PLoS ONE: BRAF, PIK3CA, og HER2 oncogen Ændringer Ifølge KRAS Mutation status i Advanced tarmkræft med fjernmetastaser

Abstrakt

Baggrund

Anti-EGFR-antistof-baserede behandling er en vigtig terapeutisk strategi for fremskreden kolorektal cancer (CRC); på trods af dette, flere mutationer, inklusive

KRAS

,

BRAF

, og

PIK3CA

mutationer, og

HER2

forstærkning-er forbundet med de mekanismer der ligger til grund udvikling af resistens over for anti-EGFR-behandling. Formålet med vores undersøgelse var at undersøge de frekvenser og kliniske implikationer af disse genetiske ændringer i avanceret CRC.

Metoder

KRAS

,

BRAF

, og

PIK3CA

mutationer blev bestemt ved Cobas realtid polymerasekædereaktion (PCR) i 191 avancerede CRC patienter med fjernmetastaser. Mikrosatelitter ustabilitet (MSI) status blev bestemt ved en fragmentering assay og

HER2

forstærkning blev vurderet ved sølv in situ hybridisering. Desuden

KRAS

mutationer blev undersøgt af Sanger sekventering metode 97 af 191 CRC sager.

Resultater

Mutationer i

KRAS

,

BRAF

, og

PIK3CA

blev fundet i 104 (54,5%), 6 (3,1%), og 25 (13,1%) tilfælde af fremskreden CRC hhv. MSI-høj status og

HER2

forstærkning blev observeret i 3 (1,6%) og 16 (8,4%) tilfælde, hhv.

PIK3CA

mutationer blev oftere fundet i

KRAS

mutant type (18,3%) end

KRAS

vildtype (6,9%) (

P

= 0,020 ). I modsætning hertil

HER2

amplificeringer og

BRAF

mutationer var forbundet med

KRAS

vildtype med borderline signifikans (

P

= 0,052 og 0,094 henholdsvis) . I kombineret analyser med

KRAS

,

BRAF

HER2

status,

BRAF

mutationer eller

HER2

amplifikationer var forbundet med den værste prognose i vildtype

KRAS

gruppe (

P

= 0,004). Når man sammenligner effekten af ​​påvisningsmetoder, resultaterne af real time PCR-analyse afslørede 56 af 97 (57,7%) CRC tilfælde med

KRAS

mutationer, mens Sanger sekventering afslørede 49 tilfælde (50,5%).

konklusioner

KRAS

mutationer blev fundet i 54,5% af avancerede CRC patienter. Vores resultater støtte, undergruppe bruge

PIK3CA

BRAF

mutation eller

HER2

forstærkning status, foruden

KRAS

mutation status, er nyttige til styring avancerede CRC patienter

Henvisning:. Nam SK, Yun S, Koh J, Kwak Y, Seo AN, Park KU, et al. (2016)

BRAF

,

PIK3CA

, og

HER2

oncogen Ændringer Ifølge

KRAS

Mutation status i Advanced tarmkræft med fjernmetastaser. PLoS ONE 11 (3): e0151865. doi: 10,1371 /journal.pone.0151865

Redaktør: Wayne A. Phillips, Peter MacCallum Cancer Center, AUSTRALIEN

Modtaget: December 3, 2015; Accepteret: 4 marts 2016; Udgivet: 18 Mar 2016

Copyright: © 2016 Nam et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for de supplerende oplysninger filer

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af en bevilling på Korea Health Technology R D Project via Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansieret af Ministeriet for Sundhed Velfærd, Republikken Korea (tilskud nummer: HI14C1813, https://www.khidi.or.kr/eps). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige kræftform og forekomsten af ​​CRC er stadig stigende på verdensplan årligt. Trods af tidlig påvisning og terapeutiske fremskridt, regionale eller fjerne metastatiske sygdom tegner sig for næsten 50% af nydiagnosticerede CRC patienterne og de overordnede overlevelsesrater for avancerede CRC patienter stadig utilfredsstillende. Den nylige identifikation af molekylær genetik har muliggjort store fremskridt i behandlingen af ​​patienter med fremskreden CRC. Udviklingen af ​​målrettede behandlinger rettet mod specifikke mutationer som dem i

