PLoS ONE: RasGRPs er mål for Anti-Cancer Agent Ingenol-3-Angelate

Abstrakt

Ingenol-3-angelate (I3A) er en ikke-tumor fremme phorbolester-lignende stof identificeret i saften af

Euphoria peplus.

Svarende til tumorfremmende phorbolestere, I3A er en diacylglycerol (DAG) analog bindes med høj affinitet til de C1-domænerne af PKC’er, rekrutterer PKC’er til cellulære membraner og fremmer enzymaktivering. Talrige anti-cancer aktiviteter er blevet tilskrevet I3A og tilskrives I3A effekter på PKC’er. Vi viser her, at I3A binder også til og aktiverer medlemmer af RasGRP familien af ​​Ras aktivatorer fører til robust forhøjelse af Ras-GTP og engagement af Raf-Mek-Erk kinase kaskade. Som svar på I3A blev rekombinante proteiner bestående af GFP fusioneret separat til fuldlængde RasGRP1 og RasGRP3 hurtigt rekrutteret til cellemembraner, i overensstemmelse med direkte binding af forbindelsen til RasGRP s C1 domæne. I tilfælde af RasGRP3, IA3 behandling førte til positiv regulatorisk phosphorylering på T133 og aktivering af kandidat regulerende kinase PKCδ. I3A behandling af udvalgte B non-Hodgkins lymfom cellelinjer resulterede i kvantitative og kvalitative ændringer i Bcl-2 familiemedlem proteiner og induktion af apoptose, som tidligere demonstreret med DAG analoge bryostatin 1 og dens syntetisk analog pico. Vores resultater giver yderligere indsigt i de anticancer egenskaber I3A, støtter tanken om, at RasGRPs repræsentere potentielle cancer terapeutiske mål sammen med PKC, og udvide kendte område af ligander til RasGRP regulering

Henvisning:. Song X, Lopez- Campistrous A, Sun L, Dower NA, Kedei N, Yang J, et al. (2013) RasGRPs er mål for Anti-Cancer Agent Ingenol-3-Angelate. PLoS ONE 8 (8): e72331. doi: 10,1371 /journal.pone.0072331

Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: Februar 25, 2013; Accepteret: 8 jul 2013; Udgivet: 21 august, 2013 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Forskning blev støttet af tilskud til JCS fra den canadiske Institutes of Health Research (CIHR tilskud MOP14630, http: //www.cihr-irsc .gc.ca), Canadian Cancer Society Research Institute (CCSRI tilskud 018.453, https://www.cancer.ca/Research.aspx), Alberta Cancer Foundation (ACF give 26050, https://albertacancer.ca), og Alberta opfindsomhed-Health Solutions (200.100.408 https://www.aihealthsolutions.ca). Forskning blev også støttet af Intramural Research Program for Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health (Project Z1A BC 005.270). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

diacylglycerol (DAG) er et potent sekundær budbringer, der genereres i celler som respons til membran receptor stimulation af phospholipidmetabolisme. DAG og DAG analoger, såsom PMA (phorbol 12-myristat 13-acetat) binder konventionelle og hidtil ukendte former af protein kinase C (PKC) gennem et konserveret domæne kaldet C1. Denne proces medvirker til PKC membranlokalisering og enzymaktivering. Langvarig udsættelse for DAG analoger kan også have en negativ indvirkning PKC aktivitet gennem induceret enzym nedbrydning. Nogle DAG-analoger, såsom PMA, er kraftigt virkende tumorpromotorer. Andre DAG analoger, såsom prostratin og bryostatin 1, er ikke-tumor initiativtagere eller kan faktisk hæmme tumor forfremmelse. Lægemidler DAG-analoger, såsom bryostatin 1 udøver en række anti-cancer-celle og immunmodulerende virkninger. Baseret på opmuntrende prækliniske data, har bryostatin 1 været genstand for omfattende kræft kliniske forsøg (https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=bryostatin).

