PLoS ONE: Transcriptional forordning og biologiske funktioner Selen protein 1 i kolorektal cancer In vitro og in Nude Mouse Xenografter

Abstrakt

Baggrund

Det er vist, at selen-bindende protein 1 (SBP1) er betydeligt nedreguleret i forskellige menneskelige kræftformer. Dens regulering og funktion er endnu ikke klarlagt.

Metode og vigtigste resultater

Vi viser, at SBP1 promotoren hypermethyleret i tyktarmskræft væv og menneskelige kolon kræftceller. Behandling med 5′-aza-2′-deoxycytidin fører til demethylering af SBP1 promotoren og til en stigning på SBP1 promotoraktivitet, redder SBP1 mRNA og proteinekspression i humane coloncancer-celler. Derudover overekspression af SBP1 sensibiliserer tyktarmskræft celler til H

2O

2-induceret apoptose, hæmmer kræft celle migration in vitro og hæmmer tumorvækst i nøgne mus.

Konklusion og betydning

Disse data viser, at SBP1 har tumor suppressor funktioner, der er hæmmet i kolorektal kræft gennem epigenetisk inaktivering

Henvisning:. Pohl NM, Tong C, Fang W, Bi X, Li T, Yang W (2009) Transkriptionel forordning og biologiske funktioner Selen protein 1 i kolorektal cancer In vitro og in Nude Mouse Xenografter. PLoS ONE 4 (11): e7774. doi: 10,1371 /journal.pone.0007774

Redaktør: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Spanien

Modtaget: Juli 21, 2009; Accepteret: 16 oktober 2009; Udgivet: November 16, 2009

Copyright: © 2009 Pohl et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af National Cancer Institute tilskud (CA112081) og American Institute for Cancer Research tilskud (05A121). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Selen bindende protein 1 (SBP1) er et 56-kDa protein, som udtrykkes i forskellige celletyper, herunder hjerte, lever, nyre, lunge og tarm. Humant SBP1 blev først klonet i 1997 [1] og er blevet foreslået at mediere intracellulær transport af selen [2]. SBP1 er også blevet foreslået at fungere som en markør i colon celledifferentiering og nylig er SBP1 blevet vist at være et mål for den hypoxi-inducerbare faktor-1 alfa (HIF1α) [3] og direkte interagere med von Hippel-Lindau-protein (pVHL), som kan spille en rolle i proteasomalaktivitet nedbrydningsvej i en selen afhængig måde [4]. SBP1 har vist sig at være nedsat i forskellige epiteliale cancere, herunder prostatacancer [5], mave [6], æggestokke [7], lunger [8] og tarmkræft [9], [10]. Endvidere blev lave ekspressionsniveauer af SBP1 i kolorektal cancer associeret med dårlig prognose [9], [10]. Lignende resultater er blevet observeret i lunge-adenokarcinomer [8] og pleurale mesotheliomas [11]. Baseret på disse studier er det blevet foreslået, at SBP1 kan spille en kritisk rolle i reguleringen af ​​cancervækst og progression. Imidlertid rolle SBP1 i disse baner ikke er klarlagt,. Salg

Epigenetisk ændringer årsag gendæmpning, hvilket fører til tab af genekspression og funktion. Der er observeret to almindeligt mekanismer: histon modifikation og DNA-methylering. Det sidste sker ved cytosinrester i cytosin-guanin (CpG) sekvenser. Methylering af CpG øer på promotor er ofte en tidlig begivenhed i tumor progression og er en fælles mekanisme for gendæmpning i kræft, der forekommer i mere end 60% af tumorsuppressorer [12] – [14].

