PLoS ONE: antitumoraktivitet af en nye forbindelse-CDF medieres af Regulering miR-21, miR-200, og PTEN i kræft i bugspytkirtlen

Abstrakt

Baggrund

Eksistensen af ​​kræft stamceller (CSCS) eller cancer stamceller-lignende celler i en tumor masse menes at være ansvarlig for tumor tilbagefald på grund af deres indre og ydre lægemiddel-resistens egenskaber. Derfor vil målrettet drab af CSCS være en nyere strategi til forebyggelse af tumortilbagevenden og /eller behandling ved at overvinde drug-resistens. Vi har udviklet en hidtil ukendt syntetisk forbindelse-CDF, som viste større biotilgængelighed i animalske væv, såsom bugspytkirtel og inducerede også cellevækstinhiberingen og apoptose, der blev medieret ved inaktivering af NF-KB, COX-2, og VEGF i pancreascancer ( PC) celler.

Metodologi /vigtigste resultater

i den aktuelle undersøgelse, vi viste for første gang, at CDF væsentlig grad kan hæmme kuglen-dannende evne (pancreatospheres) af PC celler i overensstemmelse med øget nedbrydning af pancreatospheres, som blev forbundet med svækkelse af CSC markører (CD44 og EpCAM), især i gemcitabin-resistente (MiaPaCa-2) PC celler indeholdende høj andel af CSCS konsistente med øget mIR-21 og faldt mIR-200. I et xenotransplantat musemodel af human PC, CDF behandling signifikant inhiberede tumorvækst, som blev forbundet med nedsat NF-KB-DNA-bindingsaktivitet, COX-2, og MIR-21 ekspression og forøget PTEN og MIR-200-ekspression i tumorceller rester.

konklusioner /betydning

Disse resultater tyder på, at anti-tumor aktivitet af CDF er forbundet med hæmning af CSC funktion via nedregulering af CSC-associerede signalveje. Derfor CDF kunne være nyttig til forebyggelse af tumor tilbagefald og /eller behandling af PC med bedre behandlingsresultater i fremtiden

Henvisning:. Bao B, Ali S, Kong D, Sarkar SH, Wang Z, Banerjee S, et al. (2011) antitumoraktivitet af en hidtil ukendt forbindelse-CDF medieres af Regulering MIR-21, MIR-200, og PTEN bugspytkirtelkræft. PLoS ONE 6 (3): e17850. doi: 10,1371 /journal.pone.0017850

Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania, USA

Modtaget: December 13, 2010; Accepteret: 10. februar, 2011; Udgivet: 9 marts 2011

Copyright: © 2011 Bao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. National Cancer Institute, NIH tilskud 5R01CA131151, 3R01CA131151-02S1, og 5R01CA132794 (FH Sarkar). Vi takker Puschelberg og Guido grundlaget for deres generøse finansielle bidrag. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen (PC) er en af ​​de mest dødelige maligne sygdomme med værste prognose, der er rangeret som den fjerde hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA [1]. I de seneste to årtier, er blevet gjort mange anstrengelser for at forbedre behandling og overlevelse PC patienter, men resultatet har været skuffende. Denne skuffende resultat skyldes mange faktorer, blandt hvilke

de novo

modstand (iboende) og erhvervet (ydre) modstandsdygtighed over for konventionelle lægemidler (kemoterapi og strålebehandling), herunder gemcitabin alene eller i-kombination med andre cytotoksiske eller målrettede agenter . Ny dokumentation tyder på, at resistens kan faktisk skyldes den berigede foreligger tumorfremkaldende celler, også klassificeret som cancer stamceller-lignende celler (CSC) i en tumormasse [2] – [6]. De CSCS har kapacitet til selvfornyelse og potentialet til at regenerere til alle typer af differentierede celler, der giver anledning til heterogene tumorcellepopulationer i en tumormasse, som bidrager til tumor aggressivitet [2] – [6]. Således er den manglende eliminere disse specielle celler anses for at være en af ​​de underliggende årsager til dårlig behandlingsresultat med konventionelle terapeutiske midler, hvilket tyder på, at der skal udvikles nyere og nye terapeutiske strategier til målrettet drab af lægemiddelresistente CSCS for at udrydde risikoen tumor tilbagefald til forbedring af overlevelsen af ​​patienter diagnosticeret med PC.

