PLoS ONE: CCL5 Neutralisering Begrænser Cancer Vækst og forstærker Målretning af PDGFRβ i kolorektal karcinom

Abstrakt

Øget CCL5 niveauer er markører for en ugunstig resultat hos patienter med melanom, bryst-, livmoderhals-, prostata, mave eller kræft i bugspytkirtlen. Her har vi vurderet den rolle, som CCL5 /CCR5 interaktioner spiller i udviklingen af ​​tyktarmskræft. For at gøre dette, har vi undersøgt en række kolorektal karcinom humane kliniske prøver og fundet CCL5 og dets receptorer over-udtrykte inden primære såvel som lever og pulmonale metastaser af patienter sammenlignet med raske væv. In vitro CCL5 øget vækst og vandrende reaktioner af tyktarmskræft celler fra både mennesker og mus oprindelse. Desuden systemisk behandling af mus med CCL5-directed antistoffer reducerede omfanget af udviklingen af ​​subkutane colontumorer, af levermetastaser og peritoneale carcinose. Konsekvent, fandt vi øget antal af CD45-immunreaktive celler i stroma af de resterende læsioner samt ved grænsefladen med det sunde væv. I modsætning hertil selektiv målretning af CCR5 gennem administration af TAK-779, en CCR5-antagonist, kun delvist kompromitteret tyktarmskræft progression. Desuden CCL5 neutralisering gjorde tumorerne mere følsomme over for en PDGFRβ-rettet strategi i mus, denne kombination regime giver den største beskyttelse mod levermetastaser og undertrykke makroskopisk peritoneal carcinose. Kollektivt, vores data viser inddragelsen af ​​CCL5 i patogenesen af ​​kolorektal karcinom og peger på sin potentielle værdi som terapeutisk target

Henvisning:. Cambien B, Richard-Fiardo P, Karimdjee BF, Martini V, Ferrua B , Pitard B, et al. (2011) CCL5 Neutraliseringsmetoder Begrænser Cancer Vækst og forstærker Målretning af PDGFRβ i kolorektal karcinom. PLoS ONE 6 (12): e28842. doi: 10,1371 /journal.pone.0028842

Redaktør: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, USA

Modtaget: Juni 7, 2011; Accepteret: November 16, 2011; Udgivet: December 20, 2011

Copyright: © 2011 Cambien et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale og af foreningen pour la Recherche sur le Cancer (Grant 3707). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Bruno Pitard ejer lager i In-Cell-Art Co, der udvikler 704 til vaccine applikationer. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Tumor-stroma interaktioner anerkendt som kritiske komponenter i tumor invasion og metastatisk potentiale kolon carcinom [1]. Stromale, inflammatoriske og kræftceller kommunikerer indbyrdes direkte via celle kontakt, men også indirekte gennem parakrine signaler [2], [3]. Sådanne signaler favorisere tumor udvikling på flere måder: de fungerer som vækstfaktorer, stimulere angiogenese, modulere den ekstracellulære matrix, inducere rekruttering af yderligere stromale celler og deltage i immun unddragelse mekanismer i kræft. Som følge heraf er identifikation af tumor-fremmende faktorer for kræftbehandling blevet af stor interesse at udtænke anti-tumor strategier, der skal påføres enten som monoterapi behandling eller som kombinationsbehandling i tilfælde, hvor tumorer ikke responderer på monoterapi. Forskellige faktorer er blevet identificeret, idet promotorer af tyktarmskræft progression, mest almindelige af disse er VEGF (vaskulær endotel vækstfaktor) familie, FGF (fibroblastvækstfaktor) familien og PDGF (blodpladeafledt vækstfaktor) familie, deres produktion i neoplasme korrelerer med tumorklassificering og kortere patientoverlevelse [4] – [8]. På det seneste har der været stigende beviser fra forskellige undersøgelser, herunder vores, de kemokiner produceret i tumor mikromiljø også kan spille en afgørende rolle i patogenesen af ​​CRC (kolorektal carcinom) [9] – [12].