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR)

tyrosinkinase gen har forbedret behandling effekt og klinisk resultat i avanceret CRC patienter [1-4]. Men CRC’er er molekylært heterogene tumorer, der huser forskellige genændringer herunder mutationer i

KRAS

,

BRAF

, og

PIK3CA

, samt

HER2

forstærkning; mange patienter med disse mutationer oplever derfor resistens mod anti-EGFR lægemidler og udviser dårlig prognose [2,3,5,6]. Derfor er det vigtigt at undersøge den molekylære mekanisme, der ligger svaret og resistens over for anti-EGFR behandling i avanceret CRC.

KRAS

mutationer, der almindeligvis påvises hos ca. 40% af CRC tilfælde , menes at være associeret med resistens over for anti-EGFR behandling i CRC. Evalueringen af ​​

KRAS

mutationer er derfor vigtigt forud for brugen af ​​anti-EGFR medicin til at vælge patienter, der kan drage fordel af anti-EGFR behandlinger [7,8]. Desuden nyere undersøgelser tyder på, at yderligere genmutationer såsom

BRAF

mutationer,

PIK3CA

mutationer, og

HER2

forstærkning er impliceret i resistens mod EGFR-målrettede lægemidler til CRC patienter med vildtype

KRAS

[5,9].

BRAF

, som er medlem af RAF familien, spiller en vigtig rolle i MAP-kinase /ERK-signalvejen [10]. Mange tidligere undersøgelser har vist, at mutationer i

BRAF

er en biomarkør for dårlig prognose i avanceret CRC. Desuden

BRAF

mutant tumorer viser en dårlig reaktion på anti-EGFR behandling, især i CRC patienter med vildtype

KRAS

[5,11].

PIK3CA

er muteret i forskellige menneskelige kræftformer; i CRC, er det muterede hos ca. 20% af tilfældene. I øjeblikket patienter huser

PIK3CA

mutationer i exon 20 og ingen mutationer i

KRAS

kan vise modstand mod anti-EGFR behandling. Desuden

PIK3CA

mutationer i exon 9 og KRAS-mutationer tendens til at være fundet sammen [3,12]. Endelig

HER2

amplifikationer er til stede i et lille antal CRC’er, og et par undersøgelser har rapporteret sammenhængen mellem

HER2

forstærkning og dårlig reaktion på anti-EGFR lægemidler [13].

på trods af disse tidligere resultater, er viden om frekvenser og kliniske implikationer af disse genetiske ændringer i koreanske patienter stadig begrænset. I den foreliggende undersøgelse, vi evaluerede forekomsten af ​​disse genetiske ændringer hos patienter med fremskreden CRC, og vurderet forholdet mellem disse genetiske ændringer med de klinisk-patologiske faktorer og resultatet af patienterne. Desuden har vi sammenlignede effekten af ​​at anvende Cobas realtid polymerase kædereaktion (PCR) forsøg med at at bruge Sanger sekventering test som metoder til påvisning af

KRAS

mutationer.

Materialer og metoder

patienter og vævsprøver

i alt 191 avancerede CRC patienter med synkrone eller metachronous fjernmetastaser som gennemgik kirurgisk behandling på Seoul National University Bundang Hospital mellem 2003 og 2009 blev indrulleret i denne undersøgelse. Alle patienter blev behandlet med kirurgisk resektion af de primære CRCs ved første diagnose og fjernmetastase resekteret når de opdages. Ingen af ​​patienterne blev behandlet med præoperativ kemo- eller strålebehandling. Clinicopathologic information og opfølgning data blev indhentet fra patienternes journaler og patologi rapporter. Samlet overlevelse (OS) blev beregnet som tiden mellem datoen for operationen og datoen for døden.