En anden medicinsk DAG analog af klinisk interesse er ingenol -3-angelate (I3A). I3A blev identificeret som et aktivt middel i saften af ​​

Euphorbia peplus

, som har en historie af brug i traditionel medicin, herunder behandling af hudkræft [1]. PEP005, en topisk anvendt formulering af I3A, bliver kraftigt evalueres i kliniske forsøg (https://clinicaltrials.gov/ct2/results?term=pep005 pg=2). PEP005 har vist effektiv i behandlingen af ​​aktinisk keratose [2] og er under udvikling til behandling af basalcellecarcinom og pladecellekarcinom [1]. I forskellige forsøgsmodeller, kan I3A inducere tumorcelle primære nekrose [3], apoptose [4] og senescens [5]. Tumorcelle-ydre anti-cancer effekter af I3A omfatter afbrydelse af tumorvaskulatur [6], rekruttering af tumordræbende neutrofiler [7] og generering af cytotoksiske T-celler med tumor regression aktivitet [8]. I3A binder til renset klassiske og nye PKC isoformer

in vitro

[9]. I3A behandling af dyrkede celler resulterer i hurtig flytning af disse enzymer til cellulære membraner [9]. Således nogle af de biologiske effekter formentlig skyldes I3A aktivering af PKC’er i levende celler.

Selvom tidlige forskning på DAG og DAG analoger fokuseret på deres regulering af PKC familiemedlemmer, er det nu klart, at yderligere familier af proteiner eksistere med homologe DAG-bindende C1 domæner, og at disse familier tjener kritiske biologiske roller [10], [11]. De RasGRPs er positive regulatorer af den lille GTPase Ras. De chimerins fungerer som negative regulatorer af den lille GTPase Rac, som regulerer actincytoskelettet. MRCK (myotonic dystrofi kinase-relaterede cdc42 bindende kinase) signaler nedstrøms for lille GTPase Cdc42, kontrollerende filopodia dannelse og påvirke tumor invasion. Munc13 familiemedlemmer regulere synaptisk vesikel membran fusion og synaptisk aktivitet. Protein kinase D familiemedlemmer spiller en central rolle i cellulær proliferation og levedygtighed. DAG kinaser konvertere DAG til phosphatidsyre, dæmpning signalering gennem ovennævnte DAG-responsive proteinfamilier samt potentielt forstærke phosphatidinsyre-responsiv signalveje. Forståelse af selektiviteten af ​​terapeutiske midler målrettet til DAG-bindende C1 domæner af disse andre klasser af DAG-bindende proteiner er derfor vigtigt for at forstå deres terapeutiske potentiale og deres virkningsmekanismer.

Høj-niveau udtryk for RasGRP1 og RasGRP3 viser begrænset vævsfordeling, med fremtrædende udtryk i lymfocytter [12]. En voksende mængde beviser understøtter hypotesen om, at en central rolle af disse proteiner er at fungere nedstrøms af immun-receptorer i B og T-celler [12]. Immun receptorstimulering fører til phospholipase C-aktivering og DAG akkumulering i membraner. DAG påvirker RasGRP1 og RasGRP3 gennem to koordinerede mekanismer. Først til de C1 domæner RasGRP1 og RasGRP3 binder DAG og phorbolester [13], [14], hvilket får RasGRPs rekrutteres til cellemembraner, hvor de møder deres substrat, lipideret Ras. Sletning af C1-domænet medfører tab af phorbolester lydhørhed [15]. Derudover RasGRP1 og RasGRP3 underkastes en aktiverende phosphorylering med PKC, selv aktiveres af DAG [16] – [19]. Ras-aktivering med RasGRPs er vigtig for thymocyt differentiering, T-celle effektorfunktion og lymfocyt homeostase [12]. RasGRP4, ligesom RasGRP1 og RasGRP3, også sandsynligt binder DAG og aktiverer Ras [20], [21], selv om regulering af PKC ikke er dokumenteret. RasGRP4 viser fremtrædende udtryk i mastceller [21], men findes også i andre myeloide slægter og tidlige thymocytter [22], [23].

Vi har argumenteret for, at RasGRPs kan udgøre levedygtige mål narkotika, der kunne manipuleres med DAG analoger til klinisk gavnlige ender [24]. Især har vi vist, at udvalgte cellelinjer afledt fra visse former for B-non-Hodgkins lymfom (B-NHL) undergår apoptose, når RasGRPs stimuleres med DAG analoger, såsom bryostatin 1 eller syntetisk analog “pico”. Oprindeligt har vi fokuseret på DAG analog-induceret apoptose i cellelinjen Toledo, hvilket sandsynligvis skyldtes en germinale center-afledt malignitet. Vi viste, at apoptose forekom inden for 48 timer og involverede pro-apoptotisk phosphorylering af BH3-only protein Bim gennem RasGRP-Ras-Raf-Mek-Erk-vejen [25]. For nylig opdagede vi en anden mekanisme af induceret apoptose, der blev set i en Burkitts lymfom (BL) -afledt cellelinie, BL-2, og i 5 af 6 mantlecellelymfom (MCL)-afledte cellelinier [26]. De fleste af disse cellelinjer var Bim-deficiente og den apoptotiske mekanisme var forbundet i stedet med kvantitative ændringer i andre Bcl-2-familiemedlemmer: ekspression af pro-apoptotiske BH3-only familiemedlem Bik generelt øget medens de anti-apoptotiske medlemmer Bcl -XL og Mcl-1 faldt. Denne anden mekanisme fortsatte meget langsommere end hos Toledo celler.