Blandt de kemokiner menes at kraftigt fremme carcinogenese og stromagenesis er CCL5 /RANTES (CC kemokinligand 5 /Reguleret ved aktivering, normal T-celle-udtrykkes og udskilles), som oprindeligt blev beskrevet for sin centrale rolle i inflammatoriske sygdomme. Faktisk har kliniske beviser vist, at forhøjede niveauer af væv eller plasma CCL5 er markører for en ugunstig resultat hos patienter med enten melanom, bryst-, livmoderhals-, prostata, mave eller pancreascancer [13] – [20]. I brystkræft,

in vivo

CCL5 neutralisering eller CCR5 antagonisme blev vist at ophæve MSC-induceret metastase af kræftceller og dermed implicerer CCL5 /CCR5 som en vigtig akse i denne malignitet [21]. Selektiv målretning af CCR5 /CCL5 signalering også ført til reducerede tumorvækst i eksperimentel pancreas adenocarcinom gennem afbrydelse af CCR5-afhængige rekruttering af regulatoriske T-celler i tumorer [22]. Anibamine, en ny CCR5 antagonist undertrykkes også invasive og metastatiske egenskaber af prostatacancerceller hos mus [23]. Endelig CCL5 blokade betydeligt kompromitteret mavekræft progression [20]. Interessant nok har CCL5 nylig blevet rapporteret at blive udtrykt i colorektal carcinom, overvejende ved invasive foran primære tumorer [24]. Baseret på ovennævnte kliniske observationer i flere kræftformer, er det fristende at spekulere, at CCL5 og dens receptorer kan have en væsentlig rolle i CRC progression og kan således repræsentere et interessant mål for behandlingen af ​​denne malignitet. Til dato, men ingen af ​​disse aspekter er blevet behandlet

in vivo

.

Undersøgelsen er beskrevet heri netop til formål at få ny indsigt i den rolle, som CCL5 /CCR5 interaktioner spiller i udviklingen af colorektal carcinom. For at gøre dette, har vi undersøgt en række tyktarmskræft humane kliniske prøver og fundet CCL5 og dets receptorer over-udtrykte inden primære såvel som lever og pulmonale metastaser af CRC patienter sammenlignet med raske væv. For at vurdere relevansen af ​​CCL5 /CCR5 neutralisering i colon karcinom, har vi brugt syngene forsøgsmodeller af ortotopisk (lever) og ektopisk (underhud) tyktarmskræft hos immunkompetente mus. Vi har undersøgt effekten af ​​CCL5- eller CCR5-blokkere administreres som enkelte midler eller i kombination med et murint PDGFRβ-rettet behandling, denne strategi er i øjeblikket under klinisk evaluering til behandlingen af ​​CRC cancere. Denne rapport giver den første prækliniske beviser for en rolle CCL5 i colon carcinom og viser, at CCL5 blokade har potentiale til at reducere tyktarmskræft progression og forbedre den terapeutiske respons i multidrug regime.

Materialer og metoder

reagens

følgende reagens (TAK-779) blev opnået gennem NIH aIDS Research og reference Reagent Program, Division of aIDS, National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme, NIH.

tumorcellelinjer og i forsøgsdyr

Humant HT29 og muse CT26 coloncarcinomceller blev indkøbt fra ATCC og opretholdt i DMEM-medium suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS som tidligere beskrevet [11]. Kvinde SCID og BALB /c-mus, 6 til 8 uger gamle, blev erhvervet fra Harlan (Gannat, Frankrig).

Ethics

ti sæt af primære coloncancer tumorer og metastatiske væv fra den samme patienter samt parrede “sunde” colon biopsier blev indsamlet fra patienter med invasive adenocarcinomer, som gennemgik kirurgisk biopsier eller indledende kirurgi ved Institut Paoli-Calmettes (IPC, Marseille, Frankrig) mellem 1987 og 2007. Hver patient gav skriftligt informeret samtykke og undersøgelsen blev godkendt af IPC “Comité d’Orientation stratégique”. Alle de procedurer, der involverer forsøgsdyr og deres pleje blev godkendt af institutionel Review Board (Permit nummer # A06-088-14).

