PLoS ONE: Cancer Cells Hijack PRC2 at Ændre Multiple Cytokine Pathways

Abstrakt

Polycomb Undertrykkende Complex 2 (PRC2) er en epigenetisk regulator induceret i mange kræftformer. Det menes at drive tumorigenese ved at undertrykke division, stemness, og /eller udviklingsmæssige regulatorer. Kræft unddrage immun afsløring og diverse immun regulatorer forstyrres i forskellige tumorer. Det er uklart, hvordan en sådan celle-specifikke effekter koordineres. Her viser vi en dyb og cancer-selektive rolle for PRC2 undertrykke multiple cytokin pathways. Vi finder, at PRC2 undertrykker hundredvis af IFNy stimulerede gener (ISGs), cytokiner og cytokin-receptorer. Dette mål repertoire væsentligt udvidet i kræft vs ikke-kræftceller, og adskiller sig i forskellige typer kræft. PRC2 er derfor en højere orden regulator af immunsystemet i cancerceller. Inhibering PRC2 med enten RNAi eller EZH2 inhibitorer aktiverer cytokin /cytokinreceptor promotorer markeret med bivalent H3K27me3 /H3K4me3 chromatin, og forøger reagere på forskellige immune signaler. PRC2 hæmning redninger immune gen induktion selv i fravær af SWI /SNF, en tumor suppressor defekt i ~ 20% af humane cancere. Denne roman PRC2 funktion i tumorceller kunne dybt påvirke virkningsmekanisme og effekt af EZH2 hæmmere i kræftbehandlingen

Henvisning:. Abou El Hassan M, Huang K, Eswara MBK, Zhao M, Song L, Yu T et al. (2015) Cancer Cells hijack PRC2 til redigering Multiple Cytokine Pathways. PLoS ONE 10 (6): e0126466. doi: 10,1371 /journal.pone.0126466

Academic Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES

Modtaget: December 29, 2014 Accepteret: April 3, 2015; Udgivet: 1 juni 2015

Copyright: © 2015 Abou El Hassan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er tilgængelige fra GEO databasen under accessionsnummer GSE67766. Dette er en superseries nummer, og inden for dette datasæt der er individuelle filer for hele microarray, Chip-chip, og RNAseq data

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af RB: 703.079 canadiske Cancer Society (http: //www.cancer.ca/research), RB: MOP 74570 canadiske Institutes of Health Research (https://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html), RB: KF12-02 Krembil Foundation (http : //www.krembilfoundation.ca/), JJ: R01GM103893 National Institutes of Health (US) NIH (https://www.nih.gov/)

Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke eksisterer konkurrerende interesser.

Introduktion

Kræftceller anvende forskellige strategier til at unddrage immunsystemet, herunder regulering af cytokiner eller andre udskilles faktorer /receptorer, der styrer immunforsvaret [1]. Især den type, placering, og graden af ​​immun infiltrat i en tumor (den “Immunoscore”) forudsige resultatet bedre end en mangfoldighed af traditionelt anvendte tumor-centreret patologi parametre, såsom tumorklassificering [2]. De faktorer, der styrer immun overvågning varierer kontekstuelt og detaljerne er komplekse, fordi agenter, der fremmer immun clearance i én situation fremmer immunsuppression i en anden (revideret i [3]). En tiltalende opfattelse er, at tumorer kan udnytte en fælles mekanisme til at manipulere udtryk for immun regulatorer, og at hver tumor skræddersyr denne strategi, der passer til deres individuelle miljø. Forstyrre sådan et højere niveau regulerende netværk kunne give en generel strategi for at øge immune lokalisering og rydning af mange kræftformer. Men de mekanismer, der styrer det utal af immun gener, der påvirker overvågning er ikke godt forstået.

Polycomb Undertrykkende Complex 2 (PRC2) er den epigenetiske regulator, at indskud undertrykkende histon H3 lysin 27 (H3K27me3) mærker på kromatin. To af dets vigtigste komponenter omfatter den katalytiske underenhed EZH2, og SUZ12, stilladset proteinet kræves til komplekse stabilitet [4]. PRC2 er en del af Polycomb familie af regulatorer, der modvirker de positive transkriptionelle virkninger af Trithorax familiemedlemmer under udvikling, såsom SWI /SNF kromatin remodeling kompleks [5]. PRC2, som ofte overudtrykkes i cancer, antages at fremme tumorgenese gennem regulering af cellecyklussen, DNA-replikation, overlevelse, senescens og /eller stemness [5-7]. Hvorvidt og i hvilket omfang PRC2 kunne påvirke immunsystemet i tumorer er uklar.