på jagt efter nye endnu ikke-toksiske stoffer, opmærksomhed har været fokuseret på naturlige stoffer i flere år. Et sådant middel er curcumin (diferuloylmethane), som er afledt fra planten Curcuma longa (Linn) dyrket i tropiske Sydøstasien [7] – [9]. Curcumin er blevet vist at inhibere væksten af ​​en række forskellige tumorceller; Men den dårlige biotilgængelighed af curcumin begrænser dens anvendelse i klinikken. For nylig har vi udviklet en ny syntetisk analog af curcumin, 3,4-difluor- benzo-curcumin [vi navngivet det som Difluorinated-Curcumin eller kort sagt CDF [10], [11]], som viste større biotilgængelighed i bugspytkirtlen væv, og også inhiberede cellevækst, DNA-bindende aktivitet af NF-KB, Akt, COX-2, og produktionen af ​​PGE

2 og VEGF, og forårsagede induktion af mIR-200 og inaktivering af mIR-21 i PC celler [ ,,,0],12]. Siden miR-200 er forbundet med erhvervelsen af ​​epitelial til mesenkymale overgang (EMT), som også menes at være forbundet med CSCS eller cancer stamceller-lignende celler, her undersøgte vi effekten af ​​CDF på CSC-funktion.

Her rapporterer vi for første gang, at CDF kunne inaktivere mange funktioner i CSCS herunder selvfornyelse kapacitet som påvist af hæmning af kugle-dannende (pancreatospheres) evne resistente PC celler, som var i overensstemmelse med inaktivering af CSC biomarkører såsom CD44 og EpCAM. Vi viste også anti-tumor aktiviteten af ​​CDF alene og i-kombination med gemcitabin, hvilket var i overensstemmelse med inaktivering af MIR-21, og følgelig forøget ekspression af PTEN, dæmpning af DNA-bindende aktivitet af NF-KB-inhibering i ekspressionen af ​​COX -2, og aktivering i ekspressionen af ​​mIR-200 i tumor resterne af en xenotransplantat musemodel af human PC, som alle giver overbevisende

in vivo

aktiviteten af ​​CDF som er konsistent med

in vitro

resultater.

Resultater

aSPC-1 og MiaPaCa-2 cellelinjer og deres kloner blev valgt til denne undersøgelse på grund af deres relativt resistent natur. CSC karakteristika ved disse cellelinjer under anvendelse stamcellemarkører ‘Lin28B og Nanog ved RT-PCR, og EpCAM og CD44 ved Western blot viste en stigning i ekspressionsniveau i PC-GTR cellelinier i forhold til deres parentale cellelinier (figur 1) . Derfor valgte vi disse til at teste vores hypotese, at CDF er mere effektiv end curcumin selv i resistente cellelinier og også deres resistente kloner-GTR.

karakteristika CSCS blev yderligere bekræftet af protein ekspressionen af ​​EpCAM og CD44 ( C).

CDF forhindrer stærkt clonogenicity og invasion af PC celler i forhold til gemcitabin og curcumin

Vi valgte koncentration på 20 nmol /l af gemcitabin og 4 mmol /l af curcumin eller CDF at gennemføre klonogene assay efter vores tidligere publikation [12]. Resultaterne viste, at der var en signifikant reduktion i clonogenicity af AsPC-1 og MiaPaCa-2-celler behandlet med curcumin og CDF, men ikke med gemcitabin (figur 2A). Men CDF behandling havde en langt større og væsentlig reduktion i kolonidannelse i forhold til curcumin. ASPC-1-GTR og MiaPaCa-2-GTR celler havde en 80% reduktion af clonogenicity med CDF behandling, mens kun var 20-30% reduktion af clonogenicity observeret med gemcitabin eller curcumin behandling (figur 2A). Samlet viste CDF behandling en signifikant reduktion i clonogenicity af humane PC celler, hvilket antyder overlegenhed CDF.

Fluorescens af de invaderede celler blev aflæst under anvendelse ULTRA Multifunktionel mikropladelæser (TECAN) ved excitation /emission bølgelængder på 530 /590 nm. Basal niveau af ABCG2 udtryk viser relativt højere udtryk i lægemiddelresistente cellelinier (C).

