PLoS ONE: Suprafenacine, en indazol-Hydrazide Agent, Mål Cancer Cells Gennem mikrotubulus Destabilization

Abstrakt

Mikrotubuli er en højt valideret target i kræftbehandling. Imidlertid har den kliniske udvikling af tubulin bindemidler (TBA) blevet hæmmet af toksicitet og kemoresistens spørgsmål og har nødvendiggjort søgen efter nye TBA’er. Her rapporterer vi identificering af en hidtil ukendt celle gennemtrængelig, tubulin-destabiliserende molekyle – 4,5,6,7-tetrahydro-1H-indazol-3-carboxylsyre [1p-tolyl-meth- (E) -yliden] -hydrazid (betegnes som Suprafenacine, SRF). SRF, der er konstateret ved

in silico

screening af kommenterede kemiske biblioteker, blev vist at binde mikrotubuli ved colchicin-bindingssted og inhibere polymerisation. Dette førte til G

2 /M cellecyklusstop og celledød via en mitokondrier-medieret apoptosecyklus. Celledød blev efterfulgt af tab af mitokondrie membran potentiale, JNK – medieret phosphorylering af Bd-2 og Bad, og aktivering af caspase-3. Interessant nok blev SRF sig selektivt at inhibere cancercelleproliferation og var effektiv mod medikamentresistente cancerceller i kraft af sin evne til at omgå multilægemiddelresistens transporteren P-glycoprotein. Tilsammen vores resultater antyder, at SRF har potentiale som et kemoterapeutisk middel til behandling af cancer og tilvejebringer en alternativ stillads til udvikling af forbedrede anticancermidler

Henvisning:. Choi BH, Chattopadhaya S, Thanh LN, Feng L, Nguyen QT, Lim CB, et al. (2014) Suprafenacine, en indazol-Hydrazide Agent, Mål Cancer Cells Gennem mikrotubulus destabilisering. PLoS ONE 9 (10): e110955. doi: 10,1371 /journal.pone.0110955

Redaktør: Ben CB. Ko, The Hong Kong Polytechnic University, Hongkong

Modtaget: 10. oktober 2012; Accepteret: September 26, 2014; Udgivet: 29 oktober 2014

Copyright: © 2014 Choi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Sundhed Singapore Grant NMRC1177 /2008. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mikrotubuli – lange, trådformede, rør formede polymerer – mægle vigtige roller i cellulær signalering, transport af ladninger, etablering af cellepolaritet, vedligeholdelse af celle form, cellulære migration og celledeling [1], [2]. Sammensat af a- og p-tubulin-heterodimerer bundet i en hoved-til-hale måde, mikrotubuli er ikke enkle ligevægt polymerer; i stedet de er meget dynamiske strukturer og den hurtige samling og adskillelse dynamik er afgørende, for en stor del af deres cellulære funktioner. Ikke overraskende mikrotubulus polymerisation er underlagt stram rumlig og tidsmæssig regulering og dette opnås på flere niveauer, herunder (1) transskription af forskellige tubulin isotyper har forskellige funktioner; (2) ved at regulere α /β – tubulin nøgletal og heterodimer foldning (3) gennem forskellige post-translationelle modifikationer af tubulin, som igen, aendrer mikrotubulus lokalisering og /eller dens samspil med signalveje og (4) via interaktion med microtubule- associerede proteiner (kort) som dynein og kinesin motoriske proteiner, stathmin, TOG, EB1, dynactin 1, Rac1 etc [3] – [5]. Paradoksalt nok den samme dynamiske karakter af mikrotubuli gør dem også udsøgt følsomme over for inhibitorer. Ved at forstyrre fintunet opførsel af mikrotubuli, tubulinbindende medicin forstyrrer processen med celledeling og har vist sig at være meget effektiv hos cancerpatienter [6].

