem år med ingen effekt af ranitidin på overlevelse rapporteret [16]. Deltagerne forudsat skriftligt informeret samtykke, og undersøgelsen blev gennemført i overensstemmelse med II-erklæringen Helsinki med godkendelse fra den danske Sundhedsstyrelsen (2760-419-1989), Datatilsynet (1991-1110-751) og Central National etiske komité ( KF 01-2045 /91). Godkendelsen omfattede samling af vævsprøver til efterfølgende analyse af biologiske markører (KF 01-078 /93)

2.2 Forberedelse af metafasecellerne Ikke-trunkeret Interphase kerner

CRC cellelinier Colo-205, HCC-2998, HCT-15, HCT-116, HT-29, KM12, og SW620 blev opnået fra NCI /Development Therapeutics Program, mens DLD -1, blev LoVo, og LS-174T opnået fra American Tissue Culture Collection. Cellelinjerne blev opretholdt ved 37 ° C, 5% CO

2 i RPMI 1640 GlutaMAX ™ vækstmedium (Invitrogen, Carlsbad, USA) suppleret med 10% føtalt kalveserum (Invitrogen). Når kulturerne nåede en konfluens på -70%, blev colcemid (Invitrogen) tilsat, og kulturerne blev inkuberet i 2 timer ved 37 ° C. Efterfølgende blev cellerne høstet og en hypotonisk behandling blev udført (0,075 M KCI) i 10 minutter. Fiksering blev udført (fiksativ: 03:01 vol /vol absolut methanol og iseddike). Og denne suspension blev dryppet på objektglas

2.3 TOP1 /CEN-2 Probe Blanding

TOP1

genprobe er tidligere blevet beskrevet andetsteds [14]. En CEN-2-specifik probe (Dako, Glostrup, Danmark), der består af flere FITC-mærket peptidnukleinsyre monomerer rettet mod gentagne α-satellit-sekvenser, blev kombineret med Texas Red-mærket DNA-gen probe i IQFISH buffer [17] (Dako).

TOP1

/CEN-20 sonde kombination er tidligere beskrevet [14].

2.4 FISH Procedure

FISH reagenser var fra Cytologi FISH Accessory Kit (K5499) og den Histologi FISH Accessory Kit (K5799) (Dako). Metafase prøver blev fikseret i 3,7% formaldehyd, vasket, dehydreret (i en 70%, 85%, 96% ethanol-serien) og lufttørret. FISH probe blev læsset på dias, denatureret ved 82 ° C (

TOP1

/CEN-02:05 min,

TOP1

/CEN-20:10 min) og hybridiseret (

TOP1

/CEN-02:01 h,

TOP1

/CEN-20: natten). Overskydende probe blev fjernet ved vask i stringens buffer (

TOP1

/CEN-2:63 ° C,

TOP1

/CEN-20:65 ° C). Objektglas blev vasket, dehydreret, lufttørret og monteret.

TOP1

/CEN-2 FISH hybridisering til FFPE prøver (tykkelse: 3 um) blev udført i overensstemmelse med producentens anbefalinger (Dako). Kort beskrevet objektglas blev varme forbehandlet (i mikrobølgeovn) og pepsin fordøjet ved 37 ° C. Objektglas blev derefter denatureret ved 66 ° C i 10 minutter og hybridiseret ved 45 ° C i 1-2 timer og derefter behandlet som beskrevet ovenfor.

2.4.1 Scoring.

FISH signaler var oprindeligt scoret som tidligere beskrevet [14]. Kort fortalt blev signaler talt i 60 relevante ikke-overlappende kerner, hvis signaler var som minimum, synligt ved 200 ganges forstørrelse i passende filter. Scoring blev udført ved 1000 × forstørrelse i Texas Red /FITC dobbelt filter. Signal tællinger blev indtastet direkte til en elektronisk scoring ark (venligst stillet til rådighed af A. Schønau, Dako, Glostrup, Danmark). I første omgang blev 60 kerner scoret for hver prøve efter

TOP2A

FISH pharmDx ™ retningslinjer (Code K5333, indlægssedlen, 1

st udgave, 2008/01/18), hvor kerner huser begge signaler, samt kerner husly kun referencesignaler blev scoret, som letter påvisning af gen-deletioner. For at forbedre analysens følsomhed, kun kerner huser både gen- og referencesignaler blev inkluderet til yderligere analyse.