histopatologi og klassificering af tumorer blev bestemt i henhold til WHO-klassifikationen. Brugen af ​​journal data og vævsprøver til denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board of Seoul National University Bundang Hospital (reference: B-1210 /174-301). Alle prøver og journal data blev anonymiseret før anvendelse i denne undersøgelse, og deltagerne gav ikke skriftligt informeret samtykke. Den institutionelle Review Board frafaldes behovet for skriftligt informeret samtykke på betingelse af anonymisering og ingen yderligere indgreb til deltagerne.

KRAS

,

BRAF

, og

PIK3CA

mutation analyser ved hjælp af real-time PCR test

Tumor prøver blev indsamlet fra kirurgisk resektion eksemplarer af den primære CRC. Hematoxylin-Eosin (HE) farvede slides blev gennemgået af en patolog (H.S.L). Tumorområder blev identificeret og mikroskopisk dissekeret mere end en 1 x 1 cm område, som bestod af mere end 60% tumorceller. En eller to 8-um-tykke formalin-fikserede paraffin-indlejrede (FFPE) tumor vævssnit blev afparaffiniseret med xylen i 5 minutter ved stuetemperatur (RT), dehydreret i absolut alkohol i 5 minutter ved stuetemperatur, og fik lov til at lufttørre fuldstændigt i 10 min. DNA blev isoleret under anvendelse af Cobas DNA Sample Preparation Kit (Roche, Branchburg, NJ, USA) og det samme præparat protokol for alle Cobas mutation kits blev anvendt i denne undersøgelse. Koncentrationen af ​​det isolerede DNA blev målt ved anvendelse af et NanoDrop UV-spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA) og DNA’et blev fortyndet med DNA Specimen Diluent fra Cobas 4800 Mutation Test kit (Roche) til den optimale koncentration for hvert gen (

KRAS

4 ng /pi,

BRAF

5 ng /pi, og

PIK3CA

2 ng /uL). Forstærkning og påvisning blev udført med en automatiseret Cobas X480 analysator instrument. Den real-time PCR-test kunne afsløre codon 12, 13, og 61 af

KRAS

mutation, V600E

BRAF

mutation, og exon 1, 4, 7, 9, og 20 af

PIK3CA

mutation.

KRAS

mutation analyse ved hjælp af Sanger sekventering metode

Tumor prøver blev indsamlet fra de samme primære CRC prøver, der havde anvendt til real- time PCR tests. Alle prøver blev mikrodissekeres manuelt, og 60% af prøven området blev vist at indeholde tumorceller som anslået fra H forholdet blev genberegnet baseret på disse resultater.

mikrosatelitter ustabilitet (MSI) analyse

Snit blev fremstillet fra FFPE vævsprøver og hematoxylin og eosin-farvede objektglas blev bedømt for at identificere den repræsentative tumor område og normalt område i hvert afsnit. Disse udvalgte områder blev mikrodissekeres. MSI-analyse blev udført som beskrevet tidligere [16,17]. Kort fortalt blev MSI status bestemt ved at analysere fem mikrosatellit loci (BAT-26, BAT-25, D5S346, D17S250, og S2S123) under anvendelse af DNA auto-sequencer (ABI 3731 genetiske analysator; Applied Biosystems, Foster City, CA). Ifølge Bethesda vejledning om MSI blev tumorer klassificeret som MSI-H, når mindst to af de fem markører vises hidtil ukendte bands, MSI-L supplerende alleler blev observeret med en af ​​de fem markører, og MSS når alle mikrosatellitmarkører undersøgte vises identiske mønstre i både tumor og normalt væv.