TaqMan real-time PCR eksperimenter

Total RNA fra human colorectal cancer og sund kolon, fra mus sunde og tumorvæv samt coloncarcinom cellelinier blev ekstraheret ved anvendelse RNeasy kit (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrig) og transkriberes til cDNA under anvendelse af Superscript III enzym (Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrig) som tidligere beskrevet [11]. Real-time PCR blev udført i en ABI PRISM 7900HT og udføres ved hjælp TaqMan® genekspression assays til humane prøver (hCCR1: Hs 00174298m1, hCCR3: Hs 00356601m1, hCCR5 Hs 00152917m1, hCCL5: Hs 00174575m1) (Applied Biosystem, Courtaboeuf, Frankrig ), eller SYBR® genekspression assays ifølge producentens instruktioner (Applied Biosystem). Primersekvenserne for muse CCL5 var: fremadrettet, 5′-TGCCCACGTCAAGGAGTATTTC-3 ‘; og omvendt, 5’AACCCACTTCTTCTCTGGGTTG-3 ‘, for mus CCR1: fremad, 5’AGGCCCAGTGGGAGTTCAC-3’; og omvendt, 5’TCTTCCACTGCTTCAGGCTCTT-3 ‘, for mus CCR3: fremad, 5’AAGCTTTGAGACCACACCCTATG-3’; og omvendt, 5’GACCCCAGCTCTTTGATTCTGA-3 ‘; for mus CCR5, frem 5’TTATCTCTCAGTGTTCTTCCGAAAAC-3 ‘og omvendt, 5’TTCTCCTGTGGATCGGGTATAGA-3’. Relative niveauer i mRNA-ekspression blev bestemt ved anvendelse ΔC

T værdier opnået ved at subtrahere C

T kontrol (human eller muse actin) fra C

T målgen målt på samme RNA-præparat. Sammenlignende niveau af mRNA-ekspression mellem sunde (

X

) og metastatiske væv (

Y

) blev beregnet ved hjælp af formlen Δ

C

T

Y

–

ΔC

T

X

og udtrykt som gange over sunde (2ΔΔ

C

T). Murint sundt kolon væv blev anvendt til at analysere musetumorer og menneskelige sunde kolon prøver blev anvendt til at analysere humane tumorer og HT-29 prøver.

In vitro

proliferation assay

Kort , colon cancerceller forbehandlet eller ikke med TAK-779 eller anti-CCL5 antistoffer (ved de angivne koncentrationer) blev podet ved en densitet på 10

4 celler /cm

2 og inkuberet enten i serum-beriget medium eller i basismedie (indeholdende 0,1% bovint serumalbumin) suppleret eller ikke med forskellige koncentrationer af rekombinant CCL5 (Peprotech, Neuilly-sur-Seine, Frankrig) i 5 dage, før de trypsin tilbygget, indsamlet og optalt som beskrevet tidligere [11].

In vitro

kemotaksiassay

Kemotaktiske svar på tyktarmskræft celler blev evalueret ved hjælp af 24-kemotaksisplader kamre og polyethylenterephthalat indsætter med 8 um porer (Becton Dickinson, San Jose, Californien ) belagt med 6,5 mg /ml fibronectin (Sigma, Lyon, Frankrig), eller med 50 ug /ml kollagen (Becton Dickinson) for CT26 celler eller HT29-celler, henholdsvis [11]. Colon cancerceller, forbehandlet eller ikke med TAK-779 eller anti-CCL5 antistoffer (ved de angivne koncentrationer), blev anbragt i den øvre brønd (5 x 10

4-celler) og forskellige koncentrationer af rekombinant CCL5 (Peprotech) blev tilsat til de nedre brønde. Efter inkubering af pladerne i 18 timer (CT26 celler) eller i 40 timer (HT29 celler) ved 37 ° C i 5% CO

2 atmosfære, ikke-migrerede celler blev fjernet fra den øvre brønd, og migrerede celler opsamlet på undersiden af ​​indsatsen blev farvet under anvendelse af krystalviolet farvestof og optalt. Migration indeks blev beregnet som forholdet mellem antallet af migrerede celler i kemotiltrækkende-holdige brønde divideret med antallet af celler, som migrerede at basere medium alene.

PDGFRβ genekspressionsvektor

DNA, der koder mPDGFRβ blev klonet og indsat i pTOPO-cDNA3 eukaryot ekspressionsvektor (Invitrogen). Identiteter af forstand (pcDNA3-PDGFRβ) og antisense (kontrol vektor) produkter blev bekræftet ved sekventering.