SBP1 er blevet identificeret til at have 2 CpG øer i dets 5′-utranslateret region, hvoraf den ene er tæt nok til at have en indvirkning på den SBP1 promotor forordningen (-402 til -613). Det er derfor muligt, at SBP1 promotoren, i tumorer med lave ekspressionsniveauer af SBP1 kan være methyleret. Faktisk vores data viser, at SBP1 promotoren hypermethyleret i humane coloncancer væv og i human coloncancer cellelinie HCT116, men en generel demethyleringsmiddel 5′-aza-2′-deoxycytidin (eller 5′-aza-decitabin, DAC) gendanner SBP1 mRNA og protein ekspression ved demethylering af SBP1 promotorregionen og stigende SBP1 promotoraktivitet. Vi leverer desuden den første beviser for, at SBP1 har anti-cancer funktioner – overekspression af SBP1 i HCT116 celler inducerer H

2O

2 medieret apoptose, hæmmer celle migration

in vitro

og hæmmer tumor vækst i nøgne mus.

Materialer og metoder Salg

Cell Culture, human Colon cancer væv og reagenser

human coloncancer cellelinie HCT116 blev dyrket i McCoys 5A medium suppleret med 10 % FBS, 1% anitbiotic-antimyocytic (Gibco) og opretholdt ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO

2. Menneskelig tyktarmskræft cellelinjer LS174T blev Caco2, HT29 og SW480 opretholdt i Minimal Essential Medium (MEM) og holdt under de samme betingelser som HCT116 celler. Humane coloncancer væv og matchede normale væv er blevet anvendt af vores laboratorium for nylig [10]. For H

2O

2 behandling, celler ved 80% konfluens blev behandlet med 0,3 mM H

2O

2 i 24 timer. For demethylering undersøgelser blev celler behandlet med 10 og 30 pM 5′-aza-2′-deoxycytidin (DAC) i 72 eller 96 timer (Sigma, St. Louis, MO).

Plasmider Construction

Menneskelig SBP1 cDNA blev forstærket og subklonet i pIRES2 vektorer (Clontech, Mountain View, CA) (pIRES2-SBP1) ved hjælp af Xhol- og BamHI restriktionsenzymsteder. Følgende primere blev anvendt: forward: 5′-ATCTCGAGCTATGGCTACGAAATGTGGGAAT-3 ‘og revers: 5′-ATGGATCCTCAAATCCAGATGTCAGAGCTAC-3’. For at generere HA-SBP1 plasmid blev human SBP1 cDNA amplificeret og subklonet ind HA-mærkede pcDNA3.1-vektoren (PHA) (Invitrogen, Carlsbad, CA) under anvendelse af Xbal- og Xhol-restriktionssites. Følgende primere blev anvendt: forward: 5′-ATCTCGAGATGGCTAC GAAATGTGGGAATT-3 ‘og revers: 5′-ATTCTAGATCAAATCCA GATGTCAGAGCTAC-3’. For luciferaseassays fulde længde af SBP1 promotoren (-2572 til +1) (pGL4-SBP1) blev klonet ind i pGL4 vektoren (Promega Corporation, Madison, WI) under anvendelse af Xhol og HindIII restriktionssites. Følgende primere blev anvendt: fremadrettet 5′-ATCTCGAGCCCATACATACCA AGCAA 3 ‘og revers 5’-TCAAGCTTCGGGTTTGCTGTGCTGGTGTC-3. Nøjagtigheden af ​​alle plasmider blev bekræftet via sekventering.

transfektion

Forbigående transfektion af HCT116 celler med PHA-SBP1 eller pHA vektor kontrol blev udført via lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). 24-48 timer efter transfektion blev celler underkastet forskellige assays. For stabil transfektion blev HCT116-celler transficeret med pIRES2-SBP1 eller pIRES2 (tom vektor) alene via lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Stabilt transficerede celler blev selekteret med G418.

immunblotting

I immunblotting blev celler opsamlet 72 timer efter behandling. Cellerne blev lyseret ved anvendelse 1xRIPA puffer (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) indeholdende en proteasehæmmer cocktail (Sigma, St. Louis, MO). Efter cellelyse, 30 ug protein blev sat på en 10% SDS-gel efterfulgt af overførsel til PVDF-membran. Monoklonalt antistof mod SBP1 blev købt fra MBL