CDF eller curcumin behandling faldt PC celle migration og invasion. Resultaterne viste, at 4 pmol /l curcumin havde minimal inhibering af invasion henviser lignende koncentration af CDF viste signifikant inhibering af invasion (figur 2B). Det basale niveau af ABCG2 ekspression blev fundet i parentale cellelinier (

de novo

lægemiddelresistente celler); imidlertid var niveauet af ekspression af ABCG2 yderligere forøget i lægemiddelresistente (erhvervet lægemiddelresistente) cellelinier (figur 2C).

CDF inhiberede levedygtighed humane PC celler mere end curcumin og gemcitabin som vurderet ved MTT-assay

Oprindeligt MTT assay blev udført for at undersøge virkningen af ​​forskellige koncentrationer af gemcitabin (1 til 50 nmol /l), og curcumin eller CDF (2-6 mmol /l) på celleoverlevelse efter 72 timer af behandlingen (data ikke vist). Efterfølgende blev 4 pmol /l CDF eller curcumin, og 20 nmol /l af gemcitabin anvendes til behandling af såvel individuelt som i kombination med gemcitabin i 72 timer. Resultaterne viste, at CDF behandling i kombination med gemcitabin forårsaget en bemærkelsesværdig reduktion af celleoverlevelse i alle fire cellelinjer sammenlignet med curcumin og gemcitabin kombinationsbehandling (figur 3). En analyse af lægemiddelkombination behandling viste, at kombinationen indekset efter behandling med CDF i kombination med gemcitabin var mindre end 1,00 (figur 3), hvilket tyder på den synergistiske virkning af CDF kombination. I modsætning hertil kombinationsindekset med curcumin og gemcitabin var mere end 1,00 (figur 3), der viser ikke-synergistisk virkning. Samlet set tyder disse resultater på, at CDF forårsagede en langt større reduktion af celleoverlevelse i PC celler, sammenlignet med gemcitabin /curcumin alene eller kombinationer sammenlignet med CDF og gemcitabin kombination.

MTT-assay blev udført i alt fire celle linjer efter 72h af behandling med CDF, curcumin, eller dens kombination med gemcitabin. Ubehandlet kontrol er blevet tildelt en værdi på 100%. Den p-værdi viste repræsenterer sammenligninger mellem enkeltstof og deres kombinationer ved hjælp af parret t-test. Kombinationen Index (CI) 1 for CDF og Gemcitabin kombination indikerer synergisme

CDF bemærkelsesværdigt øget pancreatosphere opløsningen af ​​PC celler

For at undersøge effekten af ​​behandlinger på kuglen formgivning. evne PC celler (pancreatosphere) og opløsningen af ​​pancreatospheres gennemførte vi sfære disintegrationsassay i 10 dage for at generere dannelsen af ​​pancreatospheres, efterfulgt af 5 dages lægemiddelbehandling. Resultaterne viser, at der var en bemærkelsesværdig stigning af kugle disintegration af curcumin og CDF behandling, ikke ved gemcitabin (figur 4). Imidlertid blev der observeret den største effekt på disintegration som reaktion på CDF behandling (figur 4), en gang igen antyder, at CDF er meget mere overlegen i inhibering funktionerne af cancer stamceller-lignende celler.

P-værdier blev beregnet af den parrede

t

test.

CDF hæmmede pancreatospheres dannelse i PC celler

for at undersøge effekten af ​​lægemidler på CSC selvfornyelse kapacitet i PC celler, gennemførte vi sfære formation assay for 1 uge og fire uger (figur 5A og B). Resultaterne indikerede, at CDF i kombination med gemcitabin fuldstændigt elimineret pancreatospheres dannelse efter fire ugers behandling sammenlignet med gemcitabin og curcumin kombination i PC celler selv i gemcitabin resistent PC celler, hvilket antyder, at CDF kan forårsage pancreatospheres mere følsomme over for gemcitabin end curcumin behandling, og kan være nyttige for målrettet drab på CSCS. Figur 5C viser virkningen af ​​forskellige koncentrationer af gemcitabin og CDF på 2

nd passage af pancreatospheres i forbehandlede primære pancreatospheres af AsPC-1-celler. CDF behandling bemærkelsesværdigt inhiberede 2

nd passage af pancreatospheres på en dosis-afhængig måde. Desuden CDF-præ-behandlede celler udviste en større effekt end ikke-CDF-præ-behandlede celler.