De fleste af de mikrotubulus-bindende lægemidler hidtil identificerede er blevet isoleret fra enten planter eller marine organismer i store skærme af naturprodukter. Mikrotubulus-målrettet antimitotiske lægemidler klassificeres normalt i to grupper – mikrotubulus destabiliserende midler såsom vinca-alkaloider, colchicin og mikrotubulus-stabiliserende midler, såsom paclitaxel og docetaxel. Selvom taxaner og vinca alkaloider stadig administreres til en lang række af cancere og er ofte integreret i kombination med kemoterapi [7], [8], den nuværende suite af tubulinbindende lægemidler har flere ulemper. Sammenlignet med andre anticancerlægemidler, mikrotubulus-bindende lægemidler er strukturelt kompleks, kemisk forskellige og har lav opløselighed. Desuden forekommer de aktive stoffer i kun små mængder i naturen og knapheden på deres naturlige kilder har alvorligt hæmmet deres kliniske udvikling. Selvom dette spørgsmål blev behandlet af udviklingen af ​​delvise eller totale syntesemetoder [9], og via metabolisk engineering af pathway mellemprodukter [10], problemet stadig fortsætter, hvor udviklingen af ​​nye mikrotubulus-bindende forbindelser er berørt. En anden ulempe er lægemiddelresistens forårsaget af mutationer og /eller ekspression af forskellige tubulin isotyper som βIII-tubulin. Drug resistens kan også stammer fra overekspression af narkotika-efflux pumper, herunder multiresistens transporteren P-glycoprotein (P-gp) eller multidrug-resistens protein (MRP) [11]. Patienter administreres med mikrotubulus-bindende midler tendens til at lide af perifer neuropati axonal der begrænser tolerable dosis [12]. Trods disse begrænsninger flere antimitotiske lægemidler med forskellige bindingssteder på tubulin er i forskellige stadier af klinisk udvikling. Den armamentarium af mikrotubulus-målrettede midler med forbedret farmakodynamiske og farmakokinetiske profiler, minimal neurologisk toksicitet og bredspektret virkning, fortsætter med at vokse [13] – [15]. Ideelt set bør sådanne ledninger også være blottet for P-gp-medieret lægemiddel efflux og være modtagelige for letkøbte kemisk syntese tilgange.

I dette arbejde vi rapporterer en ny forbindelse baseret på indazole stillads, 4,5,6 , 7-tetrahydro-1H-indazol-3-carboxylsyre [1p-tolyl-meth- (E) -yliden] -hydrazid (Suprafenacine eller SRF), som viser potente anticancer egenskaber. Vi diskuterer identifikationen af ​​SRF med

in silico

højkapacitetsscreening tilgang, dets kemiske optimering og belysning af dens mikrotubulus bindende tilstand. SRF destabiliserer mikrotubuli, der fører til cellecyklus arrest i G2 /M-fasen og celledød ved apoptose. Desuden viser vi, at SRF kan omgå P-glycoprotein transporteren, specifikt rettet mod kræftceller og er effektiv mod flere forskellige typer kræft.

Materialer og metoder

Kemikalier og antistoffer

Nocodazole, paclitaxel (Taxol), vinblastin og colchicin blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). SRF blev indkøbt fra ChemDiv mens SB203580, PD98059 og SP600125 var fra Calbiochem (San Diego, CA). Antistoffer blev fremstillet af følgende selskaber: vimentin, α- og β-tubulin, JNK-1, MDR-1, Bcl-2, pBcl-2 (T56), pBcl-2 (S70), pBcl-2 (S87) ( Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA); pp38, pErk1 /2, pJNK (Cell Signaling Technology, Denver, MA); monoklonalt anti P-glycoprotein (MDR) (Sigma, USA) og monoklonale actin antistoffer var fra BD Pharmingen (San Diego, CA). [

3H] vinblastin (specifik aktivitet, 11,6 Ci /mmol) og streptavidin-coatede yttrium silicat scintillationsnærhedsassay (SPA) beads blev indkøbt fra GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). [

3H] colchicin (specifik aktivitet, 80,4 Ci /mmol) blev opnået fra PerkinElmer (Boston, MA, USA).

Cell Culture

Humane cancer cellelinjer (HeLa, MDA -MB-231, A549, blev HCT15, Jurkat, PC12 og SH-SY5Y) og humane fibroblastcellelinier (CCL-116 og WI-38) opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). SNU16, human mavekræft cellelinje, blev opnået fra koreanske cellelinje Bank (KCLB, Seoul, Korea). Den menneskelige epitelial primære cellelinje F10, og den parentale cellelinje for resistente mutanter, KB-3-1, og multiresistent linje, KB-V1 var en generøs gave fra Dr. Peter Dröge (NTU, Singapore) og Dr. M. Gottesman (NCI, Bethesda, MD), henholdsvis [16]. Cellelinier blev dyrket i enten Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) eller RPMI 1640 indeholdende 10% føtalt bovint serum, 1% penicillin /streptomycin og holdt ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 kammer. For KB-3-1 og KB-1V blev mediet suppleret med yderligere 1 mM natriumpyruvat og 10 ug /ml vinblastin, hhv. Alle resistente linjer blev inkuberet i stoffri medier forud for cellulære proliferationsassays.

