PLoS ONE: to forskellige kategorier af Focal Sletninger i Cancer Genomes

Abstrakte

Et af de centrale spørgsmål om genomiske ændringer i kræft er, om de er funktionelle i den forstand, at bidrage til den selektive fordel af tumorceller. Den hyppighed, hvormed en ændring forekommer kan afspejle dens evne til at øge cancercellevækst, eller alternativt kan øget ustabilitet af et locus øge hyppigheden hvormed det viser sig at være afvigende i tumorer, uanset onkogen effekt. Her har vi behandlet dette på en genom-plan for cancerassocierede fokale deletioner, som vides at lokalisere begge tumorsuppressorgener (tumorsuppressorer) og ustabil loci. Baseret på DNA-kopi antal analyser af mere end én tusind menneskelige kræftformer, der repræsenterer ti forskellige tumortyper, observerede vi fem loci med fokale sletning frekvenser over 5%, herunder

A2BP1

gen ved 16p13.3 og

MACROD2

gen på 20p12.1. Men hverken RNA-ekspression eller funktionelle undersøgelser understøtter en tumor suppressor rolle for enten gen. Yderligere analyser tyder i stedet, at disse er steder med øget genomisk ustabilitet og at de ligner almindelige skrøbelige steder (CFS). Genom-dækkende analyse afslørede egenskaber CFS-lignende tilbagevendende deletioner som adskiller dem fra deletioner påvirker tumorsuppressorgener, herunder deres isolation på specifikke loci væk fra andre genomiske deletion sites, en betydelig mindre deletion størrelse og spredning i hele det berørte locus snarere end samling ved et fælles sted for overlapning. Derudover CFS-lignende deletioner have mindre indflydelse på genekspression og er beriget i cellelinjer sammenlignet med primære tumorer. Vi viser, at loci påvirket af CFS-lignende sletninger er ofte adskiller sig fra kendte fælles skrøbelige steder. Faktisk finder vi, at hver tumor vævstype har sin egen spektrum af CFS-lignende deletioner, og at coloncancere have mange flere CFS-lignende deletioner end andre tumortyper. Vi præsenterer enkle regler, der kan lokalisere fokale sletninger, der ikke er CFS-lignende og mere tilbøjelige til at påvirke funktionelle tumorsuppressorer

Henvisning:. Rajaram M, Zhang J, Wang T, Li J, Kuscu C, Qi H, et al. (2013) to forskellige kategorier af Focal deletioner i Cancer genomer. PLoS ONE 8 (6): e66264. doi: 10,1371 /journal.pone.0066264

Redaktør: William B. Coleman, University of North Carolina School of Medicine, USA

Modtaget: Januar 28, 2013; Accepteret: 3 maj 2013; Udgivet den 21. juni, 2013 |

Copyright: © 2013 Rajaram et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud CA124648 og RC2CA148532. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i human cancer er det generelt sådan, at meget tilbagevendende punktmutationer, såsom dem, der forekommer i

KRAS

eller

TP53

, bidrager til den selektive fordel af tumorceller. Men sagen er mindre klar med DNA kopital ændringer, hvor nogle hyppige ændringer såsom forstærkning af

ERBB2 /HER2

locus klart give en selektiv fordel, mens andre som de hyppige sletninger af DNA ved de telomere ender af kromosomer sandsynligvis ikke. Det betyder, at ændring frekvens alene ikke er tilstrækkelig til at afgøre, om en given DNA-kopi nummer ombygning direkte påvirker onkogenicitetsstudie. Ingen steder har det været sværere at drille ud end for kandidat tumorsuppressorgener beliggende inden fælles skrøbelige steder. Fælles skrøbelige steder findes i hele det humane genom og er tilbøjelige til DNA-brud, når cellen udsættes for delvis replikation stress [1], [2]. Cancerceller viser ofte hemizygote eller homozygote deletioner ved disse loci og derudover er der ofte udtryk ændringer af den underliggende genet [3]. Tumor suppressor funktioner er blevet fundet for nogle af disse gener, herunder

WWOX

,

FHIT

, og

PARK2

, og disse funktioner omfatter vækst undertrykkende effekter af at genoprette udtryk i mangelfuld cellelinier og tab-af-funktion-mutationer, der fører til en forbedring af carcinogen-induceret eller genetisk-manipuleret cancer hos mus [3], [4], [5]. Andre undersøgelser har gjort iagttagelser, der ikke understøtter en tumor suppressor rolle for disse gener, herunder den manglende evne til at påvise inaktivering punktmutationer [6], [7] og den hyppige svigt af deletioner at påvirke underliggende RNA eller protein ekspression [7], [ ,,,0],8], som begge er fælles træk ved andre tumorsuppressorgener.