International Corporation (Watertown, MA; 1:1000)., Blev antistoffet mod β-actin købt fra (Sigma, St. Louis, MO; 1:10000). Sekundært anti-muse-antistof blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, 1:3000). De detekterede signaler blev visualiseret ved en forøget kemiluminescens reaktionssystem, som anbefalet af fabrikanten (ECL-Plus, Amersham, Piscataway, NJ).

methyleringsspecifik PCR (MS-PCR)

HCT116-celler blev behandlet med eller uden DAC i 96 timer efterfulgt af DNA oprensning (DNeasy, Qiagen, Valencia, CA). Oprenset DNA blev derefter omdannet ved anvendelse af EZ-DNA bisulifide konverteringssæt fra Zymo Research (Orange, CA), som omdanner cytosinrester til uracil, men påvirker ikke 5-methylcytosin, hvilket således tillader en at identificere methylerede sekvenser i DNA’et ved efterfølgende MS -PCR. For MS-PCR, methylering og unmethylation specifikke primere (designet af identifikation methylering software) [15] komplementær med CpG island spanning -463 til -673 af 5′-utranslaterede region blev anvendt. PCR blev derefter udført ved hjælp af lige store mængder af DNA og det iTaq

TM DNA ploymerase (Bio-Rad, Hercules, CA) under følgende betingelser: initial aktivering polymerase ved 95 ° C i 5 minutter, 95 ° C i 45 sek, 53 ° C (methyleret produkt) eller 50 ° C (ikke-methyleret produkt) i 45 sekunder efterfulgt af forlængelse ved 72 ° C i 45 minutter. Efter 35 cykler blev reaktionen endvidere inkuberet ved 72 ° C i 10 minutter. Den samlede PCR-produkt blev derefter kørt på en 2% agarosegel. Nøjagtigheden af ​​produktet blev bestemt via sekventering.

Luciferase Assay

HCT116 celler blev transficeret med en pGL4 tom vektor eller pGL4-SBP1 plasmid, der indeholder den fulde længde SBP1 promotor. Renilla blev co-transficeret som en intern kontrol. 24 timer efter transfektion blev celler behandlet med PBS eller 5′-aza-2′-deoxycytidin i 72 timer. Den dobbelte luciferaseaktivitet (Promega, Madison, WI) blev anvendt i kombination med et luminometer til at måle luciferaseaktivitet af behandlede celler ifølge producenternes protokol.

spredning, apoptose og Migration Analyse

Celleproliferation blev analyseret ved MTS-assay ifølge producentens protokol (Promega, Madison, WI). For at detektere apoptose, blev stabilt transficerede HCT116-SBP1 eller vektor kontrolceller høstet og fikseret med 70% ethanol efterfulgt af propidiumiodid-farvning. Celler blev derefter talt ved flowcytometri (FACScan, BD Biosciences, San Jose, CA). Cellemigrering detekteret ved hjælp af en transwell plade (Corning, Lowell, MA) efterfulgt af DAPI farvning.

Xenografter

1 × 10

6 HCT116 celler stabilt udtrykker pIRES2-SBP1 eller pIRES2 vektor blev injiceret subkutant i flanken af ​​NIH-III nøgne mus (

NIH-Lyst

bgFoxn1

nuBtk

XID

) (Charles River Laboratory, NY) (5 mus per gruppe). Dyrene blev holdt i et patogenfrit barriere facilitet ved University of Illinois i Chicago biologiske ressourcer Laboratory, og nøje overvåget af animalsk facilitet personale. Fire uger efter injektion, tumorer blev isoleret og vægten (g) og volumen (mm

3) af tumorer blev bestemt. Totalt RNA blev isoleret fra tumoren, blev kvantitativ real-time RT-PCR udføres som beskrevet i vores seneste rapport [10], for at validere SBP1 konstitutiv ekspression i xenotransplantaterne. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med Animal Care og brug retningslinje og blev godkendt af University of Illinois i Chicago Animal Care udvalg.