Her viser vi, at RasGRPs er mål for I3A i dyrkede celler. Desuden I3A behandling af repræsentative B-NHL-cellelinjer aktiverer de to tidligere er beskrevet RasGRP koblede mekanismer, der fører til apoptose.

Materialer og metoder

Etik Statement

Dyreforsøg var gjort ifølge protokoller, der er godkendt af Udvalget for Health Sciences Animal Politik og Velfærd ved University of Alberta, i overensstemmelse med den canadiske Rådet om Animal retningslinjer Care.

Reagenser

Ingenol-3-angelate blev købt fra Calbiochem (La Jolla, CA) og blev opløst i DMSO ved 1 mM. Bestanden blev fortyndet til en slutkoncentration på 100 nM i medium, medmindre andet er angivet og sammenlignet med DMSO tilsvarende fortyndet. MEK-inhibitorer og reagenser til undersøgelse af apoptose blev beskrevet tidligere [25], [26]. PMA var fra LC laboratorier (Woburn, MA), Gö6983, protease cocktail sæt 1 og NP-40 var fra Calbiochem (Billerica, MA).

Cell Culture

Rat2 celler blev manipuleret til at udtrykke retrovirusvektoren pBabePuro eller vektoren derivater indeholdende cDNA’er kodende RasGRP1, RasGRP3 eller RasGRP4 som tidligere beskrevet [15]. Rat2-celler blev dyrket i DMEM indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum suppleret med penicillin, streptomycin og glutamin (Gibco, Burlington, ON, Canada). Humane lymfomcellelinier blev dyrket i RPMI-1640 (Gibco) suppleret som ovenfor. Oprindelsen af ​​cellelinier er blevet offentliggjort [25], [26]. The Ramos B-cellelinie, LNCaP prostata-cellelinien og HEK-293-celler, der udtrykker GFP-RasGRP3 [28] blev dyrket i RPMI-1640 suppleret med 10% FBS og 2 mM glutamin (ATCC, Manassas, VA).

mus

Rasgrp1 – /-

mus er tidligere blevet beskrevet [27] og blev holdt på C57BL /6J baggrund. C57BI /6J mus blev anvendt som kontroller vildtype.

I3A in vitro bindingsundersøgelser

bindingsaffiniteter I3A til RasGRP1 C1-domænet og til RasGRP3 blev bestemt som tidligere beskrevet [13], [ ,,,0],14]. Inkubationstemperaturen, optimeret til stabilitet af proteinerne under bindende betingelser, var 37 ° C for RasGRP1 C1-domænet og 18 ° C i RasGRP3.

Analyse af proteiner ved immunblotting

Analyse af aktiv og total Ras, pErk1 /2, Erk1 /2 og Bcl-2-familiemedlemmer, medmindre andet er angivet, blev beskrevet tidligere [25], [26]. For at analysere RasGRP3 phosphorylering blev Ramos-celler behandlet med PMA, I3A eller DMSO kontrol køretøj som angivet i 30 minutter, hvorefter de blev høstet i lysepuffer (1% NP-40 i PBS med protease inhibitor cocktail sæt 1). I nogle tilfælde blev celler forbehandlet i 30 min med den pan-PKC-inhibitor Gö6983 (5 uM). Immunoblotting blev udført som beskrevet tidligere [28] under anvendelse af følgende antistoffer: pRasGRP3T133 (Epitomics ab124823), RasGRP3 (Cell Signaling, # 3334), PKCδ (Santa Cruz, sc-937), pPKCδ Ser299 (Epitomics ab133456), pErk1 /2 ( T202 /Y204, Cell Signaling, # 9106), Erk1 /2 (Cell Signaling, # 9102), β-Actin (Santa Cruz, sc-47.778). Efter udvikling af signalerne ved ECL (forøget kemiluminescens), blev filmene scannet og kvantificering af signalet blev udført ved hjælp af ImageJ (National Institutes of Health).