Tidligere opdagede vi og valideret 26 onkogener ved funktionelt screening sæt af gener, der fokalt amplificeret i human cancer og tilsvarende har valideret 10 tumorsuppressorgener, som blev fundet i fokale sletninger påvirker leverkræft [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]. Vi begyndte denne undersøgelse med det mål at validere to tumorsuppressorgen kandidater, der var fokalt slettet ved høj frekvens især i kolorektal cancer,

A2BP1

MACROD2

. I modsætning til de resultater, der er opnået ved screening fokale sletninger i leverkræft, fandt vi ikke, at disse gener var tumorsuppressorer, som fik os til at tage et genom-dækkende kig på egenskaberne af fokalt slettede gener i et stort datasæt af DNA kopi nummer ændringer påvirker over 1000 kræft prøver. Dette førte til opdagelsen af ​​to klasser af fokale sletninger i human cancer, en, der ligner sletninger påvirker fælles skrøbelige steder, og den anden, der ligner sletninger påvirker

CDKN2A /B

. Siden da har et genom-dækkende undersøgelse af små homozygote deletioner i 270 menneskelige kræftceller blevet rapporteret, at også finder to klasser af fokale sletninger [16], og mens vores konklusioner er stort set magen til deres, er der nogle vigtige forskelle og nuancer om de to klasser og yderligere fund som er beskrevet nedenfor.

Resultater

Almindelige steder af Focal Sletninger i human Cancer

Vores datasæt blev genereret af vifte CGH-analyse af 850 primær tumorer og 304 cancercellelinier eller xenotransplantater af forskellige vævstyper, herunder hjerne, bryst, colon, lever, lunge, ovarie, pancreas, prostata, og hud (melanom) (tabel S1). Efter data normalisering og segmentering opdaget vi i alt 10,835 fokale sletninger ( 10 Mb) i disse 1.154 prøver (tabel S2). Den gennemsnitlige størrelse af deletioner, både fokal og store, er den korteste i telomerer som forventet (figur 1A, figur S1 i File S1) og derfor en væsentlig procentdel (13%) af fokale deletioner involverede telomere ender, især begge ender af X kromosom og p arm af kromosom 4 (tabel S3). Figur 1 viser fordelingen af ​​de øvrige 87% af fokale deletioner i hele genomet, binned i 2-MB intervaller. Der var fem loci, der viste fokale sletning frekvenser større end 5%, og de svarede til den

CDKN2A /B

,

FHIT

WWOX

loci, kendt eller mistænkt tumor suppressor gener, og

MACROD2

A2BP1

loci (figur 1B). Sletninger påvirker

A2BP1

(også kendt som

RBFOX1

) var meget hyppige i kolorektal cancer (21%), men betydeligt mindre hyppig eller fraværende i andre tumortyper (1-4% i æggestokkene, leveren og lungekræft og fraværende i brystet, melanom, prostata og pancreascancer). Tilsvarende sletninger påvirker

MACROD2

var mest hyppige i kolorektal cancer (17%), men betydeligt mindre hyppig eller fraværende i andre tumortyper (0,5-3% i bryst, lever og lungekræft og fraværende i æggestokkene, melanom, prostata, og pancreascancer). Hyppige sletninger påvirker

A2BP1

MACROD2

i tyktarmskræft er blevet observeret af andre [17], [18].