Plasmid forberedelse og formulering

DNA-vaccine plasmid (pcDNA3-PDGFRβ) og den tilsvarende kontrol vektor blev anvendt som antigener. Alle plasmider blev oprenset ved anvendelse af EndoFree-plasmid oprensningssøjler (Qiagen) og blev bekræftet at være fri for endotoksin kontaminering (endotoxin 0,1 EU /ug plasmid-DNA) ved Limulus amoebocyt lysat-assay (Lonza, Le Perray en Yvelines, Frankrig). Den tetrafunctionalized amfifil blokcopolymer 704 (MW 5.500) blev leveret af In-Cell-Art (Nantes, Frankrig). Stamopløsninger blev fremstillet ved 20% (vægt /vol) i vand og opbevaret ved 4 ° C. Formuleringer af DNA med 704 (slutkoncentration 0,3%) blev fremstillet umiddelbart før intramuskulær injektion ved equivolumetric blanding af copolymerer i vand med plasmid-DNA-opløsning som tidligere beskrevet [25], [26]. DNA doser administreret, er angivet under hele undersøgelsen.

Transfektion med PDGFRβ genekspressionsvektor

Den korrekte ekspression af mPDGFRβ blev verificeret ved transient transfektion af CHO-celler med kontrol vektor og DNA-vaccinen plasmid ( pcDNA3-PDGFRβ) under anvendelse Amaxa Biosystems (Lonza). Fireogtyve timer efter transfektion cellelysater fra CHO-celler blev fremstillet som tidligere beskrevet [27], inden de underkastes SDS-PAGE. Western blotting blev udført enten med gede-anti-muse PDGFRβ antistoffer (Santa Cruz Biotechnology, Le Perray-en-Yvelines, Frankrig) eller med fortyndet serum opnået fra PDGFRβ-vaccinated- mus. Detektion blev udført enten ved kanin-anti-ged taske i slagfast ABS eller af gede-anti mus taske i slagfast ABS konjugeret til peberrodsperoxidase (Dako, Trappes, Frankrig). Bånd blev visualiseret ved chemiluminescens-forstærket reaktion (Amersham, Les Ulis, Frankrig).

musemodeller

subkutan, lever og lunge metastase-modeller.

For induktion af subkutan og hepatiske tumorer, CT26-celler (5 x 10

4) eller HT29-celler (3 x 10

6) injiceret i flanken eller under leveren kapsel BALB /c eller SCID-mus, henholdsvis. Til induktion af lungemetastaser, CT26-celler (3 x 10

4) eller HT29-celler (2 x 10

6) blev leveret ved intravenøs injektion i halen BALB /c eller SCID-mus, henholdsvis. Ved aflivning blev komplet obduktioner udføres. Subkutan og hepatiske tumorer blev fjernet, vejet og målt med skydelærer i de to vinkelrette akser (

en

b

). Tumor volumen blev beregnet efter formlen

ab

2π /6.

Intramuskulær DNA-vaccination.

Efter en profylaktisk indstilling, blev bedøvet mus vaccineret 3 gange på 3 ugers interval (dag 0, 21 og 42) ved intramuskulære injektioner af DNA-polymerformuleringer ind i både

tibialis anterior Salg muskler som tidligere beskrevet [25], [26]. Tre uger efter den sidste boost (dag 66), blev mus udfordret af injektion af 5 x 10

4 CT26 murine coloncarcinomaceller under leveren kapsel.

Mus behandlinger.

Anti -CCL5 eller kontrol isotype IgG antistoffer (32 ug pr mus, Peprotech) blev injiceret i peritoneum af BALB /c-mus 72 timer efter tumorimplantation og to gange om ugen for varigheden af ​​forsøgene (fra dag 69 til 87). TAK-779, små-molekyle CC chemokinreceptor 5 (CCR5) inhibitor [28], [29] blev injiceret i mus (150 ug /mus) 72 timer efter tumorceller inokulering og derefter dagligt indtil aflivning (fra dag 69 til 87 ).

Ved aflivning (dag 87), hepatiske tumorer blev udskåret og vejet. Forekomsten af ​​peritoneal carcinose i mus blev udtrykt som procent af carcinose-bærende dyr i hver gruppe.