En betydelig reduktion i pancreatospheres blev observeret i celler behandlet med CDF vist ved stjerne

CDF faldt CD44 og EpCAM udtryk i pancreatospheres af PC celler

Vi undersøgte effekten af ​​lægemidler på CSC biomarkører, CD44 og EpCAM i pancreatospheres af aspC-1 og aspC-1-GTR celler ved konfokal mikroskopi (figur 6). Resultaterne indikerer, at CDF faldt CD44 og EpCAM ekspression i pancreatospheres, tyder den inhiberende virkning af CDF på pancreatosphere dannelse kan være forbundet med inhiberingen af ​​CD44 og EpCAM ekspression.

Ekspression i pancreatospheres af AsPC-1 og AsPC- 1-GTR celler blev vurderet ved konfokal mikroskopi (forstørrelse X250).

CDF i kombination med gemcitabin hæmmet i bugspytkirtlen tumorvækst in vivo meget mere end curcumin kombination

Vi har brugt en subkutan xenograft tumor model, hvor tumoren blev induceret ved MiaPaCa-2-celler i CB17-SCID-mus. CDF behandling i kombination med gemcitabin inhiberede signifikant tumorvækst i MiaPaCa-2 tumorer langt mere end curcumin og gemcitabin kombination (figur 7A) samt i forhold til enten ubehandlede kontroller eller dem behandlet med en enkelt lægemiddel. Musene viste ingen tab i vægt under behandlingen (30 dage), hvilket antyder, at disse behandling havde ingen større bivirkninger på dyr.

Anti-tumor aktivitet og ændringer i tumorvægt fra hver gruppe af dyr ( EN). Pilen angiver første dag af behandlingen. NF-KB-DNA-bindingsaktivitet af tumorvæv; og NF-KB konkurrence kontrol undersøgelse med umærket NF-KB oligonukleotid (B). Western blots analyse af COX-2, PTEN og β-actin-ekspression i tumorceller rester (C); MIR-21, MIR-200b og MIR-200C-ekspression i tumorceller rester som målt ved real-time RT-PCR (D). P-værdier blev beregnet ved den parrede

t

test.

CDF med Gemcitabin faldt betydeligt NF-KB-aktivering

in vivo

NF KB-aktivering blev bestemt i CDF eller curcumin, og /eller gemcitabin behandlede tumor rester afledt af MiaPaCa-2-celler inducerede tumorer som vist ovenfor. CDF og curcumin som enkeltstof nedreguleret NF-KB-aktivering mens gemcitabin aktiveret NF-KB-niveau, som blev ophævet i kombinationsbehandling med CDF. Kombinationen behandling af CDF med gemcitabin viste et signifikant fald i NF-KB niveau sammenlignet med curcumin og gemcitabin (figur 7B), hvilket antyder, at inaktivering af NF-KB kunne være en af ​​de molekylære mekanismer, hvormed CDF fremkalder dens anti-tumor aktivitet mod PC tumorer.

CDF virkninger på proteinekspression

in vivo

COX-2, PTEN, og β-actin-ekspression blev bestemt ved Western blot. En signifikant nedregulering i ekspressionen af ​​COX-2 blev observeret i både kombinationen, men virkningen var mere udtalt i CDF kombination gruppe. Ekspressionen af ​​phosphatase og spændinger homolog (PTEN), blev et tumorsuppressorgen sig at være nedsat i MiaPaCa-2-celler; imidlertid ekspressionen af ​​PTEN var opreguleret ved behandling med CDF (figur 7C). Disse resultater antyder, at CDF er langt mere effektiv end curcumin. Da PTEN er en kendt mål for MIR-21, som er blevet rapporteret at være opreguleret i PC [13] – [15], vurderede vi ekspressionsniveauerne af MIR-21 i tumor rester som vist nedenfor