(A) Gennemsnitlig DNA-segment størrelse som en funktion af position på kromosom 1 vises. (B) de 9,401 fokale sletninger, der ikke var telomert blev arkiveret lodret i 2 Mb mellemrum og bruges til at generere en frekvens fordeling på tværs af genomet. Den hyppigst ramt genomisk interval svarede til den

CDKN2A /B

locus og de næste seks hyppigst ramt genomiske intervaller er angivet med røde pile og den relevante gen.

Undersøgelse af

A2BP1

MACROD2

som potentielle tumorsuppressorgener

Vi undersøgte effekten af ​​

A2BP1

MACROD2

sletninger på underliggende genekspression i coloncancere og normale colon væv. RNA ekspression af

A2BP1

kunne ikke påvises ved real-time RT-PCR i nogen af ​​de normale colon væv, tumorer eller cancer cellelinjer, vi undersøgte (figur 2A). For at hjælpe bekræfte dette negative resultat, vi designet tre ekstra prober til real-time RT-PCR og standard RT-PCR, men i hvert tilfælde ikke har kunnet påvise

A2BP1

i kolon prøver, trods i stand til let at opdage sin ekspression i hjernen (figur 2A). Disse resultater er i overensstemmelse med en tidligere rapport, udtryk for

A2BP1 /RBFOX1

, der koder for et alternativ splejsning faktor, er begrænset til hjertet, muskler og hjerne [19]. Selvom vi ikke kan udelukke meget lavt niveau, men fysiologisk relevant udtryk for

A2BP1

i kolon prøver, vi ikke observere nogen vækst undertrykkende eller tumor undertrykkende virkninger af at udtrykke

A2BP1

i kolon kræftceller huser deletioner (Figur 2B). Derudover, selv om

MACROD2

udtrykkes i colon cancerceller, deletioner havde ingen virkning på ekspression som målt ved kvantitativ RT-PCR ved anvendelse af fire forskellige prober, herunder tre inden for kodende sekvenser og en i den 3′-utranslaterede region. Heller ikke sletninger har nogen mærkbar virkning på ekspressionen af ​​MacroD2 protein (Figur 2C). Selv tilsyneladende paradoksalt, disse sletninger alle opstod inden introns fra

MACROD2

, og derfor ikke nødvendigvis kan forventes at påvirke udtryk.

(A) Threshold PCR-cykler for RT-PCR detektion af

ACTB

(kontrol) og

A2BP1

i to forskellige prøver af normalt hjernevæv, fire forskellige prøver af normal colon væv, og 19 tyktarmskræft cellelinjer. Værdier under 40 indikerer ingen signal detektion. (B) Effekten af ​​tvungen ektopisk udtryk for

A2BP1

på tumordannelse for tyktarmskræft cellelinje HCT-15, der huser en 250 kb sletning inden

A2BP1

. Påvisning af ekspression ved immunoblotting under anvendelse af et polyklonalt antistof, der genkender A2BP1 protein [38] er vist i indsatsen. Mangel på tumor undertrykkende virkninger blev også observeret for tyktarmskræft cellelinjer HCT-116 og SW480, både husly sletninger i

A2BP1

. (C) Udtrykket af

MACROD2

i tyktarmskræft cellelinjer, som bestemt ved TaqMan RT-PCR ved hjælp fire forskellige prober (tre til kodende sekvenser og én til en 3 ‘UTR, alle upåvirket af sletninger), sammenligning celle linjer, der huser sletninger i

MACROD2

gen til dem, der ikke gør. Relativ ekspression blev beregnet af ΔC

metode T hjælp

GADPH

ekspressionsniveauerne som reference. (D) Udtrykket af

MACROD2

i tyktarmskræft cellelinjer som bestemt ved immunoblotting anvendelse af et antistof til MacroD2.