Tidligere vi og andre viste, at BRG1, ATPase motor, der driver SWI /SNF, er nødvendig for reaktionsevne IFNy stimulerede gener (ISGs ) [8-11]. På

CIITA

locus, fandt vi, at BRG1 koordinerer virkningen af ​​mange distale forstærkere. Men trods afgørende på endogene locus og en stor 190 kb reporter, BRG1 er undværlig for IFNy induktion af korte

CIITA

journalister, der fører til den opfattelse, at det kan dæmpe virkningerne af en fjern repressor. I seneste arbejde, parallelt med den aktuelle undersøgelse, viste vi, at PRC2 og H3K27me3 dekorere

CIITA

locus, både på promotoren og mellem fjerntliggende forstærkere [12]. Fjernelse PRC2 lindres kravet om BRG1, og klar en fjern -50 kb forstærker, præcis som set med BRG1. Vi spekulerede på, om denne antagonisme mellem BRG1 og PRC2 kunne udvides til andre IFNy mål. IFNy spiller en afgørende rolle i immun-overvågning [13-20]. 20% af humane kræftformer mangler funktionelle SWI /SNF [21], og denne defekt eller opregulering af PRC2 kunne give en generel mekanisme til immun flugt i kræft. Desuden målretning af PRC2 til særskilte loci kunne hjælpe forme det specifikke immun program kræves i forskellige kræftformer.

Her viser vi, at PRC2 har en bred rolle i at undertrykke ISGs, og uventet, at det også har en dramatisk og kræft -selektiv rolle i reguleringen af ​​mange andre cytokine veje. Inhibering PRC2 med RNAi eller småmolekylære EZH2 inhibitorer genaktiveret ISG reaktionsevne, selv i SWI /SNF-deficiente cancerceller. Desuden omfattende RNAseq analyse afslørede, at forstyrre PRC2 aktiverer flere cytokin og cytokin receptor pathways. Denne funktion blev væsentligt udvidet i kræft

vs

. ikke-kræftceller, og kunne blokeres gennem farmaceutiske midler. PRC2 er således en højere orden regulator af immun veje i kræft, rettet mod cytokiner, deres receptorer, og downstream mål, og det tilpasser dette program i henhold til kræft type. Cytokiner har pleiotrope virkninger på tumorigenese [3,22], og kunne have en stor indflydelse på effekten af ​​EZH2 inhibitorer i human cancer.

Materiale og metoder

Cell Kultur og Adenovira

Celler blev dyrket som beskrevet [9] og behandlet med human IFNy (Invitrogen) i en koncentration på 0,1 mg /ml. SW-13-celler blev transduceret med adenovirus, der udtrykker GFP (Ad-GFP) eller GFP-BRG1 fusionsprotein (Ad-BRG1) beskrevet [9]. AdBRG1 virus blev titreret så BRG1 ekspression matches i HeLa-celler [9].

Små interfererende RNA (siRNA)

siSUZ12, siEZH2 og siCtrl opnåedes fra Qiagen, og siBRM fra Thermo Scientific . SW-13 celler på 2×10

6 pr 10 cm skål blev transficeret med 50 nM siCtrl, siSUZ12 eller siEZH2 alene eller med 75 nM siBRM i 3-4 dage ved hjælp DharmaFECT-1 (Thermo Scientific). Celler blev sub-dyrket ved 2×10

6 pr 10 cm skål og underkastet en anden transfektion cyklus, sikre en bedre H3K27me3 udtynding. Efterfølgende blev celler behandlet med 0,1 mg /ml humant IFNy i 6 timer.

Westerns

Westerns blev udført som beskrevet [23]. For antistoffer se S4 tabel.