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført med SPSS Statistics 18 softwarepakke (Chicago, IL, USA). Associationen mellem de clinicopathologic parametre og genetiske ændringer blev analyseret under anvendelse af Chi-square test eller Fishers eksakte test. Chi-square test blev udført, at mindst 80% af cellerne har en forventet frekvens på 5 eller derover, og ingen celle har en forventet frekvens mindre end 1,0. I modsat fald blev Fishers eksakte test anvendt. Alder blev behandlet som en kontinuerlig variabel og sammenlignet ved hjælp af uafhængige T-test på grund af p 0,05 af Shapiro-Wilk normalitet test. Kaplan-Meier-overlevelseskurver blev afbildet, og statistisk signifikante forskelle i overlevelseskurverne blev analyseret under anvendelse af log-rank test. Multivariat overlevelse analyse ved hjælp en Cox proportionel risiko model blev gennemført med mutations status, alder, og scenen på første diagnose. Den hazard ratio (HR) og dens 95% konfidensinterval (CI) blev evalueret. I alle tilfælde,

P

værdier mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Patient karakteristika

De clinicopathologic funktioner patienterne er sammenfattet i S1 tabel. Patienterne bestod af 103 mænd (53,9%) og 88 kvinder (46,1%) med en median alder på 60 år (spændvidde: 28-93 år). Af de 191 sager blev 49 (25,7%) tumorer placeret i højre colon, 71 (37,2%) tumorer i venstre colon og 71 (37,2%) tumorer i endetarmen. Med hensyn til den histologiske differentiering kvalitet, 165 (86,4%) tumorer var lav kvalitet, og 26 (13,6%) tumorer var høj kvalitet. Vedrørende behandlinger, modtog 176 (92,1%) patienter 5-fluorouracil (5-FU) -baseret adjuvant kemoterapi med eller uden anti-EGFR behandling (cetuximab) efter kirurgisk resektion; 150 (85,2%) patienter fik kun 5-FU baseret kemoterapi; og 26 (14,8%) patienter fik 5-FU med anti-EGFR narkotika.

Genetiske ændringer forbundet med EGFR signalvejen i avancerede CRC’er

Alle de grundlæggende data er præsenteret i S2 tabel. Af tumor sager undersøgte, 87 (45,5%) havde vildtype

KRAS

og 104 (54,5%) havde

KRAS

mutationer. Blandt de tumorer med

KRAS

mutationer blev mutationer i codon 12 eller 13 observeret i 97 (93,3%), hvorimod der ikke blev observeret mutationer i codon 61 i 7 (6,7%) patienter.

BRAF

(V600E) mutationer blev fundet i 6 (3,1%) tumorer.

PIK3CA

mutationer blev identificeret i 25 (13,1%) tumorer. De to mest almindelige

PIK3CA

mutationer blev placeret i exon 9 (17 tilfælde, 68,0%) og exon 20 (5 tilfælde, 20,0%). Andre sjældne mutationer blev placeret i exon 1 og 4 (2 tilfælde, 8,0%). Et tilfælde nærede en

PIK3CA

exon 4 mutation samt

PIK3CA

exon 9 mutation. SISH analyse viste

HER2

genamplifikation i 16 (8,4%) tumorer. Tre sager fra denne kohorte var MSI-H (1,6%), og de resterende 188 (98,4%) tilfælde blev klassificeret som MSS /MSI-L.

Ud af 104

KRAS

mutant form CRC tilfælde, 23 (22,1%) havde

PIK3CA

mutationer,

HER2

amplifikationer, eller

BRAF

mutationer (tabel 1). Atten tilfælde viste

PIK3CA

mutation, viste 4 tilfælde

HER2

forstærkning, ét tilfælde havde begge

BRAF

PIK3CA

mutationer, og ét tilfælde havde både

PIK3CA

mutation og

HER2

forstærkning. Ud af 87

KRAS

vildtype CRC’er,

BRAF

mutationer,

PIK3CA

mutationer, og

HER2

amplifikationer blev fundet i 5 (5,7%), 6 (6,9%), og 11 (12,6%) tilfælde, henholdsvis; samlet, 21 af 87

KRAS

vildtype sager (24,1%) havde

BRAF

mutationer,

PIK3CA

mutationer, eller

HER2

amplifikationer.

det er interessant, at tilstedeværelsen af ​​

PIK3CA

mutationer var signifikant associeret med tilstedeværelsen af ​​

KRAS

mutationer (

P

= 0,020; tabel 2). Mutationer i

KRAS

BRAF

var næsten udelukker hinanden; dog et tilfælde nærede samtidig

KRAS

og

BRAF

mutationer.