Resultater og Diskussion

SBP1 Promotor Var Meget Methyleret i Human Colon Cancer Væv

Vi rapporterede for nylig, at SBP1 protein og mRNA-ekspression drastisk reduceret i human kolorektal cancer [10], samt i andre typer af kræft. For at belyse årsagen reduktion genekspression, isoleret vi målrettet humane colon cancerceller og matchede normale colon epitelceller fra kolorektal cancerpatienter med lav tumor-SBP1 protein og mRNA udtryk [10] for SBP1 promotor methylering analyse. Overraskende fandt vi faktisk, at SBP1 promotoren var højere methyleret i disse tumorer sammenlignet med deres tilstødende normale slimhinde (fig. 1A). Selv større rumfang prøve er nødvendige for at betegne disse resultater viser disse data tydeligt, at SBP1 promotor methylering kan være en af ​​de mekanismer, der er ansvarlige for SBP1 nedregulering i humane coloncancerformer.

A, SBP1 promotoren var stærkt methyleret i human colon cancervæv. Genomisk DNA fra tilstødende normale (N) og adenocarcinom (T) væv blev isoleret, konverteret og amplificeret til human SBP1 promotor hjælp af MS-PCR. # Indiceret forskellige patienter. Umethylerede (U) og methylerede (M) bånd blev detekteret ved DNA-separation på 2% agarosegeler med ethidiumbromid. B, viste Western blotting-analyse forskellige ekspression af SBP1 i humane coloncancer-cellelinjer; HCT116-celler med stabil transfektion af SBP1 overudtrykker plasmid blev anvendt som positiv kontrol. C, SBP1 promotoren blev hypermethyleret i HCT116-celler. Genomisk DNA fra LS174T blev HCT116, SW480, Caco-2 og HT-29 kolon kræftceller isoleret, konverteres og forstærkes via MS-PCR til human SBP1 promotor efterfulgt af gel adskillelse af den samlede DNA på 2% agarosegeler (U, umethyleret DNA M, methyleret DNA). D, DAC omvendt SBP1 promotor-methylering i HCT116-celler. DNA fra HCT116-celler behandlet med 30 pM af DAC i 96 timer blev isoleret og separeret på 2% agarosegeler efter konvertering og MS-PCR. E viste Luciferase assay, der DAC øget SBP1 promotor luciferaseaktivitet af HCT116-celler med transfektion af en vektor indeholdende den fulde længde promotoren fra SBP1 og med en behandling på 30 uM DAC eller PBS i 72 timer. pGL4 vektor og Renilla blev cotransficeret som kontroller (* p 0,01, sammenlignet med PBS). F, DAC restaureret SBP1 proteinekspression i HCT116 celler med DAC behandling i 72 timer, analyseret ved Western blotting. G. SBP1 mRNA blev restaureret af DAC i HCT116 celler (* p 0,01, sammenlignet med PBS). Hvert forsøg blev udført mindst 3 gange.