RT-PCR og Expression Arrays

RNA blev revers-transkriberet og analyseret ved kvantitativ PCR. Værdier blev normaliseret for p-actin [9]. Primere er i S4 tabel. For udtryk arrays, blev RNA kvalitet kontrolleres ved hjælp Bioanalyzer (Agilent Inc.), omdannes til cDNA, efterfulgt af 2

nd streng syntese og cRNA forberedelse hjælp Ambion kit (Applied Biosystems). cRNA var kolonne-renset kvalitet kontrolleres ved hjælp Agilent Bioanalyzer. 1,5 ug blev hybridiseret til Illumina hel-genom udtryk arrays. AdGFP /BRG1 og siCtrl /siSUZ12 prøver blev hybridiseret til Menneske-WG6 Expression BeadChips og Menneske-HT-12 Expression BeadChips, henholdsvis (Illumina, Inc.). Differential udtryk analyse blev udført ved hjælp af gennemsnitlig normalisering af BeadStudio software (Illumina Inc). Tre biologiske replikater blev inkluderet for hver behandlingsgruppe.

chip qPCR, chip på chippen, og chip-seq

chip-qPCR-DNA blev udført som beskrevet [10,24]. Antistoffer og primere er i S3 S4, henholdsvis. Antistoffer blev tidligere valideret [25], og vi yderligere verificeret H3K27me3 og H3K79me3 antistoffer under anvendelse dot blots. For Chip-chip, blev immunopræcipiteret DNA forstærkes, mærkes, og hybridiseret til human 1M promotor flisebelægning arrays (Agilent). TileMap blev anvendt til at definere regioner med betydeligt beriget H3K27me3 [26], og intensiteter blev normaliseret til interne standarder. Toppe blev rangordnet efter deres test statistik værdi (maksimal TileMap-MA statistik: MAXM /P [26]). Metoder til at der er en MAXM /P cutoff er beskrevet i S1 Tekst (supplerende metoder). For yderligere oplysninger om analysen af ​​chip-seq data, se S1 Tekst (supplerende metoder).

RNA-sekventering

RNA kvalitet blev testet ved hjælp Bioanalyzer (Agilent). Oligo-dT perler blev anvendt til at isolere poly (A)

+ mRNA, og efter tilfældig fragmentering ~ 300bp RNA-fragmenter blev anvendt til fremstilling multiplexede cDNA-biblioteker under anvendelse Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit. High-throughput sekventering af biblioteker blev udført ved hjælp af Illumina HiSeq 2000 LTRI. Sekventering læser af hver prøve i fastq format blev vurderet med FASTQC, og pr basesekvens kvalitet og pr sekvens GC-indhold angivne data af høj kvalitet. Data blev afbildet på det humane genom (hg19) under anvendelse TopHat 1.4.1 der giver mulighed for op til to fejlparringer [27]. Ikke-unikt læser blev frafiltreret. Det læser count (eller samling) for hvert gen blev beregnet ved hjælp af en brugerdefineret R-baserede rørledning ((https://www.r-project.org). For yderligere oplysninger om, hvordan datakvaliteten og differentielt udtrykte gener blev vurderet se S1 tekst (Supplerende metoder og resultater)

Gene Set Berigelse Analyse

Vi udvundet gener med log

2Fold forandring . 0 og differentiale sandsynligheder 0,5 og rangeret SUZ12 undertrykt gener ved at nedsætte differential sandsynlighed værdier. Vi brugte GSEA Preranked funktionen til at analysere berigelsen af ​​de klassificeret gener på C2 gen sæt eksporteres fra Kegg pathway version 3.1 med generne i genet sæt identificeret af HUGO gen symbol. Vi valgte berigede veje med høj berigelse score (ES) ved en cutoff på nominelt P-værdi (NOM p-val) 0,01 og FDR q-val. 0,05 for “cytokin-cytokin receptor interaktion” (CCRI) vej, vi yderligere anvendt GSEA avancerede analyse at udtrække pathway medlemmer, der forklarer berigelse. Vi grupperet generne med deres dE sandsynlighed på tværs af de seks kræft cellelinjer på almindelige og forskelligt påvirkede gener i forskellige kræftceller inden for samme vej. Vi brugte Kegg pathway kort over CCRI vejen (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html, Kort 04060) til at generere diagrammer. Clustering analyse og visualisering blev udført med MeV (https://www.tm4.org/mev.html).