Mønstre af Sletninger påvirker

A2BP1, MACROD2, CDKN2A /B

, og

PTEN

Vi bemærkede adskillige forskelle i typer og mønstre af sletninger påvirker

A2BP1

MACROD2

loci i forhold til fokale sletninger påvirker

CDKN2A /B

og

PTEN

loci (figur 3). Ved at undersøge alle fokale sletninger ( 10 Mb), der strakte sig en fire Mb locus centreret på målgenet, fandt vi, at sletninger påvirker

A2BP1

MACROD2

loci i gennemsnit mindre ( 0,6 Mb vs. 1,6 Mb, p = 1.5E-04). Derudover sletninger påvirker

A2BP1

MACROD2

loci var mere adskilt og flertallet ikke konvergerer på et enkelt fælles site af overlap i modsætning til

CDKN2A /B

og

PTEN

loci (figur 3). Vi målte i hvilken grad hver sletning var adskilt (ikke-overlappende) fra andre sletninger ( “Sletning Separation”, se materialer og metoder) og fandt, at der var en betydelig forskel mellem det

A2BP1

MACROD2

loci og

CDKN2A /B

og

PTEN

loci (0,4 vs. 0,16, p = 0,03).

Hver af de fire paneler viser (top ) et ideogram af kromosomet, hvorpå featured genet er lokaliseret og (nedenfor) et ekspanderet billede af en 4-Mb region centreret på featured gen, der viser andre gener i området (placering baseret på UCSC Genome Browser). Hvis genet er stor nok, er det exon-intron struktur og /eller transkriptionel retning af genet angivet. For de fleste gener, især i paneler C og D, er generne vist som rektangler på grund af deres mindre størrelse. Nedenfor hver udvidede region er vandrette bjælker angiver omfanget og grænserne for de enkelte deletioner i kolon tumorer (Paneler A og B;

A2BP1

MACROD2

henholdsvis), lunge tumorer (Panel C;

CDKN2A /B

), eller flere tumortyper (Panel D

PTEN

). De fremhævede gener i paneler C og D er markeret med grønt.

Vi ønskede derefter at afgøre, om disse to sondringer mellem sletninger påvirker

A2BP1

MACROD2

loci på den ene side og

CDKN2A /B

og

PTEN

loci på den anden side holdt rigtigt, når man sammenligner sletninger påvirker kendte fælles skrøbelige steder og recessive tumorsuppressorgener fra Cancer Gene Census [20] , [21]. I vores datasæt, var der 11 almindelige skrøbelige steder og 24 recessive tumor suppressor gener, der indeholdt en tilstrækkelig stikprøve af sletninger ( 14) for denne statistiske analyse (tabel S4). Svarende til, hvad vi tidligere nævnt i denne større sæt loci den gennemsnitlige sletning størrelse påvirker fælles skrøbelige steder var væsentligt mindre end dem, der påvirker recessive tumorsuppressorer (0,6 Mb vs. 3,3 Mb, p = 9e-06, figur 4A). Ligeledes “sletning Separation” metric var signifikant større i offentlige skrøbelige steder end den var i recessive tumorsuppressorgener (figur 4B). Sidstnævnte resultat antyder, at deletioner påvirker disse to grupper opstå ved forskellige mekanismer. Deletioner i fælles skrøbelige stedet gener kan induceres ved replikativ stress og efterfølgende DNA-skader og reparere [22], deletioner påvirker

CDKN2A /B

er blevet foreslået at skyldes afvigende rekombination eller DNA reparation ved ikke-homolog endesammenbinding [ ,,,0],23]. Til støtte for den tanke, at disse to typer af sletninger opstå af separate mekanismer, fandt vi, at hyppigheden af ​​samtidig forekomst af deletioner i forskellige fælles skrøbelig websted gener og samtidig forekomst af deletioner i forskellige tumorsuppressorgener var større end for co -deletion af CFS og tumorsuppressorgener (figur 4C).

(a) Box og knurhår grunde til “Sletning size”, som måler den gennemsnitlige størrelse af sletninger inden for en 2-Mb vinduet centreret på genet, fælles skrøbelige websted gener (orange) og tumorsuppressorgener (blå) (B) Box og knurhår grunde til “Sletning separation”, som måler adskillelsen (ikke-overlappende) af sletninger inden for en 2-Mb vinduet centreret på genet, ( C) den co-sletning tendens fælles skrøbelige websted gener (orange) og tumorsuppressorgener (blå) i forhold til co-sletning af gener fra forskellige klasser (grå).