konfokalmikroskopi

Translokation af GFP- RasGRP1 i LNCaP-celler blev evalueret som beskrevet [29]. 60.000 LNCaP-celler blev udpladet på ibidi u–skåle (Ibidi LLC, Madison, WI) og derefter transficeret 48 timer senere med GFP-mærkede RasGRP1-kodende plasmid anvendelse af Lipofectamine reagens i kombination med Plus reagens ifølge fabrikantens (Invitrogen, Carlsbad, CA ) anbefalinger. Efter 24 timer blev cellerne blev behandlet med 1000 nM PMA eller I3A i konfokal medium (Dulbeccos Modified Eagle Medium uden phenolrødt suppleret med 1% FBS), og time-lapse billeder blev indsamlet hver 30 s ved hjælp af Zeiss AIM-softwaren. Imaging var med et Zeiss LSM 510 eller Zeiss LSM 710 konfokal mikroskopi-system (Carl Zeiss, Inc.) med en Axiovert 100 M omvendt mikroskop opererer med en 25 mW argon laser indstillet til 488 nm. En 63 × 1,4 NA Zeiss Plan-Apochromat olieimmersionsobjektiv blev anvendt sammen med varierende zoom (1,4 til 2X). For at oprette en vektor for disse undersøgelser hRasGRP1 (NM-005.739) blev indsat i pQB125-fn1 vektor af klassisk kloning bruge

Nhe

jeg restriktionsenzymkløvning. DNA-sekvenserne for de konstruktioner blev bekræftet ved sekvensanalyse (DNA, Minicore, CCR, NCI, NIH).

membranfraktionering

HEK-293-celler, der udtrykker GFP-RasGRP3 [28] blev behandlet med PMA eller I3A (1000 nM eller 100 nM) i 30 minutter eller DMSO som vehikelkontrol. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev cellerne vasket i PBS, fjernet fra pladerne ved at skrabe og pelleteret ved centrifugering med lav hastighed (5000 rpm i 5 min i et afkølet Eppendorf mikrocentrifuge). Celler blev sonikeret (3 x 6 sek) i PBS suppleret med protease inhibitor cocktail sæt 1 og derefter centrifugeret ved lav hastighed som ovenfor for at fjerne ubrudte celler. Portioner af denne supernatant repræsenterer “total protein” var forbeholdt analyse. Resten af ​​supernatanten blev derefter underkastet højhastighedscentrifugering (100.000 x g i 1 time), hvilket gav en supernatant “cytoplasmatisk fraktion”. Den høje hastighed pellet blev vasket, opløst i 1% Triton-X 100, og detergent-uopløseligt materiale blev fjernet ved højhastighedscentrifugering, som ovenfor. Den resulterende endelige supernatant repræsenterer “membranfraktionen”. Fraktioner af alt, cytoplasmatiske og membranproteiner blev udsat for SDS-polyacrylamid elektroforese og immunoblotting, med lige protein er lagt i hver bane.

apoptose og celleproliferationsassays

Metoder til at studere medicin-induceret apoptose og MTT assay for levedygtige ophobning celle er blevet offentliggjort [26].

Resultater

binding af I3A til RasGRP1 og RasGRP3 in vitro

Både RasGRP1 og RasGRP3 C1-domæner blev tidligere vist at binde DAG analoger herunder phorbolestere [13], [14]. Modellering indikerer, at ingenol 3-estere binder til C1-domæner på en lignende måde til phorbolestere og DAG [30]. Derfor vurderede vi bindingen af ​​I3A anvendelse af et kompetitivt assay under anvendelse af [

3H] phorbol 12,13-dibutyrat, i nærvær af 100 ug /ml phosphatidylserin (tabel 1). RasGRP1 (C1 domæne) og RasGRP3 (fuld længde) bundet I3A med 2- og 9- fold større affinitet, henholdsvis end de bundet phorbolesteren PDBu. Sammenlignet med PKCa, RasGRP1 og RasGRP3 bundet I3A med omtrent lignende tilhørsforhold, hvilket indikerer, at der ikke var nogen selektivitet mellem disse to familier af mål, i hvert fald

in vitro

.