For at bestemme den mekanisme af

top1

kopi nummer stigning i cellelinjer, signal lokationer og tal var kendt for 50 metafaser for hver cellelinie. Det samlede antal kromosomer for hver cellelinje blev bestemt ved at tage digitale billeder af tre metafaser for hver cellelinje og tælle det samlede antal kromosomer manuelt.

For at bestemme den haploide, diploid, triploid og tetraploide intervaller for CEN -2, 60 kerner blev talt i den upåvirkede epitel støder op til tumorvæv. Den diploide interval blev defineret som følger 2n – (n /2) [min] ≤2n 2n + (n /2) [max], hvor 2n lig de gennemsnitlige CEN-2 tællinger pr kerne i (diploid) upåvirket epitel. Den triploid og tetraploide intervaller blev fundet ved hjælp 3n eller 4n stedet for 2n hhv. De haploide og høje ploidiniveau intervaller blev defineret som under det diploide interval og over tetraploide intervaller, henholdsvis. Definition af ploidi intervaller er tidligere beskrevet [18].

2.5 Statistiske metoder

Alle beskrivende og overlevelse analyser blev udført ved brug af SAS 9.2 (SAS Institute, Cary, USA). R-version 2.15.1 blev brugt i scoring metodeoptimering.

2.5.1 Scoring metoder.

Gene at CENTROMER nøgletal blev beregnet ved at inkludere enten de første 10 eller 20 kerner, bestemme

TOP1

status og sammenligne dette til status efter inddragelse af alle relevante kerner. Overensstemmelse blev beregnet ved anvendelse af Kendall tau [tau = (enig-uenig) /(enig + uenig)]. Borderline intervaller nær afskæringsværdier, hvor yderligere kerner skal indgå (for 10 kerner, havde yderligere 10 kerner til at blive scoret, for 20 kerner, yderligere 20 kerner skulle scoret) blev defineret som større end eller lig med 1,35 (min) og mindre end 1,65 (max), når den anvendes afskæring var 1,5. Brug af HER2 /CEN-17 retningslinjer, blev grænsen interval dækker afskæring på 2,0 defineret som større end eller lig med 1,8 (min) og mindre end 2,2 (max) [19]. Overensstemmelse og gennemsnitligt antal kerner scoret blev beregnet med og uden borderline intervaller

2.5.2 Overlevelse analyse

Tre endepunkter blev overvejet:.. Samlet overlevelse (OS, tid til døden ved enhver årsag) , tid til tilbagefald (TTR, tid til et arrangement i forbindelse med tyktarmskræft) og tid til lokalt recidiv i rektal cancer (LR) (beskrevet detaljeret i [15]). Kaplan-Meier-estimater af overlevelsessandsynligheder præsenteres for de binære variabler og nogle kombinationer. Multivariable analyse blev udført justering for køn, alder (per 10 år forskel i alder) og tumor lokalisering (RC versus CC). Cox regressionsanalyse blev brugt til analyserne. Modellerne blev valideret ved at vurdere proportionaliteten antagelse og linearitet for kontinuerlige kovariater beskæftiger Schönfeld og Martingale rester.

TOP1

og CEN-2 kopiantal, når de analyseres som en kontinuerlig variabel blev log transformeret (base 2), og derfor afspejlede en dobbelt forskel for disse variates. Resultaterne præsenteres af hazard ratio (HR) med 95% konfidensintervaller (CI) og p-værdier. Alle beregnede p-værdier var tosidede og anses for væsentlig på 0,05.