Cytokine Detection

For Suz12 knockdown, A549 celler blev behandlet i to cykler som pr ovenfor. For narkotika hæmning af EZH2 blev celler behandlet i to fire dages cykler med 2 uM GSK343 ​​eller UNC1999. Ved afslutningen af ​​hver behandling blev celler podet @ 3×10

4 /brønd i 96 brønd skåle. Cellerne fik lov at bundfælde i 4 timer og derefter de angivne koncentrationer af de forskellige stimuli (LPS, IFNy, IL1β og TNFa) blev tilsat. Kultursupernatanter blev opsamlet efter 24 timer og nedfrosset indtil anvendelse. ELISA blev udført i to eksemplarer hjælp IL6-, IL8- og CXCL10-ELISA Max Deluxe kits fra Biolegend. Multipleksanalyse af cytokiner i kultursupernatanter blev udført under anvendelse af humane primære Cytokine Array /chemokin Array 41-Plex assay fra Eve Technologies Corporation, Canada. Der blev udført tre uafhængige forsøg. Western blot-analyse blev udført for at sikre Suz12 banke ned og nedregulering af H3K27me3 efter hvert forsøg.

Resultater

Genom-Wide Antagonisme mellem BRG1 og PRC2 på IFNy Mål

SWI /SNF regulerer ISGs [8-11,28-30], men det funktionelle forhold med PRC2 er ukendt. At sammenligne mål genom-dækkende, blev BRG1-mangelfuld SW-13 celler transduceret med adenovirale vektorer, der udtrykker BRG1 (Ad-BRG1) eller GFP (Ad-GFP), eller transficeret med siCtrl eller siSUZ12, venstre ubehandlet eller IFNy-stimuleret i 6 timer og mikroarrays anvendes til at vurdere mRNA-niveauer. SUZ12 er en kerne-underenheden af ​​PRC2 og dets tab resultater i nedbrydning af den enzymatiske subunit, EZH2 [4]. Vi fokuserede på gener, hvor AdBRG1 eller siSUZ12 inducerede udtryk ≥ 2 gange (for en samlet oversigt data, se lagkagediagrammer i figur 1). En detaljeret diskussion af data og gen-klasser findes i S1 Tekst (se det første afsnit af supplerende resultater); sidstnævnte giver omfattende oplysninger om, i hvilken grad BRG1 og PRC2 regulerer basal og IFNy induceret genekspression. Slående, BRG1 rekonstitution eller siSUZ12 behandling forøget induktion af 87% (95/109) af ISGs, men påvirkede basal ekspression af kun ~ 2% af alle gener (Fig 1). Desuden for 2% af alle gener, hvis basale udtryk var påvirket, 14% (48/342) var co-reguleret af SWI /SNF og PRC2, mens 34% (32/95) af ISGs var co-reguleret. Effekten af ​​SWI /SNF og PRC2 om co-regulerede gener var antagonistisk. Real time PCR-analyse af 52 ISGs bekræftede den fremherskende BRG1-afhængighed i dette gen klasse (Fig A i S1 File), og siSUZ12 reddet svartid, med 5/7 BRG1-afhængige ISGs, mens BRG1-uafhængige ISGs eller kontrol gener var upåvirket (fig B, Panel B i S1 File). En anden SUZ12 siRNA også reddet BRG1-afhængige ISGs (Fig C i S1-fil). PRC2 udtømning marginalt inducerede BRG1-relateret protein BRM (Fig B, Panel A i S1 File). For at vurdere, om dette lille induktion kan forklare induktion af nogle ISGs vi bankede ned BRM. Dette yderligere trin havde ingen eller kun en svag effekt på redning af BRG1-afhængige ISGs ved siSUZ12 (Fig B, D i S1 File). Redning af ISG-responsivitet også var ikke på grund af induktion af endogene IFN’er, fordi RNAi behandling havde ingen virkning på STAT1 phosphorylerings- eller IRF1 proteinniveauer, enten i SW13-celler [12], eller i multiple andre cellelinjer (se nedenfor).