Cell Cycle Analysis

cellecyklusprogression blev overvåget ved hjælp af DNA-flowcytometri. Celler blev podet ved en densitet på ca. 2 × 10

5 celler /brønd i en 24-brønds plade. Når monolag var 50-70% konfluente blev celler behandlet med lægemidler som angivet. Efter 24 timer behandling blev cellerne trypsiniseret, vasket med PBS og fikseret i 80% ethanol i 1 time ved -20 ° C. De fikserede celler blev resuspenderet i propidiumiodid (PI) farvning buffer (10 mM Tris-HCI pH 8,0, 10 mM NaCl, 50 ug /ml PI, 10 ug /L RNase A, 0,1% NP-40) i 30 minutter ved 4 ° C i mørke. Den DNA-indholdet blev bestemt på en FACSCalibur System (BD Biosciences, San Jose, CA). For hver analyse blev 10.000 celler talt og procentdelen af ​​celler i hver fase blev beregnet under anvendelse ModFit LT software.

apoptoseassays Salg

Apoptose blev overvåget ved anvendelse annexin V-propidiumiodid (PI) dobbelt farvning metode. Celler blev farvet under anvendelse af Annexin V-FLOUS farvning kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) ifølge producentens instruktioner. Celler blev analyseret ved en BD LSR II flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) under anvendelse af 488 nm blå laser til excitation og et 505LP spejl-530/30 BP filter og 550LP spejl-575/26 BP filterkombinationer at detektere fluorescein og PI-fluorescens, hhv. For hver prøve blev 10.000 begivenheder opsamlet.

mitochondriemembran potentialemålinger

Ændringer i mitochondriemembranpotential blev påvist under anvendelse mitokondriemembranen Potentiel Detection Kit (Stratagene, Cedar Creek, TX) og på grundlag om anvendelsen af ​​det kationiske farvestof, 5,5 ‘, 6,6′-tetrachlor-1,1′, 3,3’ tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodid (almindeligvis kendt som JC-1). JC-1 danner fluorescerende røde aggregater i mitokondrier af intakte celler, mens i apoptotiske celler, kollaps af mitokondrie forårsager JC-1 at forblive i cytoplasmaet i sin monomere grønne formular. Kort beskrevet blev celler behandlet med SRF, i nærvær eller fravær af JNK-inhibitor SP600125 og inkuberet natten over. Celler blev derefter trypsiniseret, vasket med PBS og pelleteret (400

g

, 5 min, RT). Dernæst pellets (1 × 10

6 celler /prøve) blev resuspenderet i 500 pi af 1 X JC-1-farvning opløsning og inkuberet i 15 minutter ved 37 ° C i en CO 5%

2 fugtig atmosfære. Efter 2X vasker med assaybuffer, blev celler resuspenderet i slutvolumen på 500 pi assaypuffer. Fluorescensintensiteter blev målt på en BD FACSCalibur System (BD Biosciences, San Jose, CA) og CellQuest software blev anvendt til dataanalyse. Tab af mitokondriepotentiale blev målt som forholdet mellem den rød-til-grøn fluorescens; sammenlignet med ubehandlede celler, vil dette forhold falde i apoptotiske celler.

caspaseaktivering Assay

Caspase-3-aktivitet blev målt ved anvendelse af CaspACE Assay System (Promega, Madison, WI) ifølge leverandørens protokol. Kort fortalt, 2 × 10

5 celler /brønd blev podet i en 6-brønds plade. Når monolag var 50-60% konfluente blev celler behandlet med SRF i nærvær eller fravær af JNK-inhibitor, SP600125 og inkuberet natten over ved 37 ° C i en CO 5%

2 fugtig atmosfære. Efter cellerne blev høstet, blev pellets vasket med iskold PBS og resuspenderet i Cell Lysis Buffer. Fryse-tø-metoden blev anvendt til at lysere celler og lysaterne blev holdt på is i 15 min. Efter klaring af lysaterne ved centrifugering (15, 000

g

, 20 min, 4 ° C), supernatanten blev anvendt til at bestemme Caspase-3-aktivitet. I en 96-brønds plade blev 2 pi (10 mM stamopløsning) af Ac-DEVD-pNA-substrat tilsat til reaktionsblandingen indeholdende cellulært lysat, DTT, Caspase Assay Buffer og deioniseret vand i et slutvolumen på 100 pi. Plader blev inkuberet natten over ved 20-22 ° C i 4 timer, og absorbansen blev målt ved 405 nm under anvendelse af en Benchmark Plus mikropladelæser (Bio-Rad, Hercules). Ubehandlede celleekstrakter blev anvendt som kontrol til forsøgene.