HER2

amplificeringer og

BRAF

mutationer tendens til at blive observeret hyppigere i

KRAS

vildtype tumorer end i

KRAS

mutant typen tumorer med borderline statistisk signifikans (

P

= 0,052 og

P

= 0,094, henholdsvis). MSI status viste ikke nogen sammenhæng med disse genetiske ændringer i denne kohorte.

Foreningen af ​​genetiske ændringer med clinicopathologic funktioner

Tabel 3 viser, at forholdet mellem genetiske ændringer og clinicopathologic karakteristika.

KRAS

mutant tumorer var mere tilbøjelige til at blive placeret i den rigtige kolon (

P

= 0,021). Disse tumorer blev også forbundet med lav kvalitet histologi (

P

= 0,029).

BRAF

mutant tumorer blev signifikant associeret med T4 dybde invasion (

P

= 0,033). Selv om det ikke nåede statistisk signifikans,

BRAF

mutant tumorer tendens til at være placeret i den rigtige kolon (

P

= 0,127), og at have lymfatisk invasion (

P

= 0,097) sammenlignet med de samme funktioner i

BRAF

vildtype tumorer. Tumorer med

HER2

amplifikationer var signifikant korreleret med en distal placering (

P

= 0,006).

HER2

amplifikationer viste også en forening med yngre, men denne forskel var ikke statistisk signifikant (

P

= 0,081). Der var ingen andre signifikante associationer mellem

PIK3CA

mutationer eller MSI-status med clinicopathologic faktorer.

Prognostisk betydning af genetiske ændringer

For at bestemme den prognostiske betydning af disse genetiske ændringer, overlevelse analyser blev udført ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden til OS (fig 1). Opfølgningsdata fra alle 191 CRC patienter blev inkluderet i overlevelse analyse. Der var 84 CRC-relaterede dødsfald, og den mediane opfølgningstid var 37,9 måneder (interval, 0.8-104.6 måneder). Patienter med

BRAF

mutationer viste en tendens til, ugunstig resultat for OS, men dette resultat nåede ikke statistisk signifikans (

P

= 0,081).

KRAS

mutationer,

PIK3CA

mutationer,

HER2

amplifikationer, og MSI-status viste ikke nogen sammenhæng med patienternes OS (

P

= 0,993 ,

P

= 0,538,

P

= 0,368, og

P

= 0,538, henholdsvis). Mutation af

KRAS

codon 61 tendens til at være forbundet med kortere samlet overlevelse, men det nåede ikke statistisk signifikans (

P

= 0,554).

Kaplan-Meier overlevelse skøn grafer af samlet overlevelse (OS) i 191 avancerede CRC patienter i henhold til

KRAS

mutationer status (a), placering af

KRAS

mutationer i avancerede CRC patienter (b),

BRAF

mutationer (c),

PIK3CA

mutationer (d),

HER2

amplifikationer (e), og MSI-status (f).