Bestemmelse af serumniveauer af mPDGFRβ Ab’er ved ELISA

Serum opsamlet ved retro-orbital blødninger på forskellige tidspunkter efter vaccination fra immuniserede mus. ELISA-plader blev overtrukket med 2 ug /ml anti-muse PDGFRβ antistoffer (Santa Cruz) i 100 pi PBS natten over ved 4 ° C. Den næste morgen blev pladerne vasket to gange med PBS /Tween 20 (PBST), mættet i 30 minutter med phosphatbuffer indeholdende 1% skummetmælk og 0,12% Triton X-100 (assaypuffer), vasket igen to gange, inden de blev inkuberet i 18 h ved stuetemperatur med rekombinant muse PDGFRβ. Efter gentagne vaske blev serielle fortyndinger af serumprøver fra immuniserede mus tilsat til brønden i dubletter. Pladerne blev yderligere inkuberet i 2 timer, vasket fire gange med PBST, og bundet-enzymaktivitet blev afsløret med et kromogent OPD-substratopløsning og måles ved 490 nm.

Histologi /Immunhistokemi

Formalin -Fast, paraffinindstøbte sektioner af tyktarmskræft metastatisk væv blev farvet med hæmatoxylin /eosin for morfologisk evaluering. Immunfarvning af CD45 blev udført med anti-muse CD45 mAb (BD Pharmingen, Le Pont de Claix, Frankrig) ved avidin-biotin kompleks immunperoxidase metode efter mikrobølge antigen-genvinding. Det primære antistof blev erstattet med isotype-matchede antistoffer i hosliggende vævssnit som negativ kontrol. Ekspression af CD45 i musemilt blev anvendt som positiv kontrol.

Statistisk analyse

Resultater udtrykkes som middelværdi ± S.E.M. og analyseret ved hjælp af den uparrede Students

t

test eller Kruskal-Wallis test for multiple sammenligninger.

Resultater

Angivelse af CCL5 og dens beslægtede receptorer i de resektion kolorektale carcinom prøver

Vi analyseret ved kvantitativ RT-PCR (tidstro-kvantitativ revers transkription polymerasekædereaktion) ekspressionsniveauerne af human CCL5 og dets receptorer CCR1, CCR3 og CCR5 på kirurgisk resektion stykker af humane primære colontumorer, af parret lever- og pulmonale kolorektal cancer metastaser og tilsvarende sundt væv, der indsamles fra de samme patienter. Vi observerede forøgede niveauer af CCL5 udtryk i kolorektale tumorer (6 gange, P 0,05), levermetastaser (8,5 fold, P 0,05) og lungemetastaser (4 fold, P 0,05) sammenlignet med raske individer (figur 1A, Tabel S1 ). Fordi CCL5 virker via specifikke receptorer, vi også set sådanne receptorer, der blev udtrykt i tumor og metastatiske prøver. Tydelige mønstre af CCRs udtryk blev målt i henhold til målorganet. Betragtninger CCR1 og CCR5 blev begge fundet at være signifikant overudtrykt i maligne levertumorer og lungevæv sammenlignet med tilsvarende kontrol biopsier (P 0,01 i lever, P 0,05 i lungerne), CCR3 blev kun fundet signifikant overudtrykt inden primære kolorektale tumorer sammenlignet med raske organer (P 0,05) (figur 1A, tabel S1)

Analyse af niveauerne af ekspression af humant (h) eller mus (m) mål blev udført ved kvantitativ RT-PCR i kirurgisk resektion stykker af humant colorektalt carcinom. (n = 10) (A), i eksperimentelle subkutane tumorer (n = 6), leveren (n = 6) og lungemetastaser (n = 6) afledt fra muse CT26-celler (B) eller afledt af humane HT29-celler (C) sammenlignet med tilsvarende raske væv (normal human, n = 10, og normalt muse colon, n = 6, henholdsvis). De relative niveauer af ekspression blev beregnet ved hjælp af standard kurver og udtrykt som 1 /ACt. ACt-værdier blev beregnet ved at fratrække Ct normalisere gen fra Ct af target-genet, målt på samme RNA forberedelse. Sammenlignende niveau af mRNA-ekspression mellem sunde (

X

) og metastatiske væv (

Y

) blev beregnet ved hjælp af formlen Δ

C

T

Y

– Δ

C

T

X

og udtrykt som gange over sunde (2ΔΔ

C

T). Sorte bjælker: primære eller subkutane colon tumorer; skraverede søjler: levermetastaser; stiplede søjler: lungemetastaser. * P 0,05, ** p. 0,01