Resultater

3.1 Mekanismer af TOP1 Gene Copy Stigning i cellelinje Panel

For at bestemme den underliggende mekanisme (e)

TOP1

genkopiantal stigning, metafasespredninger blev fremstillet ud fra et panel af ti CRC cellelinier. Metafase forberedelse var en succes for alle undtagen en af ​​cellelinierne (LS-174T). Efter efterfølgende hybridisering med

TOP1

/CEN-20-sonde, blev metafasespredninger analyseret med hensyn til det samlede antal kromosomer, antallet af gen- og centromerfusioner-signaler, samt signal placering, hvis resultater kan ses i tabel 1 og figur 2.

TOP1

genkopitallet stigninger blev observeret i fire af de ni cellelinjer. I både Colo-205- og SW620, gen gain syntes at være koblet til kromosom 20 aneusomy (fig. 2A og 2D, henholdsvis). I HT-29 (fig. 2B),

TOP1

gen gevinst indtraf på en måde, der tyder på 20Q isokromosom formation. I KM12,

TOP1

gevinst opstod uafhængigt af CEN-20 (fig. 2C). Nej

top1

amplifikationer blev observeret. Som vist i tabel 1, kun

TOP1

gen gevinster, som ikke involverer CEN-20 (i en 01:01 mode) afspejles i

TOP1

/CEN-20-forholdet.

A: Colo-205, B: HT-29 (nederste højre hjørne: digitalt forstørret isokromosom), C: KM12, D: SW620. Bemærk:. På grund af eksistensen af ​​to kromatider i hvert metafase kromosom, det observerede antal af gen-signaler er det dobbelte af, hvad der er observeret i en interfase kerne

3.2 Identifikation af en ny reference Probe

for at identificere en relevant markør for cellulær ploidi, dvs. det samlede antal kromosomer, NCI og NCBI s SKY /M-FISH og CGH Database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/himmel /skyweb.cgi) blev screenet. Kromosom 2 syntes at være mindst berørt af uafhængige numeriske afvigelser, såsom helt kromosom gain, og blev derfor udvalgt til videre analyse i cellen linje metafase panel. Som vist i tabel 1, blev triploid cellelinier (Colo-205 og HT-29) sig at frembringe tre CEN-2 signaler, mens de diploide cellelinier producerede kun to. Alle

TOP1

gen kopi stigninger afspejlet i

TOP1

/CEN-2 procent med en cut-off værdi på 1,5, svarende til en 3:02 situationen mellem gen og centromer og afspejler en yderligere

top1

kopi i en diploid celle.

3.3 Trin III CRC Patient Materiale

tOP1

/CEN-2 FISH hybridisering og evaluering var en succes for 151 af 154 patientprøver FFPE tumorprøver (98%) (se fig. 1). Fordelingen af ​​

TOP1

og CEN-2 signaler var homogen i tumor prøver. For at forbedre følsomheden til at detektere prøver huser yderligere kopier af

TOP1

, kun kerner huser både

TOP1

og CEN-2 signaler blev medtaget i efterfølgende analyse, hvilket resulterede i en median på 58 kerner scoret for hver tumor prøve (interval: 47-60). I 50 tilfældigt udvalgte prøver blev CEN-2 signaler tælles i upåvirket colon mucosa at bestemme gennemsnitlige signaler tællinger (betyde: 1,37, median: 1,38, interval: 1,20-1,62). Disse tællinger blev brugt til at definere det diploide område (se afsnit 2.4.1).

I tumor materiale, CEN-2 varierede fra 1,19 til 2,52 med en median på 1,70. Ved at sammenligne middelværdierne CEN-2 signaler tællinger fra tumoren kerner til de ikke-tumor kerner, kunne hovedparten (97,4%) af tumorprøver klassificeres som huser to (disomic) eller tre (trisomic) kopier af kromosom 2 (tabel 2) . I tumorprøver,

TOP1

signaler varierede fra 1,33 til 6,72 per kerne med en median på 3,17 signaler, mens

TOP1

/CEN-2-forholdet varierede fra 1,01 til 3,39 med en median på 1,92 . Ingen sletninger (

TOP1

/CEN-2 0.8) blev observeret.