Interessant,

KRAS

vildtype undergruppe med

BRAF

mutationer eller

HER2

amplifikationer viste den værste prognose i kombinerede analyser (

P

= 0,004, fig 2A). Ved at bruge Cox proportional hazard model, denne undergruppe var dårlig prognostisk faktor (HR, 2,055, CI, 1,093-3,861;

P

= 0,025) uafhængigt af alder og ved første diagnosticering (S3 tabel). Blandt 191 avancerede CRC’er, blev 165 patienter ikke behandlet med anti-EGFR narkotika patienter, hos hvem den

KRAS

vildtype undergruppe med

BRAF

eller

HER2

ændringer viste også værste prognose (

P

= 0,012, fig 2B). Ved at bruge Cox proportional hazard model, denne undergruppe var dårlig prognostisk faktor med borderline statistisk signifikans (HR, 1,984, CI, 0,963-4,085;

P

= 0,063; data ikke vist). Men i 26 patienter behandlet med 5-FU med anti-EGFR narkotika,

KRAS

vildtype undergruppe med

BRAF

eller

HER2

ændringer var ikke forbundet med dårlig prognose (

P

= 0,305, data ikke vist), som kan være på grund af lille antal sager. I

KRAS

vildtype undergruppe,

BRAF

eller

HER2

ændringer blev forbundet med høj kvalitet histologisk differentiering, fremskredent stadium, lymfe invasion og perineural invasion, men med borderline statistisk signifikans (S4 tabel).

Resultater af kombineret analyse i avancerede CRC patienter med

KRAS

vild undergruppe type i henhold til

BRAF

mutation og

HER2

forstærkning uanset anti-EGFR behandling status (n = 191) (a), i hvem blev ikke behandlet med anti-EGFR lægemidler (n = 165) (b).

Sammenligning af Cobas real time PCR og Sanger sekventering metoder til

KRAS

mutationer

af 191 CRC prøver, væv af 97 patienter var tilgængelige for analyse at sammenligne påvisning af

KRAS

mutationer med Sanger sekventering test og Cobas realtids-PCR test. Af de 97 tumorer inkluderet,

KRAS

mutationer blev påvist i 49 tilfælde (50,5%) ved Sanger sekventering test. Mutationer i

KRAS

codon 12 eller 13 og

KRAS

codon 61 blev påvist i 47 (48,5%) og 2 (2,1%) tilfælde, hhv. På den anden side, 56 tilfælde (57,7%) af

KRAS

mutationer blev påvist ved real-time PCR-test; testen placeret 52 (53,6%) mutationer i kodon 12 eller 13 og 4 (4,1%) mutationer i codon 61. realtids-PCR test viste en højere følsomhed end den Sanger sekventering testen.

Diskussion

KRAS

er en velkendt driver onkogen i CRC’er og tilstedeværelsen af ​​

KRAS

mutation forudsiger dårlig reaktion på anti-EGFR målrettet terapi i metastaserende CRC patienter. Vi evaluerede de frekvenser og clincopathologic betydning af mutationer i

KRAS

,

BRAF

, og

PIK3CA

, og

HER2

forstærkning, samt forholdet af disse genetiske ændringer i avancerede CRC patienter, der var kandidater til anti-EGFR behandling i daglig praksis. Mutationer i

KRAS

,

BRAF

, og

PIK3CA

blev fundet i 104 (54,5%), 6 (3,1%), og 25 (13,1%) tilfælde af fremskreden CRC henholdsvis. Desuden MSI-H fænotype og

HER2

forstærkning hos 3 (1,6%) og 16 (8,4%) tilfælde, hhv.

Udviklingen af ​​målrettede behandlinger mod specifikke molekylære forandringer har bidrog til forvaltningen af ​​avancerede CRC patienter, og anti-EGFR lægemidler bruges til disse patienter. Selv om tilstedeværelsen af ​​

KRAS

mutation er nyttigt at udelukke patienter, der ikke vil nyde godt af anti-EGFR behandling, mange patienter med vildtype

KRAS

CRC viser negative reaktioner på denne behandling. Til dato er det, at

BRAF

mutationer,

PIK3CA

mutationer, og

HER2

amplifikationer er forbundet med de underliggende mekanismer for disse stakkels reaktioner [4,5]. I vores kohorte, 16 af 87