Mikroarrays blev udført med RNA fra SW-13 celler til at vurdere effekten af ​​BRG1-rekonstitution eller SUZ12 knockdown på basal udtryk for alle gener (A, 465 berørte gener) eller IFNy lydhørhed (B, 109 ISGs). Behandlinger er angivet i rød og blå over hver Heatmap, er genklasser angivet med farvede søjler til venstre for hver Heatmap, og cirklen grafer opsummere% af gener i hver klasse (i (A) grå = upåvirkede gener). En yderligere diagram til højre for Heatmap i (A) klassificerer gener baseret på: 1. IFNy lydhørhed (ISGs = 12), eller GO vilkår: 2. Udvikling (n = 118); 3. cellesignalering (n = 64); 4. Cell migration (n = 24). Gene Class Forkortelser: EXPN: Expression; Br: Brg1, Z: Suz12; S: Stimuleret; R: Fortrængning; I: Interferon-γ; G:. Gene

Hvis PRC2 direkte regulerer ISGs, disse mål skal udvise H3K27me3. Først, vi behandlet dette spørgsmål ved hjælp af chip-qPCR, oprettelse cutoffs til efterfølgende genom-dækkende analyse. Vi studerede 30 initiativtagere: 10 ISGs reddet af siSUZ12 eller BRG1, 6 ISGs reddet af siSUZ12 kun 6 ISGs reddet af BRG1 kun 3 ISGs upåvirket af siSUZ12 eller BRG1, og 5 positive kontroller til H3K27me3. IRF1, upåvirket af enten PRC2 eller BRG1, manglede H3K27me3 og fungerede som baseline (Fig E i S1 File). H3K27me3 blev påvist ved 15/16 af siSUZ12 regulerede ISG initiativtagere, men kun 4/9 af de ISGs upåvirket af siSUZ12 (Fig E, Panel A i S1-fil) (p 0,05, Fisher eksakt test), og H3K27me3 var signifikant højere på det tidligere (fig E, Panel B i S1 File).

genom-dækkende chip-chip afsløret ~ 1/5

th af initiativtagerne havde nogle H3K27me3 (mindst en 100 bp bin 1,5x over kontrol). Den gennemsnitlige H3K27me3 intensitet toppede +/- 1 kb omkring TSS alle gener (Fig F felt A, B i S1 File), og H3K27me3 niveauer anti-korreleret med basal udtryk (Fig F, Paneler C, D i S1 File), overensstemmelse med andre celletyper (anmeldt i [6]). Fokus på gener, hvor BRG1 og /eller siSUZ12 stimuleret udtryk, var dem med de højeste H3K27me3 niveauer undertrykkes af PRC2 (BRS /ZRG ZRG, Fig G, Paneler A-E i S1 File). Det gennemsnitlige niveau af H3K27me3 på ISGs svarede til den, der ses på alle tavse gener (sml Fig 2A og 2F, Panel A i S1 File). ~ 40% af ISGs havde nogle H3K27me3 (Fig 2B), som er ~ 2x mere end alle gener (sml fig F, Panel B i S1 File). Som på alle gener, niveauet og hyppigheden af ​​H3K27me3 korreleret med basal udtryk (Fig 2C og 2D). Desuden ved basalt tavse ISGs, niveauet og hyppigheden af ​​H3K27me3 var signifikant højere ved loci hvor siSUZ12 forbedret IFNy lydhørhed (fig 2E-2I, ZR-ISGs, BRS /ZR-ISGs).

Genom-dækkende chip -chip data blev anvendt til at vurdere H3K27me3 niveauer ISG promotorer. (A) chip-chip signal intensitet for 100 bp skraldespande inden for +/- 5 kb af TSS af alle 109 ISGs defineret i fig 1B. (B) Procentdel af H3K27me3 positive og negative ISG initiativtagere. (C) på chip-chip signalintensitet som i (A), men grupperet efter ISG basal ekspression. (D) Histogram af procentdelen af ​​H3K27me3 positive og negative ISGs i forhold til deres basale genekspression. (E) Farve kode basalt tavse ISGs analyseret i (F) – (H). (F) Heatmap viser basal H3K27me3 chip-chip signal inden for +/- 1 kb af TSS af de angivne basalt tavse ISG klasser. (G) chip-chip signal intensitet for 100 bp skraldespande inden for +/- 1 kb af TSS af basalt tavse ISGs. (H) Violin plot viser niveauet for den gennemsnitlige chip-chip signal. Stjerner angiver signifikant forskel (P 0,05, Mann Whitney-test) mellem de angivne grupper. (I) Histogram viser procentdelen af ​​H3K27me3 positive promotorer i hver angivet ISG klasse. *: Signifikant højere% af H3K27me3 positive ISGs mellem de angivne grupper (P 0,05, Fisher eksakte test). Gene Class Forkortelser: Br: Brg1, Z: Suz12; S: Stimuleret; R: Fortrængning; I: Interferon-γ; G: Gene