3.3.1 Bestemmelse

TOP1

status.

For at identificere prøver huser en

TOP1

genkopiantal stigning, en

TOP1

/CEN-2-forholdet cut-off på 1,5 blev anvendt. Som vist i fig. 3, prøver producerer nøgletal lig med eller over denne cut-off modtaget

TOP1

status “Gain”, mens de nedenfor blev kaldt “

TOP1

Normal ‘. I første omgang blev 103 patienter (68,2%) klassificeret som “Gain” ved hjælp af denne cut-off.

røde linje angiver

TOP1

gen signal og grøn prik betegner centromerregionen signal. Eksempler er baseret på CRC-cellelinje metafase resultater – trisomi (SW620), pentasomy (Colo-205), 20Q isokromosom dannelse (HT-29) og 20Q gevinst (KM12)

Når tumor prøver huser. en ekstra kopi af

TOP1

blev identificeret, data om

TOP1

/CEN-20 blev anvendt til at belyse mekanismen i

TOP1

gen kopi stigning. Ved at anvende en

TOP1

/CEN-20-forholdet cut-off på 2,0 til at skelne mellem prøver, hvor

TOP1

gen gevinst opstår uafhængigt af CEN-20 (

TOP1

/CEN -20≥2.0) fra dem, hvor gen-gevinst opstår på grund af aneusomies eller 20Q isokromosom dannelse (

TOP1

/CEN-20 2.0), prøver med en

TOP1

gevinst kunne yderligere dikotomiseret ind amplificeret og ikke-amplificeret undergrupper. Derfor prøver producerer en

TOP1

/CEN-2-forhold på lig med eller over 1,5 og en

TOP1

/CEN-20-forhold over eller lig med 2,0, blev kaldt “

TOP1

Forstærkning ‘, mens der for dem under 2,0 fik en “

TOP1

Ikke-forstærket Gain’ status (se fig. 3). Som vist i tabel 3, at størstedelen (58,4%) af tumorprøver modtaget en

TOP1

Ikke-amplificeret Gain status. Alle prøver, der er klassificeret som

TOP1

Amplification blev også fundet producere en

TOP1

/CEN-2-forhold på over 2,0 (se tabel 3).

For at verificere kategorisering af prøver i undergrupper, betyder CEN-2 og CEN-20-signaler i tumor kerner blev sammenlignet med deres respektive midler i upåvirket kolon slimhinde, er hvis resultater er anført i tabel 2. prøver med gennemsnitlig CEN-2 og CEN-20 i det diploide område tilhørte i 21/34 (61,8%) tilfælde til

TOP1

Normal kategori. Nær-triploid og CEN-20 aneusomic sager oftest findes i prøverne, der er klassificeret som

TOP1

Ikke-forstærket Gain. CEN-2 aneusomy blev observeret i 19 (12,6%) tilfælde.

3.3.2 Foreningen med patient resultat.

Forholdet mellem biomarkør status og patient resultat blev udforsket i både univariate og multivariate modeller . I denne patient kohorte var der 112 dødsfald blandt alle årsager og 88 gentagelser, herunder kræft-specifikke dødsfald inden for fem år [15].

top1

kopi nummer i sig selv var ikke signifikant associeret med OS, TTR eller LR (se tabel 4). Højere CEN-2 kopiantal var forbundet med bedre prognose med OS som klinisk endepunkt i den multivariate analyse (HR: 0,38, 95% CI: 0,15-0,98, p = 0,04), mens der kun observeret en tendens i univariate analyser (HR : 0,49, se tabel 4)

i første omgang patienter huser

TOP1

stiger (

TOP1

Gain, se figur 3) blev sammenlignet med dem uden (..