KRAS

vildtype sager (18,4%) havde

BRAF

mutationer eller

HER2

amplificeringer; Desuden viste kombineret analyse at

KRAS

vildtype patienter med

BRAF

mutationer eller

HER2

amplifikationer havde den værste prognose. Fordi de målrettede behandlinger til

BRAF

mutationer og

HER2

amplifikationer har betydelig overlevelse fordel i forskellige menneskelige kræftformer [10,18,19], behandling med anti-BRAF og anti-HER2 midler kan være en god terapeutisk strategi til forbedring af overlevelsen i CRC patienter med vildtype

KRAS

personen skjult

BRAF

mutationer eller

HER2

amplificeringer, og som også har primær eller sekundær resistens over for anti-EGFR behandling.

på trods af et lille antal tumorer med

PIK3CA

mutationer i vores kohorte, fandt vi, at

PIK3CA

mutationer i høj grad overlappede med

KRAS

mutationer, hvilket var i overensstemmelse med de tidligere undersøgelser i EU [20] og japanske [21] CRC patienter med metastaser. I øjeblikket adskillige hæmmere rettet mod

PIK3CA

signalvejen er blevet udviklet, og disse midler er ved at blive testet i prækliniske og kliniske forsøg med patienter med CRC [22-24]. I betragtning af vores resultat og de tidligere undersøgelser [20,21], at

KRAS

mutationer ofte sameksisterede med

PIK3CA

mutationer, hæmme

PIK3CA

signalvejen kan være en nyttig terapeutisk strategi at behandle CRC patienter med

KRAS

mutationer.

Alt i alt 24 af 191 tilfælde (12,6%) havde to eller flere onkogene ændringer i denne undersøgelse. Det kan fortolkes, at disse genetiske ændringer forekomme på samme tid i samme tumor, men det kan skyldes tumor heterogenitet. Under tumorprogression, onkogene ændringer udvikle sig i en sub-klon, som bidrager til kræft metastase og resistens. Vi brugte mere følsomme detektionsmetoder, således kunne påvises mutationer i mindre tumor celle population. Ved forvaltningen CRC patienter, følsom molekylær diagnostik er nyttigt at opdage mindre onkogene ændringer, som kan være det næste mål i avanceret CRC patienter med primær eller sekundær resistens over for den første linje målrettet behandling. I vores kohorte, et tilfælde nærede samtidig

KRAS

og

BRAF

mutationer. Det er velkendt, at

BRAF

mutationer er normalt påvises i

KRAS

vildtype tumorer, og at de er næsten gensidigt udelukkende med

KRAS

mutationer i CRC. Flere undersøgelser har rapporteret, at sjældne tilfælde harbour kombineret

KRAS

BRAF

mutationer, som forekommer i mindre end 0,02% [25,26]. Selvom tumor biologi og prognose af patienter med samtidig

KRAS

BRAF

mutationer har været endnu uvist, tidligere forskning tyder på, at disse samtidige mutationer er associeret med tumorudvikling såsom lymfeknude metastaser og højere T etape [25,27]. Yderligere er der behov for store undersøgelser for at klarlægge forekomsten og biologiske funktion af samtidig

KRAS

og

BRAF

mutationer.

Tidligere studier med avancerede CRC patienter med metastaser rapporteret, at ca. 34 ~ 45% af patienterne havde

KRAS

mutationer [20,21,28]. Denne undersøgelse med koreanske CRC patienter viste, at hyppigheden af ​​

KRAS

mutationer var 54,5%, og at disse mutationer blev set primært i codon 12 eller 13 (93,3%). Hyppigheden af ​​

KRAS

mutationer i denne kohorte var lidt højere end i tidligere offentliggjorte rapporter om metastatisk CRC patienter [20,21,28]. Der er flere mulige forklaringer på det. Først, vi inkluderede kun avancerede CRC patienter i denne kohorte, som eventuelt tegner sig for højere frekvens af

KRAS

mutationer. For det andet var der nogle forskelle i mutation påvisningsmetoder. Vi analyserede mutation status ved hjælp af Cobas realtids-PCR, som anses for at vise højere følsomhed end andre påvisningsmetoder.