Yderligere egenskaber, som adskiller sletninger påvirker fælles skrøbelige steder i

​​Vi næste ønskede at afgøre, om den manglende evne af sletninger til at påvirke ekspressionen af ​​

MACROD2

var en mere generaliseres observation, der kunne bruges til at skelne almindelige skrøbelige sted-lignende gener fra tumorsuppressorgener. Vi bestemt korrelationen af ​​RNA-ekspression og DNA-kopi nummer for 115 cancer prøver, hvor vi havde både genekspression profilering og ROMA aCGH data. Sammenlignet med korrelationerne tumor suppressor gruppe, der var meget lidt virkning af DNA kopital på genekspression i den fælles skrøbelige websted (p = .003, figur 5A), hvilket indikerer, at denne funktion kan være nyttig til at forudsige, hvorvidt en given lokalitet af sletninger var CFS-lignende. Vi undersøgte derefter, om den gennemsnitlige DNA kopital værdien var signifikant forskellig, hvilket afspejler hvilken grad deletioner var homozygote versus heterozygot. Selv om der ikke var en statistisk signifikant forskel mellem de gennemsnitlige DNA-kopi talværdier (p = 0,09), var der tilsyneladende større vifte af lavere værdier for tumor suppressor gruppen, hvilket indikerer, at nogle af disse gener har mere homozygote deletioner end at gøre fælles skrøbelige websted gener (figur 5B).

Scatter dot plots af værdier for statistikker, der adskiller fokale sletninger påvirker fælles skrøbelig websted (CFS) gener (orange) fra tumorsuppressorgener (blå). (A) “RNA /DNA-Korrelation”, som svarer til Pearsons korrelationskoefficient på log2-transformerede DNA kopital værdier og relative RNA-ekspression værdier for de 115 tumorprøver med både matrix CGH og RNA ekspressionsprofil data, (B) DNA-kopi Nummer er medianværdien af ​​segmenteret DNA kopi talværdier. (C) cellelinie Andel “, som giver et relativt mål for, hvor ofte deletioner for et givet gen findes i cellelinier end af primære tumorer. Paneler (D) og (E) viser antallet af sletninger, der findes i hvert gen inden for en 10 Mb region centreret på

MACROD2

locus (D) og TP53 og

MAP2K4

loci (E) . (F) Box og knurhår afbildninger af “Sletning Isolation”, som måler hvor ofte tilstødende gener slettes i forhold til den featured gen.

Vi fandt også, at sletninger påvirker fælles skrøbelige steder var mere almindelige i kræft cellelinjer end i primære tumorer sammenlignet med sletninger påvirker tumorsuppressorer (p = 7e-05, figur 5C). Dette er især tydeligt i brystkræft, hvor

MACROD2

FHIT

slettes i 28% og 15% af brystkræft cellelinier, henholdsvis, men enten slet ikke (

FHIT

) eller kun i én ud af 255 primære tumorer (

MACROD2

) (tabel S5).

FHIT

blev co-slettet med

MACROD2

i 75% af de cellelinjer med

FHIT

sletning, hvilket indikerer, at der for visse brystcancercellelinjer, replikativ stress efterfulgt af DNA brud og reparation kan forekomme under tilpasning til celledyrkning og påvirke flere fælles skrøbelige websted gener.

ved at se på genom koordinere plots af fokale sletning frekvenser, vi bemærkede, at de hyppige sletninger påvirker

MACROD2

var relativt isoleret langs genomet og at hyppigheden tæller faldt brat til generne straks til venstre og højre for

MACROD2

(figur 5D). Det var meget forskellig fra genomet kvarter fokale sletninger påvirker tumorsuppressorgener

TP53

MAP2K4

, som både dannede toppe af sletning tæller, men mindre dramatisk i forbindelse med genomiske regioner med højere samlet sats for sletninger (figur 5E). Vi ønskede at undersøge, om denne skelnen var en generaliseres funktion, der adskiller fælles skrøbelige websted gener fra tumorsuppressorgener, og udviklet en metrisk “sletning Isolation”, der målte hvor meget sletning hyppigheden af ​​et givent gen var større end de omkringliggende gener. Denne metrik var betydeligt højere i fælles websted skrøbelige gener end tumorsuppressorgener ( 40-fold, p = 0,00001). (Figur 5F)