TOP1

Normal). Gain af

TOP1

var ikke signifikant associeret med OS eller TTR i både univariate og multivariate analyse (se tabel 4). Patienter med

top1

amplifikationer (

TOP1

/CEN-20≥2.0) blev oprindeligt sammenlignet med ikke-forstærkede tilfælde (

TOP1

Normal og

TOP1

Ikke-forstærket Gain undergrupper kombineret). Forstærkning af

TOP1

var ikke signifikant associeret med OS eller TTR, selvom nærmede betydning for TTR i den multivariate analyse (HR: 0,50, 95% CI: 0,23-1,09, p = 0,08). Analyse af

top1

opformeringer i forhold til LR mislykkedes på grund af et meget begrænset antal hændelser. Ekstra cut-offs til både probe kombinationer blev undersøgt, og resultaterne er anført i tabel 4.

Efter den primære analyse af data, blev prøver stratificeret i undergrupper afhængigt af tilstedeværelsen og typen af ​​

TOP1

stigning (se fig. 3, der er anført i tabel 3). Som vist i tabel 5, blev der ikke observeret nogen signifikant forskel mellem

TOP1

Normal,

TOP1

Ikke forstærket Gain og

TOP1

Amplification undergrupper med OS som endpoint i både univariate og multivariate analyse. Med TTR som klinisk endpoint,

TOP1

ikke-forstærkede gevinster viste en tendens til kortere TTR (HR: 1,57, 95% CI: 0,97-2,55, p = 0,07) i univariate analyser, og en lignende, men svagere, tendens observeret i den multivariate analyse (HR: 1,49).

top1

amplifikationer ikke udviser nogen signifikant sammenhæng med TTR sammenlignet med

TOP1

Normal baseline undergruppe. En Kaplan-Meier plot for disse relationer kan ses i fig. 4B

A (til venstre):. OS, B (højre):. TTR

3.4 TOP1 Retningslinjer

Scoring

Muligheden for at lave færre kerner i bestemmelsen af ​​

TOP1

status giver mulighed for at mindske observatøren arbejdsbyrde. For at afgøre, om dette var muligt, status på

TOP1

/CEN-2 og

TOP1

/CEN-20 blev bestemt ved anvendelse af 10 eller 20 kerner og sammenlignet med forholdet status efter inddragelse af alle relevante kerner. Som det fremgår af tabel 6, at udføre et reduceret antal kerner, såsom kun 10 eller 20 kerner til at bestemme

TOP1

/CEN-2 status (cut-off 1,5) klassificeret prøver med moderat konkordans (0,76 og 0,91, henholdsvis), som steg med indførelsen af ​​grænsetilfælde intervaller, hvor yderligere kerner skal scoret (se afsnit 2.5.1). Til påvisning af

top1

amplifikationer (cut-off: 2,0), konkordans var relativt høj (10 kerner: 0,96, 20 kerner: 0,99) og blev ikke forbedret med brugen af ​​grænsetilfælde intervaller. Derudover alternative cut-offs blev undersøgt, er hvis resultater er anført i tabel 6.

Diskussion

4.1 Mekanismer af TOP1 Copy Number Forøg

I denne undersøgelse blev fire forskellige ordninger for

top1

kopi nummer stigning identificeret. I cellelinie mekanismer panel involverer

TOP1

og CEN-20 (Colo-205, HT29 og SW620) såvel som en mekanisme, hvor

TOP1

blev vundet uafhængigt af CEN-20 (KM12) , blev observeret. I Colo-205 og SW620 blev kromosom 20 aneusomy observeret efter aftale med NCI og NCBI s SKY /M-FISH og CGH Database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sky/skyweb.cgi). Denne type stigning transpires grund af missegregation af kromosomer under mitose, hvilket resulterer i en unormal antallet af kromosomer; en karyotypic tilstand betegnes “aneuploidi”.