I3A Aktiverer RasGRPs i dyrkede fibroblaster og Jurkat T-celler

Rat2 fibroblaster ikke påviseligt udtrykkelige endogene RasGRPs. Således Rat2 celler manipuleret til at udtrykke individuelle RasGRPs, sammenlignet med celler manipuleret til at udtrykke den tomme vektor, giver en bekvem system til at afgøre, om en DAG analog kan aktivere RasGRPs. Sammenlignet med celler, der udtrykker tom vektor, Rat2 celler, der udtrykker RasGRP1 viste robust Ras aktivering som vurderet ved anvendelse af en pull-down assay, der inddrives Ras-GTP bundet til Ras-bindingsdomænet af Raf1 (fig. 1A). I3A var lige så effektivt som PMA i dette assay. Ligeledes ekspression af RasGRP3 i Rat2-celler tillagt en evne til at aktivere Ras som svar på begge DAG-analoger (fig. 1B). Jurkat T-celler endogent udtrykker RasGRP1 men ikke betydelige mængder af RasGRP3 eller RasGRP4. I3A behandling reproducerbart fremkaldte reproducerbar Ras-aktivering i Jurkat T-celler, svarende til den, der ses med PMA (Fig. 1C).

A. Kulturer af Rat2 celler konstrueret med enten tom vektor eller RasGRP1 cDNA-udtrykkende vektor blev behandlet med I3A eller PMA i 10 minutter og sammenlignet med kontrolkulturer hjælp af Ras-GTP pull-down assay. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. B. I et enkelt eksperiment Rat2 celler, der udtrykker RasGRP3 cDNA blev analyseret på lignende måde. C. Jurkat T-celler blev analyseret for DAG analoge-induceret Ras aktivering i tre uafhængige forsøg. D. Samme antal C57BI /6J (WT, vildtype) og

Rasgrp1

– /- (KO, knockout) thymocytter blev behandlet med DMSO (negativ kontrol), I3A eller PMA som angivet for 10 minutter og protein lysater blev sammenlignet under anvendelse af phospho-Erk signalering assay. Resultaterne er repræsentative for dobbeltforsøg. Kvantificering af forholdene mellem RasGTP /Ras eller p-Erk1 /2 /Erk1 /2 er præsenteret under de enkelte paneler.

Vi har tidligere vist, at RasGRP1 var afgørende for DAG analog-induceret aktivering af Ras i musethymocytter;

Rasgrp1

– /- thymocytter var helt defekt mens vildtype (C57BL /6J) thymocytter udstillet stærk Ras aktivering [27]. Fordi vi havde begrænset antal celler, brugte vi den mere følsomme phospho-Erk analysen som et surrogat for Ras aktivering. Som forventet viste mutant thymocytter meget formindsket signalering til Erk efter enten PMA eller I3A behandling (fig. 1D). Tilsammen viser disse resultater, at I3A, ligesom PMA, kan aktivere RasGRP1 og RasGRP3. En høj basal Ras-GTP niveau i ubehandlede celler frustreret lignende forsøg henblik på at evaluere RasGRP4 i Rat2-celler. Men ved hjælp af en celle morfologi assay vi samlet indirekte beviser, at I3A og PMA hver kan aktivere RasGRP4 i Rat2-celler. RasGRP4-udtrykkende Rat2-celler inkuberet i 48 timer i PMA eller I3A antaget en transformeret morfologi, som tidligere beskrevet for RasGRP1 udtrykkende Rat2-celler [15]. Denne effekt blev ikke set med tomme vektor celler eller ubehandlede RasGRP4-udtrykkende Rat2 celler (data ikke vist)

DAG analoger aktiverer RasGRPs ved PKC-medieret fosforylering samt ved direkte rekruttering til cellulære membraner [16]. – [19]. Brug af Ramos B-cellelinie, vi bestemt dosis afhængighed af I3A og PMA til at fremkalde phosphorylering af endogen RasGRP3 på T133. Parallelt undersøgte vi både aktiveringen af ​​PKCδ, som kunne vurderes fra dens tilstand af phosphorylering på S299 [31], samt den nedstrøms respons Erk phosphorylering. For kinaser som PKC der er genstand for allosterisk og positionelle regulering, måling af aktiviteten af ​​isolerede kinase er ikke en pålidelig måling af niveauet for

in vivo

aktivitet. For PKCδ, phosphorylering på S299 synes at rapportere dets ligand afhængig aktivering [31]. Desværre antistoffer ikke er kommercielt tilgængelige til phosphoryleringssites afspejler aktiveringen af ​​andre PKC-isoformer, som adskiller sig fra de mange antistoffer rapporterer om phosphorylering af PKC’er på aktiveringssløjfen, drej motiv, og hydrofobe motiv. Disse sidstnævnte steder er involveret i modningen af ​​PKC gør det i stand til at blive aktiveret ved ligandbinding. Vi undersøgte derfor kun aktivering af PKCδ som reaktion på I3A og PMA. Andre PKC-isoformer rapporteret for Ramos-celler indbefatter PKCa, β, ε, og θ [32].