Computational Analyse og klassifikation af Focal deletioner

Vi ønskede at bruge disse seks egenskaber til at analysere sletninger på en genom-plan. Vi begrænsede vores opmærksomhed til gener med tilstrækkelige sletninger for at opnå statistisk meningsfulde resultater ( 14 sletninger, 4.823 gener). Vi udforskes først, om nogen af ​​de seks egenskaber var overflødige ved at bestemme, om de var stærkt korreleret med nogen af ​​de andre fem. Selvom sletning størrelse moderat var korreleret med sletning separation (r = 0,39), alle de andre parvise korrelationer var ubetydelig (fra -0,13 til 0,18), og vi fortsatte med at omfatte alle seks boliger til uovervåget analyse. Vi derefter forvandlede de seks egenskaber ved hjælp principal komponent analyse og plottet de 4.823 gener ved hjælp af de første tre hovedkomponenter. Den resulterende graf viste, at hovedparten af ​​gener var mest ligner recessive tumorsuppressorgener (figur 6A). Med en enkelt undtagelse, var fælles skrøbelige websted gener godt adskilt fra den største gruppe og svarede til kun et lille antal yderligere gener (figur 6A). Dette resultat indikerede, at de fleste gener, der er målrettet ved fokale deletioner ligner tumorsuppressorgener, mens væsentlig færre gener ligner almindelige skrøbelige stedet gener. For at teste denne idé uafhængigt, brugte vi overvågede læringsmetoder (støtte vektor maskine og tilfældig skov [RF]) til at klassificere de 4.823 gener i CFS-lignende eller tumor suppressor kategorier. Resultaterne af disse to metoder blev signifikant korreleret (r = 0,72), og begge er klassificeret fleste gener som tumorsuppressor lignende, efter aftale med den ukontrollerede analyse (figur 5B). De tre variabler, der var vigtigst i RF klassifikation var sletning størrelse, sletning adskillelse, og sletning isolation (tabel S6). Brug kun disse tre variabler, genereret vi en ny RF klassificeringen der givet resultater, der var 99% identisk med den oprindelige klassificeringen, om oprettelse af disse tre egenskaber som de mest kritiske determinanter om, hvorvidt et givet mønster af fokale sletninger er CFS-lignende eller tumor suppressor -lignende.

Gener, der havde 15 eller flere fokale sletninger (4.823) blev analyseret af uovervåget indlæring metode Principal Component Analysis (PCA) og klassificeret af to overvågede læringsmetoder, Support Vector Machine (SVM) og Random Forest (RF). (A) Graf over de 4,826 gener baseret på deres værdier for de første tre hovedkomponenter afledt af de syv deletion egenskaber, som adskiller fælles skrøbelige stedet gener fra tumorsuppressorgener. Kendte fælles skrøbelige websted gener er vist med blåt, er kendt tumorsuppressorer vist i rødt, og alle andre er vist med grønt. De fleste kendte tumorsuppressorer er begravet i den store gruppe af gener, mens de kendte fælles skrøbelige websted gener, med en enkelt undtagelse (

Store |), er klart adskilt fra den store gruppe af gener ved deres første og anden hovedkomponent værdier. Der er kun en håndfuld af andre gener, der er placeret i nærheden af ​​de kendte fælles skrøbelige websted gener. (B) Grafisk fremstilling af klassificeringen af ​​de 4.826 gener baseret på deres sandsynlighed for at være fælles skrøbelige websted gener ved Random Forest (

y

aksen) eller Support Vector Machine (

x

-aksen ) klassificører. Begge klassificører blev uddannet på de 35 kendte CFS gener eller tumor undertrykkere (Tabel S4). Sandsynligheden for at være en tumor suppressor er én minus CFS sandsynlighed. De fleste gener er grupperet sammen i nederste venstre kvadrant; derfor begge klassificører forudsige med stor sandsynlighed, at de fleste af disse gener er tumorsuppressorer.