Sammen ovenstående udtryk og kromatin bindende data udsætte en omfattende, antagonistisk rolle for SWI /SNF og PRC2 i IFNy lydhørhed

PRC2 undertrykker Flere Immune Pathways i.. cancer Cells

for at vurdere den generelle relevans af vores resultater, vi udførte RNAseq analyse efter PRC2 udtynding i 8 kræft og 3 ikke-cancer-afledte cellelinier (cancer: A549, lungeadenokarcinom; Panc.04.03 AsPC1 , pancreas adenokarcinomer, PC3, prostatakræft, MCF-7 MDA-MB-231, brystkræft, HeLa, livmoderhalskræft, og SW-13, binyrebark kræft, ikke-cancer: 184-A1, bryst; BPH-1 prostata og Beas-2B lunge). Westerns afslørede, at SUZ12, EZH2 og /eller H3K27me3 niveauer typisk var forhøjet i kræft linjer sammenlignet med ikke-kræft linjer (fig H i S1 File). BRG1 /BRM niveauer varierede mellem kræft og ikke-kræft linjer med de laveste i A549, AsPC1, Panc.04.03 og 184A1 (Fig H i S1 File). EZH2 og SUZ12 niveauer korreleret med hinanden, men ikke med bulk-H3K27me3, og PRC2 og BRG1 eller BRM niveauer var ukorrelerede (fig H, Panel B i S1 File). Disse variable resultater understreger betydningen af ​​funktionelle undersøgelser for at udlede effekten af ​​PRC2 på genekspression fordi blot at vurdere niveauet af komplekset eller mærket afslører lidt om sin rolle i kræft eller ikke-kræftceller.

Celler blev behandlet med siCtrl eller siSUZ12 og venstre ubehandlet eller udsættes for fysiologisk relevante koncentrationer af IFNy (0,2 ng /ml), der kan sammenlignes udskilt af NK-celler eksponeret for tumorceller [31,32]. SUZ12-udtømning reduceret H3K27me3 i alle celletyper, og øget H3K27ac i nogle (HeLa, MDA-MB-231, PC3), men påvirkede ikke SWI /SNF underenheder (fig I i S1 File). Næste RNA-seq assays blev kørt for at vurdere effekten af ​​SUZ12 knockdown på basal eller IFNy-induceret genekspression (44 analyser, 4 betingelser x 11 linjer), og resultaterne valideret ved anvendelse principal komponent analyse og korrelationsanalyse. Virkningen af ​​banker ned SUZ12 på genekspression blev også bekræftet med en backup siRNA mod SUZ12. For en fuld diskussion henvises til afsnittet “Validering af RNAseq data” i S1 Tekst (supplerende Resultater), som henviser til de validering af data i fig J-M i S1 Filer, og S2 tabel.

I overensstemmelse med blev observeret en bred rolle for PRC2 på ISGs, SUZ12-undertrykt ISGs (ZR-ISGs) på tværs af flere cellelinjer (fig 3, fig N i S1 File, S2 Table). Blandt de to mest talrige ISG kategorier (ZR-ISGs og ISGs ikke påvirket af SUZ12 (N-ISGs)), der var cellespecifikke forskelle i absolutte antal af ZR-ISGs (interval 13-152, gennemsnitsalder 70, median 43), men siSUZ12 forbedret induktion af mellem 13% og 77% (gennemsnit 45%, median 43%) i 7/8 cellelinier (figur 3). Disse værdier er konservative, da der var andre mere komplekse lavere overflod gen klasser, hvor SUZ12 ramt ISG udtryk (S1 tabel). Mest N-ISGs (68%) og ZR-ISGs (72%) var specifikke for hver celletype (fig O i S1 File), hvilket indikerer, at der ud over et kernesæt, hver linje inducerer en tydelig ISG cocktail. Dette er i overensstemmelse med den kontekst-specifikke karakter immun overvågning [3], og med celle-specifikke kromatin binding af PRC2 [33]; faktisk af generne undertrykkes af SUZ12 alene (ZRG-N), 77% var unik for en cellelinje (fig O i S1 File). Også den del af ZR-ISGs var lavere i ikke-kræft versus kræft linjer, med de tre ikke-cancer linjer rangeret 7