I dette cellesystem, observerede vi, at I3A og PMA viste omtrent lige store kræfter til aktivering af PKC δ og for Erk ( fig. 2A). RasGRP3 phosphorylering på T133 kunne påvises ved en lidt lavere koncentration af enten liganden, hvilket antyder inddragelsen af ​​andre PKC-isoformer udover PKCδ. For at bekræfte involveringen af ​​PKC i RasGRP3 phosphorylering undersøgte vi evnen af ​​generelle PKC-inhibitoren Gö6983 at blokere disse phosphoryleringsbegivenheder (fig. 2B). I sig selv, forbehandling med Gö6983 haft ringe effekt. I modsætning hertil blev svarene på behandling med I3A eller PMA faldt dramatisk. Især blev phosphorylering af RasGRP3 på T133 næsten helt afskaffet, i overensstemmelse med inhiberingen af ​​PKCδ phosphorylering, som var nedstrøms respons Erk phosphorylering. Ligeledes i Jurkat T-celler pan PKC inhibitor bis-indolemaleimide jeg afskaffet nedstrøms reaktion på I3A af Erk fosforylering (Fig. 2C). Endvidere har vi bekræftet, at dette PKC-inhibitor stærkt formindsket dannelse af Ras-GTP som reaktion på I3A, direkte påviser, at virkningen af ​​I3A på Erk phosphorylering var opstrøms for Ras og i overensstemmelse med den kendte krav til PKC-medieret aktivering af RasGRP1 derudover til kravet om ligand binding til RasGRP1 C1-domænet [15], [18], [19].

A. Ramos-celler blev behandlet i 30 minutter med de angivne koncentrationer af I3A eller PMA efterfulgt af analyse af cellelysater ved immunoblotting. DMSO angiver vehikelkontrollen. Bjælker angiver kvantificering (gennemsnit ± SEM) af resultaterne fra tre uafhængige forsøg. En repræsentativ immunoblot illustreret. Det skal bemærkes, at selv om RasGRP3 antistoffet ikke er rettet mod en RasGRP3 phosphoryleringssite, det konsekvent giver en vis stigning i signal under betingelser med RasGRP3 phosphorylering. B. Ramos-celler blev behandlet med 3 nM I3A eller PMA, i nogle tilfælde efter forbehandling med Gö6983 (5 uM til 40 min), og analyseres som ovenfor. Bjælker angiver kvantificering (gennemsnit ± SEM) af resultaterne fra to uafhængige forsøg. En repræsentativ immunoblot illustreret. Et yderligere forsøg udført under tilsvarende betingelser gav lignende resultater. C. Jurkat T-celler blev stimuleret i et enkelt eksperiment med I3A i 10 minutter med eller uden 10 min præ-inkubation med pan-PKC-inhibitor bisindolymaleimide I (4,6 uM), efterfulgt af analyse af Ras-GTP, total Ras, pErk1 /2 og de samlede Erk1 /2 niveauer.

I3A aktiverer RasGRPs i Select B-NHL cellelinier

Vi har tidligere vist, at DAG analoger, såsom bryostatin 1 og syntetisk analog pico kunne aktivere RasGRPs i B-NHL cellelinier, som er blevet karakteriseret som følsomme over for induktion af apoptose ved disse samme forbindelser [25], [26]. Efter at have bekræftet ovenfor, at I3A fungerede som en DAG analog på RasGRP1 /3, vi ønskede at udforske nærmere evne denne forbindelse til at fremkalde Ras aktivering i repræsentative DAG analoge følsomme B-NHL-cellelinjer. Kort behandling af BL2 (Burkitts lymfom), Jeko-1, Z138 (både mantle-celle lymfekræft) og Toledo (germinale center lymfom) resulterede i robust aktivering af Ras (fig. 3).

I et enkelt forsøg, celler blev behandlet med 100 nM I3A eller DMSO-kontrol i 10 minutter, efterfulgt af analyse af Ras-GTP ved pull down assay. Forholdet mellem Ras-GTP /Ras blev kvantificeret.