Modulation i ekspressionen af ​​miR-21 og miR-200 familie

in vivo

Vi bestemt ekspressionsniveauerne af miR-21, miR-200b og miR-200c i MiaPaCa-2 tumorer ved real time RT-PCR. Over-ekspression af MIR-21 blev observeret i MiaPaCa-2 tumorer henviser vi fandt en signifikant reduktion i ekspressionen af ​​MIR-21 i tumorer behandlet med enten alene eller i kombination med CDF og gemcitabin (figur 7D) CDF. Vi yderligere bestemmes ekspressionsniveauerne af miRNA-200b og MIR-200c i tumorvæv, som er kendte regulatorer af EMT og fundet at være signifikant lav i MiaPaCa-2-celler (figur 7D). I modsætning hertil fandt vi, at CDF behandling med eller uden gemcitabin kombination viste forøget ekspression af både MIR-200b, og MIR-200C, men effekten med curcumin eller fusionering var minimal, hvilket tyder overlegenhed CDF til undertrykkelse af ekspressionen af ​​miR -21, hvilket resulterer i re-ekspressionen af ​​PTEN, og re-ekspressionen af ​​miR-200, som kunne være ansvarlig for tilbageførsel af EMT fænotype i celler behandlet med CDF. Samlet set tyder disse resultater på, at de fænotypiske karakteristika af MiaPaCa-2 tumorer er konsistent med beriget population af CSCS og EMT egenskaber, og disse lægemiddelresistente celler kan blive dræbt enten ved CDF alene eller i kombination med gemcitabin.

Pancreatospheres øget tumorvækst

in vivo

Under traditionelle eksperimentelle betingelser, vi normalt injicere en million celler for vurdering tumorvækst; men for at undersøge større potentiale af tumorvækst ved pancreatospheres, vi injiceres kun 5.000 celler i mus som en proof-of-concept studie. Tumorvægten blev bemærkelsesværdigt forøget som dagene skred (figur 8A). Niveauet af miR-21 blev forøget mellem tumorer implanteret med en million af forældrenes celler i forhold til pancreatospheres (Figur 8B). Dyret blev aflivet efter 30 dage på grund af tumor byrde, og grove tumorer er vist i figur 8C indikerer større tumorer samt loco-regional lymfeknude metastaser mens tumorer afledt af forældrenes celler ikke viste nogen metastaser over en periode på 30 dage. De tumorafledte celler viste signifikant inhibering af pancreatospheres når de behandles med CDF (figur 8D). Samlet set tyder disse resultater på, at CSCS (pancreatospheres) kan dyrkes i mus og CDF kunne være nyttige til drab af disse lægemiddelresistente celler (fig. 8).

(A). 5.000 pancreatospheres blev podet i mus ved hjælp 01:01 matrigel, progressiv tumorvækst over en periode på 30 dage. Moderat stigning i ekspressionen af ​​MIR-21 som målt ved real-time RT-PCR blev observeret i tumorer afledt af pancreatospheres sammenlignet med tumorer afledt af parentale celler ved injektion af en million celler og tumor blev vurderet i den samme periode (B) . Fotografier, der viser tumorvækst, pilen peger på tumor og stjerne (*) henviser til loco-regional lymfeknude metastaser hvorimod vi ikke finde nogen metastaser, når en million parentale celler blev injiceret (C). Tumor celler høstet fra tumorer afledt af pancreatospheres blev behandlet med CDF viste signifikant hæmning i dannelsen af ​​pancreatospheres (D).

Diskussion

I dette studie har vi vist, at en syntetisk analog af curcumin, CDF, er signifikant mere effektiv sammenlignet med curcumin i drab af gemcitabin-resistente pancreascancer (PC) -celler, der består høj andel af celler med cancer stamceller (CSCS) eller cancer stamceller-lignende celler egenskaber. Hæmningen af ​​cellevækst kunne delvis skyldes bedre cellulær optagelse, fastholdelse og reduceret metabolisk inaktivering af CDF af PC celler, hvilket er i overensstemmelse med vores offentliggjorte resultater om cellulære og dyr farmakokinetiske data [10], [11]. Vores tidligere rapporter viser, at CDF hæmmer NF-KB og COX-2-aktivitet i PC celler

in vitro

[12]. Her bekræfter vi disse observationer

in vivo

bruge en mus xenograftmodel. Således er drabet af gemcitabin-resistent PC celler ved CDF forbundet med inaktivering af NF-KB og COX-2 signalvej, som er meget vigtigt, fordi disse veje er kendt for at bidrage til lægemiddel-resistens af PC celler til kemoterapeutiske midler [16] -. [18]