immunfluorescensmikroskopi

I immunhistokemi blev celler fikseret med 3,7% PFA efterfulgt af inkubation i en blokeringsopløsning (5% BSA i PBS) i 30 minutter ved 4 ° C. Efter 3X gange vask med PBS blev cellerne permeabiliseret med 0,2% Triton X-100, vasket 3 x med PBS og derefter inkuberet natten over med a- eller p-tubulin antistoffer ved 4 ° C. Efter vask blev prøverne inkuberet med AlexaFluor 488-konjugeret sekundært antistof (Molecular Probes, Eugene, Oregon) i 1 time ved stuetemperatur. Slides blev monteret ved hjælp forlænger Gold anti-fade løsning (Molecular Probes, Eugene, Oregon), der indeholder DAPI og visualiseres ved 60X forstørrelse på en Zeiss LSM META510 konfokal laser scanning mikroskopi. Alle indlæg erhvervelse billedbehandling og analyse blev udført ved hjælp af MetaMorph software (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA).

In Vitro

tubulinpolymerisation Assay

tubulinpolymerisation blev målt

in vitro

bruge tubulinpolymerisations Assay kit (Cytoskeleton, Denver, CO). Tubulin blev opløst i puffer 1 (80 mM PIPES, 2 mM MgC

2, 0,5 mM EGTA pH 6,9, 10 pM fluorescerende reporter, 1 mM GTP) til en endelig koncentration på 10 mg /ml. Til analyse tubulinpolymerisation, en blanding indeholdende 85 pi tubulin (slutkoncentration 2 mg /ml), 4,4 pi GTP (lager 100 mM), 280 pi puffer 1 og 75 pi af tubulin Glycerol puffer (80 mM PIPES, 2 mM MgC

2, 0,5 mM EGTA, 60% glycerol, pH 6,9), blev gjort og holdt på is. Dernæst 5 pi testforbindelse, paclitaxel, blev nocodazol eller kontrol buffer aliquotted i hver brønd på en halv område 96 brønde, sort, fladbundet plade (Corning Costar). Pladen blev opvarmet i 1 min i en 37 ° C forvarmet pladelæser. Polymerisering blev initieret ved pipettering 50 pi reaktionsblanding /brønd og overvåges ved at måle ændringen i fluorescens (E

x = 360 nm; E

m = 420 nm). Måling blev udført under anvendelse Spectrafluor Plus mikropladelæser (TECAN GmbH, Austria). Aflæsninger blev taget hvert minut i 1 time (i alt 61 aflæsninger).

tubulin Konkurrence-Binding scintillationsnærhedsassay

Dette assay blev udført for konkurrence binding til colchicin og vinblastin bindende sites på tubulin og udføres i en plade med 96 brønde. Biotin-mærket tubulin (Cytoskeleton, Denver, CO) blev opløst i G-PEM-puffer (80 mM PIPES pH 6,8, 2 mM MgC

2, 0,5 mM EGTA, 1 mM GTP og 10% glycerol) til en slutkoncentration på 0,8-1 mg /ml. [

3H] colchicin eller [

3H] vinblastin (slutkoncentration på 50 nM og 100 mM), 50 pM af SRF og 1,0 ug af biotin-mærket tubulin blev blandet i et endeligt reaktionsvolumen på 100 pi af G-PEM-puffer og inkuberet i 45 minutter ved 37 ° C. Streptavidin SPA-perler (80 ug /brønd) blev tilsat til hver reaktionsblanding og inkuberet i yderligere 30 minutter ved 4 ° C. De radioaktive tællinger blev målt ved anvendelse af en Wallac Microbeta scintillationstæller (PerkinElmer, Waltham, MA). For kontrolreaktioner blev SRF udeladt fra reaktionsblandingen.