For yderligere at vurdere den rolle, CCL5 /receptorer akse i tyktarmskræft, har vi ledt efter en relevant mus kolon carcinom model. For at gøre dette, har vi analyseret ved kvantitativ RT-PCR ekspressionsniveauet af CCL5 /CCRs i den menneskelige HT29 og i mus CT26 tyktarmskræft celler dyrket i kultur. Vi observerede CCL5 og CCR5 ekspression af begge cellelinier in vitro (tabel S1). Ingen af ​​de to andre CCL5 receptorer (CCR1 og CCR3) blev påvist i HT29 celler, hvorimod CCR1 ekspression blev fundet i CT26-celler. For at analysere, om udtrykket mønstre af CCL5 /receptorer i maligne væv var i overensstemmelse med dem, der observeres i humane biopsier, vi næste udviklet eksperimentelle modeller af ortotopisk (lever og lungemetastaser) og ektopisk (underhud) tyktarmskræft hos immunkompetente og immundefekte mus. Tyktarmskræft celler af mus (CT26) eller humane (HT29) oprindelser blev inokuleret i mus enten subkutant, under leveren kapsel eller gennem haleveneinjektion at generere lungemetastaser. Ved aflivning blev niveauer af kemokiner /receptorer inden for de forskellige målorganer evalueret ved real-time kvantitativ PCR under anvendelse af murine primere for CT-26-afledte tmors og menneskelige primere for HT-29-xenotransplantater (figur 1B og C). Forhøjede niveauer af CCL5 ekspression blev detekteret i alle tumormodeller (subkutan, hepatiske og lunge) udviklede med muse CT26-celler og med humane HT29-celler undtagen i lungelæsioner afledt af CT26-celler. I modsætning hertil mønstrene for ekspression af CCL5 receptorer var komplekse og ændres, når celler blev dyrket in vivo sammenlignet med dyrkningsbetingelser. Ingen af ​​de to tumormodeller (CT26 og HT29) nøjagtigt afspejler mønstret for kemokinreceptorer ekspression observeret i de humane biopsier. Derfor baseret på den kendsgerning, at alle tre CT26 tumortyper (subkutan, lever og lunge), udtrykt både CCL5 og CCR5 in vivo, mens HT29 xenografter udstillet niveauer af CCR5 under tærsklen for detektion af PCR-teknikken, har vi fundet mere hensigtsmæssigt at arbejde med CT26 modeller til vurdering af den rolle, CCL5 /CCR5 interaktion spillet i kolorektal cancer. Derudover CT26 syngene model, der er udviklet til immunkompetente mus optrådte også den bedst egnede til at tage hensyn CCL5 /CCR5-afhængige immunmekanismer, især i betragtning af at vores endelige mål var at kombinere CCL5 blokade med en vaccine-strategi.

CCL5 forbedrer CRC celleproliferation og migration

in vitro

har udtrykket for CCL5 receptorer ved humane og murine coloncarcinomceller fået os til at bestemme evnen af ​​deres fælles ligand CCL5 at stimulere deres proliferation og migration

in vitro

. Til dette formål har vi undersøgt og kvantificeret cellevækst efter udpladning CT26 og HT29-celler i 5 dage ved lav densitet i alene eller suppleret med forskellige koncentrationer af CCL5 basismedium. Inden for 5 dage serumudsultning, observerede vi, at CRC-celler fra begge oprindelser prolifererer som respons på CCL5 behandling på en dosis-afhængig måde (figur 2A og C). Den maksimale vækst blev observeret som respons på 50 ng /ml CCL5. Dernæst vurderes evnen af ​​CRC-celler til at migrere som respons på CCL5. CT26 og HT29-celler blev høstet, placeret i modificerede Boyden kamre og fik lov til at migrere til forskellige koncentrationer af CCL5. Figur 2B og D viser, at CRC-celler migreret til kemokin sammenlignet med alene basismedium. I betragtning af den centrale rolle, som CCR5 spiller i mediering CCL5 handlinger i forskellige kræftceller, vi næste forsøgt at forstyrre CCL5 /CCR5 handling ved hjælp af TAK-779, en tidligere beskrevet at svække tumor udvikling i bugspytkirtelkræft [22] non-peptid CCR5 antagonist. Stigende doser af TAK-779 (fra 10 til 500 nm) blev testet på CT26 celler ifølge IC50-værdier er beskrevet i det lave nM-område [28], [29]. Vi observerede en dosisafhængig effekt af TAK-779 på både vækst, den migrerende responser af CRC-celler, som afbildet på figur 2E og F. Den stærkeste inhibering blev opnået med 200 nM TAK-779, højere doser fører til cytotoksiske virkninger på cellerne. kun 28% af de CRC-responser blev imidlertid ophævet ved CCR5 blokade, hvilket antyder inddragelsen af ​​CCR5-uafhængige mekanismer i både cellulære processer. Forskellige koncentrationer af anti-CCL5 antistoffer, der spænder fra 3 til 30 ug /ml, blev derefter påført på CT26-celler. Som vist på figur 2G og H, CCL5 neutralisering opnået med 10 ug /ml dosis af antistoffer totalt svækkede CRC celler vandrende og vækstregulerende reaktioner på chemokinet. Kollektivt antyder disse data, at CCL5 /receptorer aktivering vises som et fælles træk ved de CRC celler fra forskellige oprindelser, at det kunne mediere malignitet-relaterede egenskaber af kolon kræftceller