CSCS omfatter kun en meget lille andel af celler i en tumormasse og besidder evnen til at forny sig selv og give anledning til differentierede tumorceller [3] – [5], [19] . CSC Teorien har grundlæggende kliniske implikationer især fordi CSC har været identificeret i mange maligne tumorvæv herunder pancreascancer og anses for at være meget modstandsdygtige over for kemo-strålebehandling end differentierede datterceller [3] – [5], [20]; dog CSCS isoleret fra humane tumorer er sædvanligvis utilstrækkelig til yderligere mekanistiske undersøgelser. Eksistensen af ​​CSCS giver en forklaring for den kliniske observation, at tumorregression alene ikke kan korrelere med patient overlevelse [21] på grund af tumor tilbagefald, hvilket til dels på grund af tilstedeværelsen af ​​CSCS. Derfor målrettet selvfornyelse veje og drab på CSCS kan give mere specifik tilgang til eliminering celler, der er den egentlige årsag til tumor tilbagefald. En potentiel udfordring i denne henseende er udviklingen af ​​behandlinger, som selektivt påvirker CSCS mens besparende normale stamceller, der kan påberåbe sig tilsvarende mekanismer til selvfornyelse. I denne undersøgelse har vi vist, at CDF ikke kun inhiberer cellevækst af PC celler, men også inhibere CSC selvfornyelse kapacitet som vurderet ved kugle-dannelse (pancreatospheres) assays. Derfor CDF kunne have et større potentiale til at inhibere cancervækst, som dokumenteret af vores xenotransplantat musemodel af gemcitabin resistente PC celler, som synes at være medieret via hæmning af CSC selvfornyelse kapacitet.

Emerging tyder den rolle af microRNA (miRNA) i mange biologiske processer [22] – [25]. Blandt mange miRNA, MIR-21, der almindeligvis betragtes som et onkogen, er overudtrykt i mange faste tumorer, herunder PC og er blevet rapporteret at være associeret med tumorudvikling, ringe overlevelse og medikamentresistens [13], [14], [26 ], [27]. I vores tidligere rapport, har vi vist, at ekspressionen af ​​miR-21 er opreguleret i gemcitabin resistente PC celler, og at dets udtryk kan være betydeligt nedreguleret af CDF behandling

in vitro

[12]. Den forøgede ekspression af MIR-21 er kendt for at være associeret med inaktivering af PTEN, en knowhow tumorsuppressorgen, hvilket resulterer i aktivering af PI3K /Akt /mTOR signalvej, hvilket fører til aggressiv tumor vækst [15], [28]. I denne undersøgelse har vi bekræftet, at CDF behandlingen kan resulterer i nedregulering af MIR-21, hvilket resulterer i opregulering af PTEN

in vivo

, hvilket antyder, at anti-tumor aktiviteten af ​​CDF er forbundet med opregulering af PTEN følge af inaktivering af mIR-21-ekspression.

i modsætning til mIR-21, er mIR-200 familien kendt som tumorsuppressor og de er normalt nedreguleret i nogle tumorer, herunder PC og tabet af ekspressionen af ​​miR-200 familien bidrager til købet af EMT fænotype og resistens. Nedregulering af MIR-200 ved siRNA teknik har vist sig at være forbundet med EMT fænotype, mens re-ekspression af MIR-200 kan resultere i tilbageførsel af EMT fænotype [29], [30]. I vores tidligere publikation [12], viste vi, at CDF behandling kunne re-udtrykke miR-200 i PC celler. Her viste vi for første gang, at CDF kan opregulere MIR-200b og MIR-200c i tumor resterne

in vivo

overensstemmelse med signifikant større hæmning af tumorvækst i xenotransplantat musemodel da CDF var anvendes i kombination med gemcitabin. Disse resultater tyder på, at anti-tumor aktivitet af CDF medieres via re-ekspressionen af ​​miR-200, der kan potentielt resulterer i tilbageførsel af EMT fænotype og kan også føre til at overvinde resistens i PC.

Som konklusion viste CDF langt mere udtalt vækst hæmmende effekt, hæmmede CSC selvfornyelse overensstemmelse med inaktivering af CSC biomarkører (CD44 og EpCAM) i PC celler, især i gemcitabin-resistente PC celler sammenlignet med curcumin. I xenotransplantat musemodel af humane PC tumorer induceret af MiaPaCa-2-celler, CDF udviser antitumoraktivitet ved at regulere COX-2, PTEN, MIR-21, MIR-200, og NF-KB

in vivo

. Disse resultater antyder kraftigt, at CDF kunne være et hidtil ukendt middel til behandling af PC generelt, men gemcitabin-resistente PC navnlig ved at dæmpe adfærd CSCS.