th, 8

th, og 11

th blandt alle 11 linjer vurderes ( S1 tabel). Salg

Heatmaps viser virkningen af ​​de fire behandlinger (kolonne 1-4, indtaster tabel til højre) på ISG ekspression i et panel af lunge, bugspytkirtel, bryst, cervical, adrenokortikalt og prostatacancercelle linjer. Celler blev transficeret med siCtrl eller siSUZ12 og efterladt ubehandlet eller stimuleret med IFNy i 6 timer. ISGs sorteres i SUZ12-undertrykte ISGs (Zr-ISGs, gul) og ISGs som ikke er reguleret af PRC2 (N-ISGs, grøn). Procentdelen af ​​Zr-ISGs og N-ISGs er vist i pie diagrammer over hver Heatmap, og det samlede antal ISGs per linie er angivet under hver Heatmap.

Næste, vi henvendte os til effekten af PRC2 udtømning på basal genekspression. Vores microarray analyse i SW13 adrenal carcinomceller afslørede ikke en fremtrædende effekt på immun gener, indtil vi behandlet med IFNy (figur 1), men vi spekulerede på, om der kan være en mere fremtrædende effekt på basal udtryk for immun veje i andre typer kræft. For at dechifrere de vigtigste veje er ramt, vi brugte Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) [34]. Påfaldende, siSUZ12 inducerede den basale ekspression af multiple immune komponenter i 6/8 cancer linjer, hvoraf den “cytokin /cytokinreceptor interaktion” (CCRI) gensæt blev berørt i alle 6 linier (fig 4 og 5), og i 4 linier den CCRI klassen var toppen eller anden rangerede gen sæt (* i fig P i S1 File). Disse resultater blev valideret for flere gener med to siRNAs mod SUZ12 (S2 tabel). Blandt de seks kræft linjer, hvor CCRI gen sæt blev induceret, 61% af generne var opreguleret specifikt i 1 eller 2 af cellelinier (Fig Q i S1 File). Således PRC2 ikke kun regulerer ISGs, men dens effekt på immunsystemet i cancerceller omfatter mange cytokiner og cytokin-receptorer, og beslægtet med ISGs, det påvirker forskellige CCRI gener i forskellige kræft sammenhænge.

Oversigt over GSEA analyse af gener differentielt induceret af siSUZ12 forhold til siCtrl i 6 cancer og 4 ikke-cancer afledte cellelinier. Cellelinier indgår i Heatmap er angivet til højre; en signifikant signal er indikeret med gråt. Lignende biologiske veje er grupperet, og fremhævet med en tydelig farve til højre, og deres generelle klasse navn angives til venstre.

A. Heatmap af CCRI gener betydeligt fremkaldt af siSUZ12 (Differential Sandsynlighed 0,9) i 11 cellelinjer (ikke-kræft grøn, kræft blå). For cellelinje navne svarer til hvert nummer se (F). Blå stjerner i dette og de efterfølgende paneler angiver cellelinjer, hvor CCRI vej var signifikant beriget ifølge GSEA. BE Heatmaps af delmængder af dataene i (A) adskilt af vævstype: B. Breast (184 non-cancer

vs

MCF7 og MDA-MB-231 cancer.), C. Lunge (Beas-2B non -cancer

vs

. A549 kræft), D. Prostata (BPH-1 ikke-cancer

vs

. PC-3 kræft), og E. en anden 4 cancer cellelinier af pancreas (Panc .04.03 og AsPC1), livmoderhalskræft (HeLa) og binyrebark (SW-13) oprindelse. F. Hyppigheden af ​​inducerede CCRI gener på tværs af alle 271 CCRI gener i hver cellelinie.