I3A Behandling Årsager Intracellulær Re-distribution af RasGRP1 og RasGRP3

DAG analoger binder til en hydrofil kløft i C1 domæne, færdiggøre en hydrofob overflade og derved drivende membran indsættelse af DAG analog – C1 domæne kompleks [33]. DAG og DAG analoger dermed bidrage til RasGRP aktivering delvis ved at bringe disse proteiner til at re-lokalisere til cellulære membraner hvor de fysisk kan interagere med lipideret Ras [34]. derfor Vi undersøgte evne I3A at fremkalde protein omfordeling ved hjælp af både

in situ

og subcellulære fraktionering tilgange.

For

situ

studier i, blev GFP-RasGRP1 udtrykt i LNCaP celler. Efter behandling med I3A eller PMA blev ændringer i den intracellulære mønster af mærket protein visualiseret ved konfokal mikroskopi. LNCaP-celler blev valgt, fordi deres godt spredt morfologi letter billedbehandling. De er nemme at transfektere og vi har haft stor erfaring med virkningerne af forskellige phorbolestere på PKC translokation i dette system [29]. Før behandling blev GFP-RasGRP1 fordelt i hele cytoplasmaet (fig. 4). Ved PMA (1000 nM) Desuden GFP-RasGRP1 omplantes til plasmamembranen i løbet af 2 minutter. I3A ligeledes inducerede en hurtig reaktion, men mønstret var markant anderledes, med udtalt klyngedannelse ved de indre sites.

Celler udtrykker GFP-RasGRP1 blev behandlet med 1000 nM PMA eller I3A. Translokationen mønster blev undersøgt i levende celler som en funktion af tiden. Resultaterne af dobbeltforsøg med I3A er vist. De viste billeder er repræsentative for fire uafhængige forsøg. Skalaen søjle repræsenterer 10 um.

Som en supplerende tilgang, vi udtrykte GFP-RasGRP3 i HEK-293 celler, der er behandlet med I3A eller PMA, udsættes cellerne til subcellulær fraktionering, og undersøgte forskydninger i fordeling af GFP-RasGRP3 mellem cytoplasmatiske og membranfraktioner (fig. 5). GFP-RasGRP3 blev påvist både med et antistof rettet mod RasGRP3 selv samt med et antistof mod GFP tag. Til sammenligning, vi undersøgte også forskydninger i fordelingen af ​​endogen PKCδ.

HEK-293 celler, der udtrykker GFP-RasGRP3 blev behandlet i 30 minutter med PMA eller I3A ved de angivne koncentrationer. Cell Sonikaterne blev udsat for subcellulær fraktionering og niveauerne af PKCδ og RasGRP3 blev analyseret ved immunblotting. For RasGRP3, blev ekspression detekteret både med et anti-RasGRP3 antistof og med et antistof mod GFP tag. Bjælker angiver kvantificering (gennemsnit ± SEM) af resultaterne fra tre uafhængige forsøg. Et repræsentativt immunoblot er illustreret.

Behandling med I3A inducerede en klar stigning i niveauet af GFP-RasGRP3 inddrives i membranfraktionen, registreres med enten antistof, der ligner svaret observeret med PMA. Tabet af GFP-RasGRP3 fra cytoplasmatiske fraktion var mindre indlysende, men disse resultater bør dæmpet af den observation, at påvist i total protein prøve protein blev lidt forhøjet i DAG analoge behandlede prøver, af ukendte årsager. I det samme eksperiment, både I3A og PMA-induceret omfordeling af PKCδ til membranfraktionen.

I3A Behandling Påvirker Bcl-2 proteiner i Select B-NHL cellelinier

I vores tidligere undersøgelser vi sammenlignet DAG analog-sensitive cellelinie Toledo til rl, en DAG analog-resistent kimcenter type B-NHL cellelinie [25]. Vi rapporteret, at apoptose induceret af Dag analoger i Toledo B-NHL celler var afhængig af pro-apoptotiske BH3-only protein Bim [25]. I Toledo B-NHL celler, behandling med bryostatin en eller pico resulterede i RasGRP-Erk signalering og fosforylering af Bim på en pro-apoptotisk websted, der er fælles for både BimEL og BimL splejsede former. Vi viste også, at anti-apoptotisk phosphorylering på websteder er unikke for BimEL ført til effektiv proteolyse i et proteosom-afhængig måde i DAG analog-resistent cellelinje RL. Men denne anti-apoptotisk mekanisme var mindre tydeligt i Toledo. Vores nuværende resultater med I3A viser nøjagtigt det samme mønster: BimL antog en reduceret elektroforetisk mobilitet, tegn på fosforylering, efter I3A behandling i både RL og Toledo (figur 6A.). I3A fremkaldte også fosforylering af BimEL i både RL og Toledo. Men BimEL nedregulering i Toledo var relativt ineffektive efter I3A behandling (fig. 6A), ligesom vi opdagede tidligere for bryostatin 1 og pico [25].