Det er blevet rapporteret, at de fleste af

KRAS

mutationer i CRC patienter forekommer i codon 12 og 13. Denne undersøgelse viste også, at

KRAS

mutationer sås primært i codon 12 eller 13 (93,3%). I vores

KRAS

mutation undergruppe analyse, mutation af

KRAS

codon 61 tendens til at være forbundet med kortere samlet overlevelse, men det nåede ikke statistisk signifikans. Den prognostiske betydning af

KRAS

codon 61 mutationer er blevet rapporteret i flere tidligere undersøgelser, dog med kontroversielle resultater [29]. Fordi forekomsten af ​​

KRAS

codon 61 mutationer er sjældne, yderligere omfattende undersøgelser kan bidrage til at afklare forholdet mellem disse mutationer og klinisk resultat.

Mutationer af

BRAF

PIK3CA

blev fundet i 3,1% og 13,1% af tilfældene, hhv. Selvom hyppigheden af ​​disse mutationer blev anset for at være lav, var de samme som hos tidligere undersøgelser i avanceret CRC [20,21,28]. Efter aftale med tidligere undersøgelse [30],

BRAF

mutationer var forbundet med aggressiv CRC histologi, såsom højere T scenen og tilstedeværelse af lymfatisk invasion. Selvom resultaterne ikke nåede statistisk signifikans, patienter huser

BRAF

mutationer viste også kortere OS

Vi evaluerede to metoder til påvisning af

KRAS

mutationer i CRC prøver:. Cobas real -tid PCR og Sanger sekventering. Der var en god korrelation mellem

KRAS

mutationsdetektion af real-time PCR og af Sanger-sekventering, og real-time PCR viste højere følsomhed end Sanger-sekventering. I vores kohorte, 7 tilfælde af

KRAS

mutationer blev påvist ved real-time test, der ikke blev påvist ved Sanger-sekventering test, specielt 5 tilfælde for codon 12 eller 13 og 2 tilfælde for codon 61. Sanger sekventering metode, udviklet i 1975, blev betragtet som en af ​​de grundlæggende mutation påvisningsmetoder; Men denne metode synes at have begrænset følsomhed-et lavt niveau af den mutante allel kan være påvises ved denne metode [31]. Omvendt er det real-time PCR-test, herunder forskellige kommercielle kits anses for at være en meget følsom metode, der viser fordele i at opdage

KRAS

mutationer [32]. Til dato har den betydelige intratumoral heterogenitet af molekylære forandringer og deres kliniske betydning for målrettet terapi blevet beskrevet i forskellige tumorer. I CRC, rapporterede flere undersøgelser den kliniske betydning af

KRAS

heterogenitet anti-EGFR behandling [5,33,34]. Normanno et al. foreslog, at et lavt indhold af

KRAS

mutante alleler var tilstrækkelig til at fremkalde resistens over for EGFR monoklonale antistoffer, og tærsklen i deres undersøgelse var 3 ~ 10% af mutant

KRAS

allel frekvens, som var usandsynligt der skal detekteres ved anvendelse af Sanger-sekventering [33]. Selvom yderligere undersøgelser er nødvendige for at validere disse resultater og præcisere den rolle, de molekylære ændringer af resistens mod anti EGFR behandling, nøjagtig påvisning af disse mutationer har stor klinisk betydning.

Afslutningsvis fandt vi, at forekomsten af

KRAS

mutationer var 54,5% i koreanske avancerede CRC patienter, som var hyppigere end rapporteret i andre populationer.

BRAF

mutationer eller

HER2

amplifikationer blev fundet i 16,1% af

KRAS

vildtype patienter, og derudover kombineret analyse viste, at

KRAS

vildtype patienter med

BRAF

eller

HER2

amplifikationer havde den værste prognose.

PIK3CA

mutationer blev observeret hyppigere i

KRAS

mutant type end i vildtype

KRAS

CRC patienter.