In Vivo

effektstudier

Svær kombineret immundefekt (SCID) hunmus, 4-6 uger gamle, blev opnået fra Animal Resources Centre (Murdoch, Australien). Mus blev implanteret subkutant i flanken med 1 × 10

7 HCT15 humane colon adenocarcinoma celler. Behandlingen startede, da tumor størrelse opnået en 100-200 mm

3 eller større. Dyr blev behandlet intraperitonealt (i.p.) med 20 mg /kg /dosis SRF i sidste dosis formulering eller en 0,9% saltvand køretøj. Forbindelse blev givet til tumor-bærende mus på dag 1, 4, og 7 efter iscenesættelse, og tumor masse [(længde × bredde

2) /2] blev bestemt en gang om tre dage i 9 dage.

Statistisk analyse

Alle eksperimenter blev uafhængigt gentaget mindst tre gange. Alle kvantitative data er præsenteret som middelværdi ± SEM. Sammenligninger mellem to grupper blev analyseret via studerendes

t

test, og værdier

P

. 0,05 blev anset for at være betydelige

Resultater

Identification af SRF som et nyt tubulin-bindende lille molekyle

for at identificere nye anticancer molekyler, der virker via binding til tubulin, vi indledte et mål-baserede

i silico

screening af små molekyler ved hjælp af en ChemDiv bibliotek . De indledende træf identificeret fra den virtuelle skærm blev testet for deres evne til at inhibere både cellulær proliferation og tubulinpolymerisation. Af alle de testede forbindelser, en indazol hydrazidderivat – 4,5,6,7-Tetrahydro-1H-indazol-3-carboxylsyre [1- (3-hydroxy-4-methoxy-phenyl) -meth- (E) – yliden] hydrazid, blev fundet at hæmme mikrotubuli polymerisering (IC

50 = 0,77 uM). For yderligere at identificere analoger med forbedrede kræfter blev Structure aktivitet relationer (SAR) undersøgelser foretaget [Metoder S1] og en fokuseret bibliotek af 72-analoger blev syntetiseret og screenet for deres evne til at hæmme mikrotubuli polymerisation. Denne indsats identificeret analogen 4,5,6,7-tetrahydro-1 H-indazol-3-carboxylsyre [1-

p-

tolyl-meth- (E) -yliden] -hydrazid (analog 4; herefter benævnt SRF), som en potent molekyle (IC

50 = 0,38 uM) [Figur 1A].

(a) Kemisk struktur af SRF. (B) Effekt af SRF på mikrotubuli polymerisering

in vitro

. Oprenset tubulin blev inkuberet ved 37 ° C i fravær (DMSO) eller nærvær af stoffer som taxol (3 uM), nocodazol (10 uM) blev SRF og absorbansen målt ved 420 nm hver 1 min over en 60 min periode. SRF inhiberede mikrotubulus polymerisation i en koncentrationsafhængig måde, som blev indikeret ved et fald i absorbans med tiden. (C) Konfokal mikrografier af HeLa-celler eksponeret for SRF, taxol og nocodazol. Celler blev mærket med FITC-konjugeret anti-tubulin-antistof. SRF behandling helt ødelægger indviklet mikrotubulære netværk. Scale bar = 10 uM.

SRF inhiberer cellulær proliferation af forskellige cancer celletyper

Vi anvendte en kolorimetrisk analyse for at evaluere anti-proliferative effekt af SRF på cancerceller afledt af en bredt spektrum af repræsentative tumortyper – cervikal adenokarcinom (HeLa, KB-3-1, KB-V1), T-celle lymfom (Jurkat), gastrisk karcinom (SNU-16), brystcancer (MDA-MB-231), lunge cancer (A549), colorektal adenocarcinom (HCT-15) og neuroblastom (SH-SY5Y) [tabel 1]. Alle testede cancer cellelinjer viste modtagelighed for SRF med IC

50 værdier i mikromolære område (83-381 nM). Interessant, sammenlignet med taxol, SRF udviste højere styrke over for neuroblastom SH-SY5Y og colorectal adenocarcinom HCT-15-cellelinjer. Endvidere har vi også testet effekten af ​​SRF på normale celler som hud fibroblastcellelinie CCL-116 og human epithelial primær cellelinie F10. Både CCL-116 og F10 viste mere end 80% overlevelse efter en 24 timers udsættelse for SRF mens kun 60% overlevelse blev set, når de samme celler blev behandlet med taxol under identiske betingelser [Figur S1]. Tilsammen vores data bekræfter, at SRF selektivt rettet mod kræftceller og er effektiv mod flere forskellige typer kræft.