Materialer og metoder Salg

etiske retningslinjer

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Ethvert dyr fundet usund eller syg blev straks aflivet. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg i Wayne State University institutionelle brugere Animal Care udvalg (Permit nummer: A-10-03-08).

Cell Culture, Narkotika og reagenser

Humane bugspytkirtelkræft cellelinjer AsPC-1, og MiaPaCa-2 blev købt fra ATCC (Manassas, VA). Disse to cellelinjer aspC-1 og MiaPaCa-2 blev eksponeret for 200 nmol /l af gemcitabin og 5 pmol /l Tarceva (erlotinib) hver anden uge i cirka 6 måneder at skabe gemcitabin og Tarceva resistente (GTR) cellelinier, navngivet som AsPC-1-GTR og MiaPaCa-2-GTR hhv. Som et resultat, AsPC-1, AsPC-1-GTR, MiaPaCa-2, og MiaPaCa-2-GTR blev valgt til denne undersøgelse baseret på deres differentielle følsomhed for gemcitabin. Alle cellelinjer er blevet autentificeret (Applied Genomics Technology Center på Wayne State University) den 13. marts 2009, og disse godkendte celler blev frosset til senere brug. Den anvendte metode til test var kort tandem repeat profilering ved hjælp af PowerPlex 16 System fra Promega. Gemcitabin og curcumin blev indkøbt fra Eli Lilly (Indianapolis, IN) og Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), hhv. CDF blev syntetiseret som beskrevet i vores tidligere publikation [10], [11]. Gemcitabin blev opløst i vand, hvorimod CDF og curcumin blev opløst i DMSO med en slutkoncentration på 0,1% DMSO i mediet.

Antistoffer Salg

Antistoffer mod ABCG2 og PTEN blev indkøbt fra Santa Cruz ( Santa Cruz, CA). Antistof til COX-2 og β-actin blev erhvervet fra Cayman Chemicals (Ann Arbor, MI), og Sigma Chemicals (St. Louis, MO).

Klonogen assay

Klonogen assay blev udført at undersøge virkningen af ​​lægemidler på cellevækst i PC celler, som tidligere [12] beskrevne. 5 × 10

4-celler blev udpladet i en seks-brønds plade. Efter 72 timer af udsættelsen for 20 nmol /l af gemcitabin, 4 mmol /l af CDF eller curcumin blev cellerne trypsiniseret, og 1.000 enkelt levedygtige celler blev udpladet i 100 mm petriskåle. Cellerne blev derefter inkuberet i 10 til 12 dage ved 37 ° C i en CO 5%

2/5% O

2/90% N

2 incubator. Kolonier blev farvet med 2% krystalviolet og talt.

Invasion assay

invasiv aktivitet af celler blev testet ved hjælp af BD BioCoat tumorinvasion Assay System (BD Biosciences, Bedford, MA) ifølge producentens protokol som beskrevet tidligere [31]. Kort fortalt 5 × 10

4-celler blev podet med serumfrit medium suppleret med curcumin eller CDF ind i det øvre kammer og nederste brønde blev fyldt med komplet medium i systemet. Den, fluorescens blev læst ved hjælp Microplate Reader (TECAN) ved 530/590 nm og blev fotograferet.

Cell overlevelse assay

MTT assay blev udført ved hjælp AsPC-1, AsPC-1-GTR, MiaPaCa-2, og MiaPaCa-2-GTR som beskrevet tidligere [12] efter 72 timers behandling. Kombination indeks og Isobologram for kombinationsbehandlingen blev også beregnet og afbildet ved hjælp CalcuSyn software (Biosoft, Cambridge, Storbritannien) til at bestemme synergi baseret på metoden til Chou og Talalay [32].