Validering af

MACROD2

som en fælles Fragile site Gene

For at teste, om vores klassificering held kunne forudsige nye fælles skrøbelige websted gen gener, vi undersøgte, om induktion af replikativ stress i en coloncancercellelinie kan generere deletioner i

MACROD2

eller

A2BP1

, der sammen med den kendt fælles skrøbelig websted gen-gen

FHIT,

er de tre gener hyppigst ramt af fokale deletioner i tyktarmskræft. Vi designede en brugerdefineret tiling array til disse tre gener og derefter udført aCGH, at sammenligne den oprindelige cellelinje-DNA til DNA fra otte forskellige kloner isoleret efter kort induktion af replikativ stress. Fire ud af otte kloner viste sletninger inden

MACROD2

, og to ud af otte kloner viste sletninger inden

FHIT

(figur 7). Dette fastslår, at

MACROD2

, der ikke tidligere vist at være en fælles skrøbelig websted gen i lymfocytter, er faktisk en fælles skrøbelig websted genet ved analyse i en coloncancer cellelinie. Det faktum, at

MACROD2

blev let påvises som en fælles skrøbelig websted gen i tyktarmskræft celler, men ikke i lymfocytter er i overensstemmelse med tidligere beviser for, at forskellige celletyper viser forskellige profiler af fælles skrøbelige steder [24].

(a) en skematisk af eksperimentet, der anvendte en brugerdefineret flisebelægning matrix for at bestemme om aphidicolin induktion af replikativ stress kunne generere fokale deletioner på tre loci (

A2BP1

,

MACROD2

, og

FHIT

) i colon epitelial kræftceller. Ingen sletninger påvirker

A2BP1

blev observeret i de 8 undersøgte kloner; 4 ud af 8 kloner havde sletninger påvirker

MACROD2

; og 2 kloner havde sletninger påvirker

FHIT

. (B) Et eksempel på en induceret omdrejningspunkt sletning påvirker

MACROD2

locus.

x

aksen repræsenterer en ca. 1-Mb regionen spænder

MACROD2

. De blå linier repræsenterer de normaliserede DNA kopi talværdier, og de orange linier repræsenterer de segmenterede DNA kopi talværdier. (C) Et eksempel på en induceret fokal sletning påvirker

FHIT

. (D) Et eksempel på en upåvirket locus (HLA locus på kromosom 6p).

Forskellige tumortyper har forskellige frekvenser og Spectrums af deletioner i CFS-lignende gener

Interessant, fandt vi, at kolon tumorer var langt den hyppigst ramt af fokale deletioner i CFS-lignende gener, med sletning frekvenser så høje som 21% for

A2BP1

, 17% for

MACROD2

, 9 % for

FHIT

og 9% for

PARK2

(figur 8A). Ingen af ​​de andre ni tumortyper blev så hyppigt påvirket. Lungekræft var den næste mest påvirket, men mærkeligt nok havde en anden spektrum af frekvenser, med

LRP1B

er den hyppigst slettede CFS-lignende gen ved 4% (figur 8A). Flere kræftformer synes ikke at være påvirket overhovedet, herunder glioblastomas, CLL, og prostatacancer, og mange havde meget lav frekvens af deletioner af CFS-lignende gener, herunder brystcancer, som viste

PARK2

som sin mest ofte slettet CFS-lignende gen på lige over 2% (figur 8A).

(A) hyppighed, hvormed den angivne fælles skrøbelige websted eller CFS-lignende gen slettes i forskellige primære tumorer. (B) Den hyppighed, hvormed den angivne fælles skrøbelige websted eller CFS-lignende gen slettes i cancer cellelinjer.

Hyppigheden og spektrum af sletninger i CFS-lignende gener var anderledes for alle tumortyper når man sammenligner cellelinjer til primære tumorer (Figur 8B). I Tyktarmskræft cellelinjer, sletninger påvirket

FHIT

i mere end 60% af de cellelinjer sammenlignet med 9% af primære tumorer. I brystcancercellelinier,

FHIT

blev slettet i 10% af prøverne, men slet ikke i primære tumorer (Figur 8B). Det synes muligt, at dette kan afspejle plasticitet af genomet ved

FRA3B

(

FHIT

skrøbelige site) under dyrkningsbetingelser, og det samme kan være tilfældet for den øgede forekomst af sletninger i andre CFS-lignende gener, når man sammenligner cellelinjer til primære tumorer.