(A, C, E., G) proliferation af CT26 og HT29-celler blev vurderet som reaktion på en 5-dages behandling med base medium alene (BSA, åbne søjler), med serum-beriget medium (FBS, skraverede søjler) eller med de angivne koncentrationer af rekombinant CCL5 ( udfyldte søjler), i nærvær eller i fravær af TAK-779 eller anti-CCL5 antistoffer (ved de angivne koncentrationer). (B, D, F, H) CRC-celler blev analyseret for kemotaksi som reaktion på basere medium alene (BSA, åbne søjler), til serum-beriget medium (FBS, skraverede søjler) eller de angivne koncentrationer af rekombinant CCL5 (fyldte søjler ), i nærvær eller i fravær af TAK-779 eller anti-CCL5 antistoffer. Resultaterne repræsenterer middelværdien ± standardfejl. af seks bestemmelser. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001

CCL5-sivering interaktioner er involveret i tyktarmskræft udvikling

For at sondere, om malignitet-relaterede. egenskaber af CCL5 udøvet på tyktarmskræft celler

in vitro

har også en relevans

in vivo

, vi evaluerede virkningen af ​​CCL5 neutralisering på udviklingen af ​​CT26 kolon tumorer implanteret subkutant i immunkompetente Balb /c mus. På dag 0 blev mus udfordret med en subkutan injektion af CT26-celler under huden. Dyrene blev derefter behandlet på dag +7, 10, +14 og +18 med intratumor administrationer af anti-CCL5 eller kontrol isotype IgG antistoffer. Ved aflivning blev omfanget af tumorudvikling vurderet ved at måle de tumorbelastninger. CT26-udfordrede mus udviklede inden for 7 dage en håndgribelig tumor i gennemsnit 20 mm

3, der voksede til en størrelse på ~336 mm

3 ved dag 21 (figur 3A). I modsætning hertil anti-CCL5-behandlede mus udviklede tumorer, som voksede med en reduceret sats sammenlignet med kontrol tumorer, denne reduktion er klart påviselig efter den tredje anti-CCL5 behandling (40% reduktion, P 0,01). Ved aflivning deres volumen nåede en gennemsnitlig størrelse på 202 mm

3, svarende til en reduktion på 40% i forhold til at styre byrder (P 0,05).

(A) Mus subkutant-udfordret med CT26 celler modtaget fire intratumor injektioner af anti-CCL5 (åbne prikker) eller isotype-matchede antistoffer (udfyldte prikker) på de angivne tidspunkter. Efter aflivning blev omfanget af tumorudvikling vurderet ved at måle de tumorbelastninger. (B) Forekomst og omfang af tumorudvikling i lever fra CT26-udfordret mus behandlet med anti-CCL5- eller isotype-matchede antistoffer. (C) Forekomsten af ​​peritoneal carcinose udtrykt som procent af mus, som bærer carcinose. (N = 5 /gruppe). * P 0,05, ** p. 0,01