I HT29,

TOP1

gevinst indtraf på en måde tyder på dannelsen af ​​en isokromosom, på linje med andre resultater [20]. Denne mekanisme

TOP1

genkopital stigning forekommer på grund af en misdivision af centromeren (tværgående brud, snarere end langs) under kromosom adskillelse, hvilket resulterer i et kromosom med to identiske arme. I KM12, en ekstra

TOP1

signal blev observeret på et kromosom, der ikke huser en CEN-20 signal. I NCI og NCBI s SKY /M-FISH og CGH Database, vises denne cellelinje at huse en fusion kromosom 22q og en ekstra kopi af 20Q, hvor CEN-20 (eller i det mindste de alfa-satellit-sekvenser målrettet efter CEN- 20 probe) blev ikke vundet sammen med resten af ​​20Q. Denne type gevinst kan være et produkt af kromosom 20 aneusomy efterfulgt af en Robertsonian translokation begivenhed.

Mens genkopitallet stigning kan opstå på grund af begivenheder, der involverer større kromosomale regioner, såsom gevinsten af ​​hele kromosomer eller kromosomale arme kan det også forekomme på grund af genamplifikation. Genamplifikation er blevet foreslået at forekomme gennem flere mekanismer, herunder fejl i DNA-replikation og gentagne brud-fusion-bridge cyklusser som følge af dobbelt-strenget DNA pause eller telomer dysfunktion [21] – [23]. En kromosomal region fortrinsvis opnået gennem amplifikation betegnes en “amplicon”, et ca. 0,5-10 Mb DNA-fragment i længden, og som regel omfatter gen (er) er involveret i at fremme tumorvækst [24]. Det skal bemærkes, at hele kromosom eller kromosom arm ændringer generelt forekomme hyppigere, men i lavere størrelsesorden, end til mindre kromosomale ændringer [25].

I den foreliggende undersøgelse,

TOP1

genamplifikation blev defineret som

TOP1

/CEN-20-forhold lig med eller over 2,0. Denne definition betyder, at

eksisterer TOP1 dele på niveauer dobbelte af sin vært kromosom. Derfor er denne type gen kopi stigning skyldes sandsynligvis kopiantallet forøgelse af et amplikon og ikke arm længde kromosomale regioner, da dens mekanisme af kopital stigning er uafhængig af CEN-20. Ingen

top1

amplifikationer blev observeret i de ni celle undersøgte linier, men blev påvist i 10% af tumor prøver. Dette kunne tyde på, at enten denne mekanisme er patient-specifikke eller at denne mekanisme ikke var til stede i vores begrænsede antal celle undersøgte linier. Forstærkning af

TOP1

gen er også blevet rapporteret i melanom [26] og gastrisk kræft [27].

Mens hver af de nævnte mekanismer i

TOP1

genkopital stigning forekomme som enkelte begivenheder i cellelinier, vores resultater viser, at de kan forekomme samtidigt i tumorprøver. I 4/15 (26,7%) tilfælde af amplifikation (data ikke vist), blev CEN-20 aneusomy detekteres, indikerer en forstærkning mekanisme, samt en involverer aneusomy eller isokromosom formationen. I prøver, der er klassificeret som

TOP1

Ikke-forstærket Gain, er det muligt, at både 20Q isochromosomes og yderligere kopier af kromosom 20 er til stede. Det er dog kun muligt at klassificere prøver i henhold til fremherskende mekanisme.

4.2 Rolle 20Q

Gain af kromosom 20 eller 20q er blevet bredt rapporteret som en tilbagevendende kromosomal abnormitet i kolorektal cancer [11 ], [28] – [33], støtter den høje frekvens af

TOP1

ikke-forstærkede gevinster observeret i denne undersøgelse. In vitro modeller tyder på, at 20Q forstærkning spiller en forårsagende rolle i tumorigenese, såvel som i stigende cellulære opformeringsrater [34]. I kolorektal cancer, er 20q menes at spille en rolle i kolorektal adenom til carcinom progression [10] – [13] og er ofte observeret i tumorer udstiller mikrosatellit stabile og /eller kromosomale ustabilitet fænotyper [32], [35], [36 ].