De angivne cellelinier blev ubehandlet eller behandlet i 3 dage (BL2, UPN1, Z138) eller i 24 timer (RL og Toledo). Proteinlysater blev analyseret ved immunoblotting med antistoffer mod de angivne proteiner. Panel A og B blev afledt fra duplikerede geler. Erk blev brugt som en belastning kontrol.

For nylig viste vi, at pico behandling induceret apoptose i Burkitts lymfom cellelinje BL2 og i 5 af 6 kappecellelymfom cellelinjer, hvoraf de fleste var Bim- mangelfuld [26]. I disse tilfælde blev apoptose associeret med forøget ekspression af Bik og nedsat ekspression af Mcl1 og Bcl-XL. I de foreliggende undersøgelser fandt vi, at Bik blev induceret ved I3A behandling i BL2 og Z138, en repræsentativ kappecellelymfom cellelinie (fig. 6B). Især i BL2, meget af det udtrykte Bik var steget elektroforetisk mobilitet. Dette fænomen, som kan afspejle alternativ mRNA splejsning eller post-translationel modifikation, er tidligere blevet set i pico-behandlede celler [26]. I modsætning hertil har den DAG analog-resistente UPN1 MCL cellelinje ikke udviser I3A-induceret Bik udtryk. Både BL2 og Z138 viste IA3-induceret nedsat ekspression af Mcl1 og Bcl-XL, men disse virkninger var ikke så tydelig i UPN1 celler (Fig. 6B). I enhver henseende, de opnåede resultater her med I3A parallel dem, der opnås med bryostatin 1 og dens analoge pico i vore tidligere undersøgelser [25], [26].

I3A inducerer apoptose i Select B-NHL cellelinier

for at afgøre, om I3A kan inducere apoptose i B-NHL-cellelinjer tidligere har vist sig at være følsomme over for bryostatin 1 og /eller dets analoge pico, vi brugte tre forskellige mærkningsordninger celle protokoller og flowcytometri, som tidligere beskrevet [25], [26]. Udover de cellelinier ovennævnte vi inkluderet i analysen af ​​de tidligere karakteriserede DAG-analoge-følsomme MCL cellelinier Mino, REC1, og Sp53 og den resistente Burkitts lymfom cellelinie Daudi. Den manglende evne af celler til at akkumulere TMRE (tetramethylrhodamin-ethylester) blev anvendt til at detektere tab af den mitokondriske ydre membran potentiale (fig. 7A). I nogle tilfælde vi omfattede MEK-inhibitorer U1026 eller PD184352 at vurdere, hvilken rolle den kanoniske Ras-signalvejen i apoptose. En fluorescerende caspase pseudo-substrat blev anvendt til at påvise global caspaseaktivitet (fig. 7B). DNA ende-mærkning ved hjælp af dUTP og terminal transferase (TUNEL) blev anvendt til at overvåge nukleare DNA-fragmentering (Fig. 7C). Repræsentative resultater er vist i figur 7, og resultaterne er opsummeret i tabel 2. Generelt I3A induceret omfattende apoptose i DAG analoge-sensitive cellelinjer (Toledo, BL2, Jeko-1), men i meget mindre grad hos resistente cellelinjer (RL , UPN1 og Daudi). Tab af TMRE farvning induceret af I3A i Toledo celler er stort set ophævet af Mek hæmmere (Fig. 7A), men denne virkning var mindre dramatisk i nogle af MCL cellelinjer (data ikke vist).

A. RL og Toledo-celler blev behandlet i 24 timer, inkuberet med TMRE, og analyseret for pletten optagelse ved flowcytometri. I nogle tilfælde blev kulturerne inkuberet med enten U0126 eller PD184352 at vurdere virkningerne af Mek hæmning. B. UPN1 og Jeko-1-celler blev inkuberet med DMSO eller 100 nM I3A i 4 dage og derefter analyseret med CaspACE ™ til påvisning caspaseaktivering.