SRF kan omgå p-glycoprotein narkotika efflukspumpen

Den kliniske succes de lægemidler, der anvendes i cancerbehandling er blevet hæmmet af udviklingen af ​​lægemiddel-resistens. Fænomenet multilægemiddelresistens er ofte forbundet med en stigning i ekspression af

MDR1

gen, som koder P-glycoprotein (P-gp), en energi-afhængig udstrømningspumpe. For at være klinisk relevant, skal SRF kunne omgå P-gp-medieret efflux. Vi bestemt derfor effekt af SRF om spredning af epidermal karcinom cellelinje KB-V1, en vinblastin resistent underlinje afledt fra forældrenes KB-3-1 celler [16] [Tabel 2]. KB-V1 celler er stærkt beriget med P-gp og de viser krydsresistens over for colchicin og adriamycin [Figur S2]. Sammenligning af antiproliferativ virkning medieret af SRF og taxol afslørede, at SRF er 35 gange kraftigere end taxol mod KB-V1-cellelinje, mens begge forbindelser viste lignende effekt mod KB-3-1-celler, da disse celler ikke er kendt for at overudtrykker P-gp [17]. Evne SRF at omgå P-gp forklarer formentlig, hvorfor det er mere potent end Taxol i SH-SY5Y neuroblastom og HCT-15 kolorektal adenocarcinom celler som begge disse kræft celletyper udtrykkelig forhøjede niveauer af P-gp protein [17] – [19].

SRF destabiliserer mikrotubulussamling ved binding til colchicin-bindingssted

for at vurdere den primære virkningsmekanisme af SRF, vi profileret dens virkning på tubulin polymerisering

in vitro

[Figur 1B]. Resultaterne viser, at SRF inhiberer tubulin-polymerisation i en koncentrationsafhængig måde med en IC

50 på 0,38 uM. Desuden blev den mikrotubulus-forstyrre virkningen af ​​SRF sammenlignet med to forskellige mikrotubulus målrettede lægemidler, taxol, Nocodazole, kendt som anti-neoplastiske midler ved at forstyrre polymerisation af tubulin. Især SRF påvirket indtræden af ​​polymerisationen (kernedannelse fase) og dets hastighed (forlængelse fase) resulterer i reduceret tubulin polymermasse. Vi undersøgte også effekten af ​​SRF på mikrotubulussamling på celleniveau ved hjælp immunhistokemi. HeLa celler udsat for SRF i 24 timer blev fikseret og farvet med mikrotubuli a- eller p-tubulin antistoffer. Sammenlignet med ubehandlede kontrolceller, der opretholder en indviklet og organiseret mikrotubulus-netværket, SRF behandling forårsagede en fuldstændig destruktion af dette cytoskeletale netværk og udseende af rigelige, karakteristiske korte bundter, der blev fordelt over hele cytoplasmaet i disse celler [Figur 1C]. Tilsvarende sprængning af mikrotubuli blev observeret med nocodazol eksponering ruller taxolbehandling produceret kortere, men tættere mikrotubuli i overensstemmelse med dets rolle som mikrotubulus-stabiliserende middel [Figur 1C]. Salg

Forbindelser, der inhiberer tubulin-polymerisation meste binde til den kendte distinkt steder, nemlig taxol, vinblastin, orcolchicine lokaliteter af tubulin. En konkurrencedygtig-bindende Scintillation Proximity assayet (SPA) blev anvendt til probeSRF bindingssted på tubulin. SRF reducerede ikke specifikke SPA tællinger stimuleret af konjugering af biotin-mærket tubulin med [

3H] taxol eller med [

3H] vinblastin, men stærkt konkurrerede om binding af [

3H] colchicin til tubulin [Figur 2A og 2B]. Dernæst blev molekylære modellering og docking undersøgelser gjort for yderligere at fastslå bindende form for SRF. Brug af krystalstrukturen af ​​tubulin-colchicin: stathmin-lignende domæne (PDB 1SA0), både colchicin [Figur 2C] og SRF [Figur 2D] blev dokket i colchicin-bindende lomme af tubulin. På trods af den strukturelle forskellighed, SRF deler samme kartesiske plads som colchicin. I modsætning til colchicin, SRF mangler brint bond interaktioner med Cys241 af β-kæden. I stedet indazol ring af SRF danner hydrogen-binding interaktion med Asn349, Lys352 af β-kæden samt Val181 og Thr179 af α-kæde, mens 4-methylgruppen i de distale phenylringen danner hydrofobe interaktioner med β-kæden Lys 254. samlet set docking undersøgelser viser, at selv om SRF og colchicin binder til samme sted på tubulin, SRF har en bindende tilstand lidt forskellig fra colchicin [Figur 2E].