Den hyppigst Slettede skrøbelige site-lignende gener og tumorsuppressor-lignende gener

evnen til at forudsige nye tumorsuppressorer er mere relevant at cancerbiologi end evnen til at forudsige nye skrøbelige stedet gener. Vi ræsonnerede, at disse tumor suppressor-lignende gener hyppigst ramt af fokale sletninger ville være blandt de stærkeste kandidater (tabel 1). Interessant, fokale deletioner i kun to af de ti bedste gener er blevet beskrevet tidligere (

CDKN2A /B

og

MAP2K4

[25]). Af de øvrige otte gener, den ene er en tumorsuppressor, som vides at blive inaktiveret af andre genetiske mekanismer [26] (

MEN1

), og fire er kandidat tumorsuppressorer baseret enten mutationsanalyse (

CSMD1

[27]), funktionel analyse (

CDKN2AIP /CARF

[28],

MAD1L1

[29]), eller cancer-specifik promoter hypermethylering (

RRAD

[30]). På den anden side, to gener for nylig foreslået at være tumorsuppressorer baseret på deres kontaktpunkt sletning i kræft,

PDE4D

[31] og

LRP1B

[32], er blandt de ti hyppigst berørte CFS-lignende gener og følgelig ikke kan være funktionelle tumorsuppressorer (tabel 1)

diskussion

Vi indledte denne undersøgelse for at forene to forskellige resultater:. fraværet af tumor suppressor kandidater fra to loci ofte ramt af fokale deletioner og evne fokale deletioner at berige for tumorsuppressorer i en funktionel screening. Gennem beregningsmæssige og statistisk analyse af fokale sletninger til stede i mere end 1000 prøver kræft, vi definerede to forskellige klasser af deletioner i kræft, der løser denne uoverensstemmelse: en klasse, der repræsenterer gener ligner almindelige skrøbelige webstedet gener, og en anden, der er tumor suppressor-lignende . Disse to typer af sletninger kan forventes at opstå fra forskellige mekanismer, baseret på deres forskellige sletning størrelser og deres tendens til at co-forekomme. Den ene klasse af sletninger, når meget tilbagevendende, overlapper et fælles websted og væsentligt påvirker ekspressionen af ​​de underliggende gener, hvilket indikerer, at gentagelse er drevet af selektiv fordel til udviklingen tumorceller. I modsætning hertil deletioner i fælles skrøbelige sted-lignende gener ikke overlappe et fælles websted heller ikke få væsentlig indvirkning på underliggende genekspression, som alle er i overensstemmelse med deres gentagelse drives af den iboende ustabilitet i det genomiske locus snarere end ved selektiv fordel.

Vores resultater etablerer, at de fleste fokale deletioner tilhører klassen, der repræsenterer tumor suppressor-lignende gener og ikke almindelige skrøbelige stedet gener. Det er den eneste uenighed, vi har med en nylig undersøgelse, der tyder på, at de fleste fokale deletioner i kræft er skrøbelige-lignende delvist baseret på delvist på deres tilbøjelighed til at være heterozygot snarere end homozygot [16]. Men vi mener, at denne egenskab ikke er anvendelig som en sorterer fordi flere tumorsuppressorer, herunder

TP53

CDH1

, påvirkes af fokale heterozygote sletninger. Det kan være mange haploinsufficient tumorsuppressorer, såsom

p27KIP1

[33], er fortsat at blive opdaget, og beregningsværktøjer, der diskonterer disse ville være forkert. I nogle tilfælde kan homozygot sletning af en tumor suppressor være dødelig, hvilket kunne være tilfældet for spindlen samling checkpoint genet

MAD1L1

som vi fandt her at være meget ofte påvirket af heterozygote fokale sletninger. Selvom

MAD1L1

er endnu ikke i COSMIC database over tumorsuppressorer, heterozygot sletning af

MAD1L1

har vist sig at øge forekomsten af ​​tumorer forårsaget af delvis tab af

TP53