SBP1 Promotor Blev hypermethyleret i Human Colon Cancer Cells

For at validere SBP1 promotor methylering og SBP1 genekspression humane coloncancer-cellelinjer var anvendes. Først fandt vi forskellige SBP1 proteinniveauer i flere cellelinier analyseret ved Western blotting (fig. 1B). Vi derefter oprindeligt udvalgt to cellelinier til methyleringsanalyse: LST174T celler, som har højeste niveau af SBP1 og HCT116 celler, der har en upåviselig SBP1 proteinekspression. Som vist i figur 1C, SBP1 promotor var meget methyleret i HCT116-celler, mens det var hovedsagelig ikke-methyleret i LS174T-celler. Efterfølgende sekventering af udskårne methylerede og umethylerede bands bekræftet nøjagtigheden af ​​methylering mønster ses i disse to cellelinjer og viste ingen åbenlyse mutationer i promotor-regionen i SBP1. Vi undersøgte også status SBP1 promotor-methylering i SW480, Caco-2 og HT-29-celler, der har lave, moderate og høje ekspressionsniveauer af SBP1 protein, (fig. 1B). I overensstemmelse med SBP1 proteinekspression den SBP1 promotoren var meget methyleret i SW480-celler, moderat methylerede i Caco-2-celler og methyleres i mindre omfang i HT-29-celler (Fig. 1C). Dernæst behandlet HCT116-celler med den generelle demethyleringsmiddel 5′-aza-2′-deoxycytidin at afgøre, om hypermethyleret SBP1 promotoren kunne demethyleres. Vi fandt, at behandling af HCT116-celler med 30 uM DAC i 96 timer faldt SBP1 promotor methylering og øget SBP1 promotor unmethylation, sammenlignet med PBS-behandling-kontrol (fig. 1D). Dette antyder, at SBP1 promotor reguleres gennem methylering af den proksimale CpG øen og at promotor hypermethylering tavsheder SBP1 udtryk i HCT116 humane colon cancerceller.

SBP1 Promoter Demethylering Øget SBP1 Promotor Aktivitet og Reddet SBP1 Expression

Vores data viser, at SBP1 promotoren hypermethyleret og at demethyleringsmiddel DAC kunne vende denne sag. Det er derfor vigtigt at belyse, om promotor demethylering efterfølgende kunne øge SBP1 promotor-aktivitet og SBP1 mRNA og protein-ekspression. Først, transficerede vi HCT116-celler med en luciferase plasmid indeholdende fuldlængde SBP1 promotorregionen (pGL4-SBP1) og behandlet cellerne med 30 pM DAC i 72 timer for at teste, om DAC behandling øger promotoraktivitet, og fandt, at DAC faktisk øget SBP1 promotor aktivitet ved 3 gange (fig. 1E). Konsekvent, HCT116-celler behandlet med forskellige koncentrationer af DAC viste en øget SBP1 proteinekspression i en dosisafhængig måde (fig. 1F). Derudover DAC behandling steget SBP1 mRNA-niveauer med 50 folder for 72 timer behandling og 89 folder til 96 h behandling i HCT116 celler (Fig. 1G). Selv om andre mekanismer til regulering af SBP1 ikke kan udelukkes, disse forsøg tyder på, at SBP1 udtryk i humane colon cancerceller er bragt til tavshed delvist af sin promotor methylering og at SBP1 udtryk kan reddes ved demethylering promotor-regionen.

SBP1 Hæmmer celleproliferation, Øger Apoptose og inhiberer cellemigrering

SBP1 har vist sig at være involveret i den intracellulære transport af selen [2] og at tjene som en markør i colon celledifferentiering [10]. SBP1 har også vist sig at være nedsat i forskellige humane cancere. Men dens funktioner i kræft endnu ikke er defineret,. Derfor ønskede vi at identificere de funktioner SBP1 måtte have i humane colon cancerceller. Et særkende for kræft er ukontrolleret celleproliferation. For at teste om SBP1 kunne påvirke celleproliferation blev HCT116 celler, der overudtrykker SBP1 behandlet med forskellige koncentrationer af H

2O

2 og celleproliferation blev analyseret via en MTS-assay (Promega, Madison, WI). Selvom behandling af celler med 0,2 mM H

2O

2 selv inhiberede celleproliferation i HCT116-celler, kan det forstås, at SBP1 overekspression sensibiliserede HCT116 celler til H

2O

2-induceret vækstinhibering ved lavere koncentrationer ( 0,2 mM), hvilket indikerer, at SBP1 kunne spille en rolle i cellecyklusregulering (figur 2A.). FACS-analyse viste, at SBP1 overekspression førte til en stigning i apoptotisk celledød (sub-G1 fraktion), når celler blev behandlet med H

2O

2 (fig. 2B). Desuden overekspression af SBP1 i HCT116-celler inhiberede human coloncancer cellevandring (fig. 2C). Disse forsøg antyder, at SBP1 kan have nogle tumor suppressive funktioner i humane coloncancer-celler.