(a) SRF konkurrerer med colchicin for binding til mikrotubuli som blev bestemt under anvendelse konkurrence-bindende scintillation Proximity assayet (SPA). I sammenligning med kontrol (ingen konkurrent), SRF faldt colchicin binding med 2,5-fold. Data er vist som middelværdi ± SEM. *

P

0,05, **

P

0,01 versus kontrol. (B) SRF og vinblastin har særskilte bindingssteder på tubulin som SRF ikke konkurrerer med vinblastin. De viste resultater er gennemsnit (± SD) af tre uafhængige forsøg. Data er vist som middelværdi ± SEM. *

P

0,05 versus kontrol. (C-E) Cartoon repræsentation af bindende tilstand af colchicin (C) og SRF (D) til tubulin. Den bindende form for medicin til tubulin blev undersøgt ved docking undersøgelser med anvendelse af molekylær docking program GOLD (Genetisk optimering til ligand Docking, Cambridge Crystallographic datacenter, UK) [Methods S1]. Forbindelserne (colchicin eller SRF) blev dokket i colchicin-bindende lomme af tubulin ved anvendelse af krystalstrukturen af ​​tubulin-colchicin: stathmin-lignende domæne [PDB-kode: 1SA0]. H-bond interaktioner mellem det indazol ring af SRF og N349 og K352 af β-kæde (grøn) samt T179 og V181 af α-kæde (blå) er fremhævet. Panel E viser overlay af SRF og colchicin fremhæve forskellen i binding mønstre af disse molekyler.

SRF anholdelser cellecyklus i G2 /M-fase

Da mikrotubulusdynamik har vigtige roller i cellecyklusprogression, mitotisk stall kan føre til forskellige kemoterapeutiske udfald herunder mitotisk død, mitotisk exit, apoptose eller aneuploidi [11], [20]. For at undersøge effekten af ​​SRF på cellecyklusprogression, blev HeLa-celler behandlet med forskellige koncentrationer af SRF i 24 timer og cellecyklus blev overvåget ved flowcytometri. SRF behandling forårsagede en fuldstændig kollaps af alle cellerne i G

1 fase på en dosis-afhængig måde og dramatisk stigning i G

2 /M population af celler behandlet med 10 pM SRF [Figur 3A og Figur S3]. Lignende virkninger på mikrotubuli blev observeret med nocodazol og taxol. Standsning af cellecyklus blev ledsaget af svigt af den mitotiske spindel til at adskille i hurtigt delende celler [Figur 3B]. Men ingen signifikant stigning i G

2 /M fase blev observeret i normale cellelinier (CCL-116, WI-38 og F10) upon SRF behandling [Figur S4]. Da cellecyklusstop uvægerligt udløser apoptose, udførte vi annexin V-PI dobbelt farvning på SRF-behandlede celler for således at overvåge phosphatidylserin eksponering, et signal til tidlig apoptose. Efter en kort 7 timer eksponering, befolkningen af ​​tidlige apoptotiske celler (annexin V

+ /PI

-) steget voldsomt fra 2,4% til 21,7% [Figur 3C], hvilket indikerer, at SRF inducerer hurtig apoptose i prolifererende celler .

(A) Flowcytometrisk analyse af DNA-indholdet i celler behandlet med SRF (10 uM), nocodazol eller taxol. Vist er repræsentative én-parameter histogrammer af behandlede celler. Ligesom taxol og nocodazol, SRF-medieret inhibering af mikrotubulusdynamik resulterede i cellecyklusstop på G

2 /M overgangsfasen. (B) Fluorescens-mikrografer af mitotiske celler, der var blevet forbehandlet med de angivne forbindelser. I forhold til køretøjets behandlede celler, SRF og andre TBA’er hæmmede dannelse og adskillelse af mitosespindelen. Mikrotubuli (grøn) blev farvet med FITC-konjugeret anti-tubulin antistof; kerne (blå) blev farvet med DAPI. Billeder blev erhvervet til 60X forstørrelse. Scale bar = 5 uM. (C) SRF-behandling inducerer hurtig apoptose i prolifererende celler. Efter en kort 7 timer SRF eksponering (10 uM) blev apoptotiske progression overvåget ved dobbelt-farvning af celler med Annexin V-FITC (FL-1) /PI (FL-2). I denne periode, procentdel af annexin V