I betragtning af at leveren er en stor målorgan i CRC malignitet og at de højeste ekspressionsniveauerne af CCL5 blev CCR1 og CCR5 findes inden levermetastaser fra humane coloncancer patienter, vi næste søgt at vurdere den beskyttende potentiale af anti-CCL5 behandling på udvikling af eksperimentelle levermetastaser i immunkompetente mus. Dyr blev således udfordret med en injektion af CT26 celler under leveren kapsel før behandling 72 timer efter inokulering og to gange ugentligt under hele forsøget med intraperitoneale administrationer af anti-CCL5 antistoffer ved dosen tidligere vist sig at være effektiv [20], [21]. Selvom 100% af musene fra begge grupper udviklede levertumorer, var der en signifikant reduktion (30%) i den samlede tumor belastning i leverne af anti-CCL5-behandlede mus sammenlignet med kontrolgruppen, som vurderet ved måling levervægt (1,24 vs 1,78, P 0,05). (figur 3B)

Udover levertumorer, vi også observeret forskelle i omfanget af macrospcopic peritoneal carcinose mellem de to grupper af behandlinger (figur 3C). Ud fra følgende betragtninger peritoneal udbredelse blev fundet i 100% af kontrolmusene, blev det kun observeret i 40% af de behandlede med anti-CCL5 antistoffer.

mPDGFRβ vaccination reducerer væksten af ​​CT26 tyktarmscarcinomceller metastaser

Da den anti-CCL5 strategien kun kan føre til en moderat terapeutisk virkning mod tyktarmskræft, vi næste søgt at vurdere potentialet af CCL5 blokade administreres i kombination med et anti-PDGFRβ strategi. Faktisk er PDGF /PDGFRβ interaktionen kendt for at spille en central rolle i at fremme flere maligniteter, herunder kolorektal carcinom. Især Wehler et al [30] har vist, at PDGFRβ ekspression korrelerede med lymfatisk udbredelse i human colorectal cancer. Arbejde på 99 humane CRC biopsier, de rapporterede ved immunhistokemi og RT-PCR forfattere der PDGFRβ ekspression forekom hos 60% af patienterne. Tilsvarende blev PDGFRβ ekspression påvist i fire humane CRC cellelinier: Caco-2, HT29, SW480 og SW620. Konsistent med dette har vi observeret høje niveauer af ekspression af mPDGFRβ i CT26 afledt levermetastaser (figur 4A). Som følge heraf har vi skabt en DNA-vaccine, der koder mPDGFRβ og efterprøvede den korrekte ekspression af mPDGFRβ ved Western blot-analyse efter transient transfektion af CHO-celler (figur 4B). Vi derefter fremstillet formuleringer af DNA-vaccine plasmider med 704, en tetrafunctionalized amfifil blokcopolymer, der er tidligere blevet vist at forbedre intramuskulær DNA-vaccination ved samtidig forøges transgen ekspression og aktivering immunitet [25], [26]. Styrken af ​​704-formulerede DNA-vaccine plasmid for at tillade genlevering ind

tibialis anterior

muskler 6 uger gamle Balb /c-mus blev bedømt ved Western blotting (figur 4C) og bekræftede muskulære ekspression af proteinet efter administration af lav-dosis-DNA (25 ug). Ifølge en tidligere optimeret immuniseringsprotokol [25], [26], mus blev udfordret på dag 0, og restimuleret på dag +21 og dag +42 med DNA-vaccinen (50 ug) eller kontrolvektoren formuleret med 0,3% polymer 704. To uger efter den prime-boost immunisering blev sera fra de to grupper dyr analyseret for tilstedeværelsen af ​​mPDGFRβ specifikke antistoffer. Som afbildet på figur 4D, immuniserede mus udviste en humoral respons på mPDGFRβ protein påvist ved ELISA (P = 0,005). Tilstedeværelsen af ​​specifikke mPDGFRβ antistoffer i deres sera blev yderligere bekræftet ved at teste deres evne til at reagere med bånd af det rensede antigen fra mPDGFRβ-transficerede CHO-celler ved Western blot-analyse (Figur 4E), og ved Fornyet probing blottet med et kommercielt antistof specifikt til mPDGFRβ. Evnen af ​​vores DNA vaccine til at fremkalde en mPDGFRβ-specifik adaptive immunrespons førte os til at undersøge, om denne fremgangsmåde kan beskytte CT26-udfordret mus. Efter en profylaktisk indstilling, vi administreret mPDGFRβ vaccine ifølge prime-boost regimen beskrevet ovenfor før pode CT26 celler under leveren kapsel (figur 5A).