A, HCT116 celler transficeret med HA-SBP1 havde en forøget følsomhed over for H2O2 af MTS proliferation assay sammenlignet med tom vektor (HA) . Cellerne blev behandlet med H2O2 i 24 timer. B, HCT116 celler transficeret med HA-SBP1 øget H2O2-induceret apoptose ved flowcytometri analyse. Cellerne blev behandlet med 0,3 mM H

2O

2 i 24 timer. Felter angiver apoptotiske celler (sub-G1). C, SBP1 inhiberede kræft cellemigration: cellemigration af SBP1 overudtrykkende HCT116-celler og HA-kontrolceller blev vurderet via Transwell kamre. Migrerede celler blev påvist med DAPI farvning.

SBP1 Svækket Kolorektal Cancer Cell Vækst i NIH-III nøgne mus

For at teste, om SBP1 har anti-tumor aktiviteter

in vivo

udførte vi xenograft eksperimenter i NIH-III nøgne mus ved anvendelse HCT116 celler, som enten stabilt overudtrykker SBP1 (pIRES2-SBP1) eller en kontrolvektor (pIRES2). Fire uger efter cancercelle injektion blev tumorer isoleret og tumor volumen og vægt blev bestemt. SBP1 ekspression i eksplanterede tumorer afledt af SBP1 overudtrykkende HCT116-celler blev bekræftet via RT-PCR viser 607-gange stigning på mRNA-niveauet. I overensstemmelse med

in vitro

data, mus injiceret med SBP1 overudtrykkende HCT116-celler havde en betydeligt mindre tumorvolumen (fig. 3A) og tumorvægt (fig. 3B) end de mus injiceret med kontrolceller, hvilket indikerer, at SBP1 har tumor undertrykkende funktioner

in vivo

samt. Salg

NIH-III nøgne mus blev injiceret med HCT116 celler der stabilt udtrykker SBP1 (pIRES2-SBP1) eller vektor (pIRES2) kontrol. Fire uger efter injektion, blev tumor volumen (A) og tumor vægt (B) bestemt.

Taget ovenfor, giver vi den første bevis på, at SBP1 promotor hypermethyleret i human colorectal cancer, og at demethylering via DAC øger SBP1 promotoraktivitet samt redde mRNA og proteinekspression (fig. 1). Gene silencing er en fælles mekanisme findes i mange humane cancere til at inhibere tumor suppressor ekspression. Vore data viser, at SBP1 promotoren er meget methyleret i tumorvæv af colorektal kræftpatienter, hvilket indikerer, at SBP1 ekspression i tyktarmskræft er delvist styres gennem gendæmpning. Det er afgørende at undersøge, om SBP1 gendæmpning er en fælles mekanisme til at reducere SBP1 udtryk i andre typer af kræft, hvor SBP1 har vist sig at blive nedreguleret. Som følge af nedsat ekspression af SBP1 i humane cancere, SBP1 er blevet foreslået at have tumor undertrykkende aktiviteter. Vi mener, at vi er de første til at dokumentere, at dette faktisk kan være sandt, i form af, at overekspression af SBP1 i HCT116 celler undertrykt celleproliferation, øget apoptotisk celledød og nedsat celle migration

in vitro

(Fig . 2), og hæmmede tumorvækst

in vivo

(fig. 3). Men de nøjagtige mekanismer i SBP1 regulering og anti-cancer virkning forbliver ukendt og har brug for yderligere undersøgelser. Faktisk er det for tiden undersøges i vores laboratorium. Forståelse af regulering og mekanismer af SBP1 tumor suppressor funktioner vil have en stor indvirkning på at afsløre den molekylære mekanisme af carcinogenese og i udviklingen af ​​mere effektive chemoprevention og kemoterapier for humane maligne sygdomme.