Sphere dannelse /disintegrationsassay

Enkeltcellesuspensioner af celler blev udpladet på ultralave adhærente brønde i 6-brønds plade ved 1.000 celler /brønd i sfære dannelse medium [33]. Efter 7 dage blev kuglerne betegnet som “pancreatospheres” opsamlet ved centrifugering og tælles [33]. For sfære disintegrationsassay, 1.000 celler /brønd blev inkuberet i 10 dage, efter 5 dages lægemiddelbehandling, som undersøgte virkningen af ​​lægemiddelbehandling på sønderdeling af pancreatospheres som tidligere [33] beskrevne. De pancreatospheres blev opsamlet ved centrifugering og talt under et mikroskop.

Konfokal mikroskopi

Enkeltcellesuspensioner af AsPC-1 og AsPC-1-GTR-celler blev udpladet under anvendelse af ultralave adhærente brønde i 6- brønds plade ved 3.000 celler /brønd i sfære dannelse medium. Efter 7 dages behandling blev pancreatospheres opsamlet ved centrifugering, vasket med 1 x PBS og fikseret med 3,7% paraformaldehyd. CD44 og EpCAM antistoffer blev anvendt til immunfarvning assay som tidligere [29] beskrevne. De CD44 eller EpCAM-mærkede pancreatospheres blev fotograferet af konfokalmikroskopi (Leica TCS SP5) ved hjælp af software LAS AF 1.2.0 Build 4316.

Protein ekstraktion og Western blot-analyse

Proteiner blev udvundet fra alle fire cellelinjer og også fra animalske tumorvæv som tidligere [12] beskrevet. Relative ABCG2 blev evalueret for alle fire cellelinier. Virkningerne på COX-2, PTEN og β-actin-ekspression blev vurderet på tumorvæv ved Western blot analyse. som tidligere beskrevet [12].

Dyreforsøgstilsynet

Dyret Protokollen blev godkendt af Animal Investigation udvalget, Wayne State University, Detroit, MI. Kvinde CB17 SCID-mus 4 uger gamle, blev indkøbt fra Taconic Farms (Germantown, NY) og fodres Lab Diet 5021 (Purina Mills, Inc., Richmond, IN). Små fragmenter af MiaPaCa-2 xenograft blev implanteret subkutant og bilateralt i mus for narkotika-effektivitetsundersøgelserne. Når musene udviklede tydelige tumorer, blev de udvalgt tilfældigt i følgende behandlingsgrupper (n = 5 /gruppe): (1) ubehandlet kontrol; (2) CDF (5 mg /mus /dag), intragastrisk gang dagligt i 12 dage; (3) curcumin (5 mg /mus /dag), intragastrisk gang dagligt i 12 dage; (4) gemcitabin (1 mg /mus /dag), intravenøs hver tredje dag i i alt tre doser; (5) CDF og gemcitabin hjælp doserne angivet ovenfor; (6) curcumin og gemcitabin hjælp doserne som anført ovenfor. Tumormålinger og ændringer i vægt blev udført, og væv blev opbevaret ved -70 ° C for RNA og protein ekstraktion.

elektroforetiske mobilitet (EMSA) assay til vurdering af DNA-bindende aktivitet af NF-KB-

nukleare proteiner blev fremstillet ud fra tumorer væv under anvendelse af en Dounce-homogenisator med 400 pi iskold lysepuffer ekstraheret som tidligere beskrevet [34]. EMSA blev udført ved anvendelse af Odyssey Infrarød Imaging System med NF-KB IRDye mærket oligonukleotid fra LI-COR, Inc. (Lincoln, NE). Ti ug af ekstrakten kerneprotein blev anvendt som beskrevet tidligere [34]. NF-KB konkurrence kontrol undersøgelse Den blev udført ved anvendelse af umærket NF-KB konsensus oligonukleotid. Prøverne blev påsat og kørt ved 30 mA i 1 time. Gelen blev scannet ved hjælp af Odyssey Infrarød Imaging System (LI-COR, Inc.).

TaqMan miRNA Real-Time revers transkriptase-polymerasekædereaktion (RT-PCR)

For at bestemme udtrykket af miRNA (miRNA-200b, miR-200C, og miR-21) i MiaPaCa-2 tumorer, brugte vi TaqMan MicroRNA Assay kit (Applied Biosystems) efter producentens protokol. 5 ng af total RNA blev revers transkriberet og real-time PCR reaktioner blev udført som beskrevet tidligere [30], ved hjælp af Smart Cycler II (Cepheid).