+ /PI

– (med angivelse tidlig apoptose) celler steg fra 2,4% (i kontrol) til 21,7%. Kinetikken af ​​denne forhøjelse er magen til den, der ses med nocodazol og taxol. Begge disse forbindelser induceret apoptose hos ca. 25,4% (nocodazol) og 33,2% (taxol) af celler inden for denne tidsperiode. Forsøgene blev udført i tre eksemplarer (n = 3) og data værdi blev gennemsnit.

SRF inducerer apoptose via JNK-medieret phosphorylering af Bd-2 og Bad

Bcl- 2 familie af proto-onkogener er master-regulatorer af apoptose og funktion som molekylære reostater at styre cellulær overlevelse [21]. Da antimitotiske stoffer som paclitaxel, vincristin, vinblastin, inducerer Bcl-2 hyperphosphorylering i løkkeregionen [22] – [26], undersøgte vi virkningen af ​​SRF på Bcl-2. Ekstrakter fra HeLa-celler behandlet med 10 pM SRF i 24 timer blev analyseret ved immunoblotting med monoklonale anti-Bcl-2-antistof. Resultaterne viser, at sammen med et Bel-2, SRF-behandlede celler har yderligere bånd (er), der har langsommere vandringshastighed sammenlignet med Bcl-2 [figur 4A, øvre panel]. I modsætning til HeLa-celler, vehikelbehandlede celler manglede helt den ekstra bånd. Ligeledes phosphoryleringstilstanden af ​​Bcl-2 i den normale diploide lunge fibroblastcellelinie WI-38 forblev uændret selv efter 24 timer SRF behandling [Figur 4A, midterste panel]. For at bekræfte at båndet (e) er faktisk phosphorylerede former af Bcl-2, blev blots derefter probet med phospho-Bcl-2 specifikke antistoffer. SRF inducerede phosphorylering af Bcl-2 på flere rester (T56, S70 og S87), som alle ligger inden for en fleksibel loop-region [Figur 4B]. Tilsammen disse observationer yderligere gentage, at SRF selektive mål kræftceller. Foruden Bcl-2, en 24 h udsættelse for SRF behandling inducerede også phosphorylering af den pro-apoptotiske Bcl-2 familiemedlem – Bad [Figur 4C] mens Bcl-x

L, Bak og Bax forblev upåvirket [Figur S5].

(A) Western blot-analyse af HeLa og WI-38 celleekstrakter behandlet med 10 pM SRF i 24 timer og undersøgt med anti-Bcl-2 monoklonalt antistof. En langsommere vandrende bånd svarende til phosphorylerede form af Bcl-2 er til stede i HeLa udtrækker men fraværende fra WI-38 lysater, der viser, at SRF inducerer selektiv phosphorylering af Bcl-2 i cancercellerne. (B) SRF medierer Bcl-2 hyperphosphorylering. Lægemiddelbehandlede HeLa-lysater blev opløst på 12% SDS-PAGE og immunoblotting blev udført under anvendelse af specifikke phospho-antistoffer mod T56, S70 og S87 rester af Bcl-2; alle disse aminosyrer ligger i den fleksible loop område af proteinet. (C) Tidsforløb analyse af Bad-phosphorylering fremkaldt af SRF behandling. HeLa cellelysater blev analyseret ved immunoblotting under anvendelse af anti-Bad monoklonalt antistof. SRF (10 uM) behandling ændrede phosphorylering status af pro-apoptotisk protein Bad som indikeret ved forekomsten af ​​en langsommere migrerende phospho-Bad bånd ved 24 timer. Bandet var fraværende fra kontrol (DMSO behandlet) celler selv efter 24 timer.

mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPK), udtrykkes i alle celletyper, transducere signaler fra cellemembranen til kernen som svar på en række stimuli, og også regulere et bredt spektrum af biologiske processer kritiske for cellulær homeostase [27]. Blandt de forskellige veje medieret af MAPK familiemedlemmer, det ekstracellulære signal-regulerede kinase 1 og 2 (ERK1 /2), c-Jun N-terminal kinase /stress-aktiveret proteinkinase (JNK /SAPK) og p38 MAPK, er kendt for at