I skarp kontrast til kræft linjer, har siSUZ12 ikke berige for immun gen sæt i ikke-cancer bryst, prostata og lunge linjer (fig 4, fig Q i S1 File). At udvide denne analyse, vi brugte GSEA at analysere offentliggjorte RNAseq data fra SUZ12-knockdown i humane HEK-293T-celler [35]. Disse er ikke-cancer-afledte celler af neural oprindelse, der udtrykker virale onkogener, men blev transformeret

in vitro

, uafhængigt af immunsystemet [36]. GSEA afslørede, at PRC2 udtømning ikke signifikant indflydelse CCRI eller andre immune veje (Fig 4). Således PRC2 ændret CCRI veje betydeligt i 6/8 kræftceller, men 0/4 ikke-kræft sammenhænge. PRC2 udtømning opreguleret nogle CCRI gener i ikke-cancer afledt cellelinjer, men færre end i kræftceller, utilstrækkelig til at opnå betydning i GSEA, og de berørte gener var tydelig i kræft vs non-cancer linjer fra matchende væv (figur 5) . Disse data viste en bred rolle for PRC2 i reguleringen af ​​immunsystemet, som er ændret og udvidet betydeligt i kræft.

SUZ12 Knockdown inducerer Gener med Bivalente Initiativtagere

For at definere, om PRC2-medieret repression af siSUZ12-inducerede gener, især CCRI underklasse, er direkte, vi minerede H3K27me3 chip-seq data for A549 lunge- kræftceller, og sammenlignet det med vores RNAseq data +/- siSUZ12 (fig 6A). Sideløbende sammenlignede vi H3K4me3 distribution, som markerer aktive eller poised promotorer. Unsupervised klyngedannelse identificeret 10 forskellige H3K27me3 /H3K4me3 mønstre. Mest inducerede siSUZ12 gener, herunder CCRI delmængde var i klynger 1-4, med omfattende H3K27me3 promotor dækning (Fig 6A-6D). Men de fleste gener med høj promotor H3K27me3 ikke svare siSUZ12 (Fig 6A), hvilket understreger betydningen af ​​at måle virkningen på genekspression. Især den gennemsnitlige H3K4me3 signalet var betydeligt højere tværs siSUZ12-responsive gener, herunder CCRI delmængde, sammenlignet med gener, der var upåvirket af siSUZ12 eller 1000 tilfældige gener sæt (Fig 6E). Således gener, der induceres følgende PRC2 forstyrrelser har en bivalent H3K27me3 /H3K4me3 signatur, og siSUZ12 inducerede CCRI gener er typisk for denne gruppe.

Chip-seq data fra A549-celler blev anvendt til at vurdere kromatin varemærker siSUZ12 inducerede gener. A. Unsupervised K-betyder klyngedannelse blev udført på H3K27me3 og H3K4me3 signaler, og plottet som varmekort omkring TSS (for flere detaljer se “chip-seq dataanalyse i S1 Text, supplerende metoder). De 10 resulterende klynger (Cluster ID (CID) 1-10) er afbildet i rækkefølge efter gennemsnitlig log2Fold ændring i genekspression efter siSUZ12 behandling som vist i dot plots til højre. På dot plot, alle gener (venstre) eller CCRI gener (til højre) viser log2Fold ændring for hvert gen; røde punkter angiver gener signifikant induceret af siSUZ12 (Differential sandsynlighed 0,9). Basal udtryk vises helt til højre (lysegrå: lav, grå: medium; mørkegrå: høj). B. Viser genklynger afsløret i panel A. Andel af alle gener induceret af siSUZ12 (rød) i CIDs 1-4, eller 5-10 (som vist i dot plots i A). C. Andel af CCRI pathway gener fremkaldt af siSUZ12 (rød) i kunde-id’er 1-4 (rød omrids) eller 5-10 (blå omrids). D. Gennemsnitlig H3K27me3 chip signal omkring TSS for de angivne grupper af gener (Key til højre, ZR-Genes: alle SUZ12 undertrykt gener, N-Genes: ikke berørt af siSUZ12; ZR-CCRI: CCRI gener, der er SUZ12-undertrykt N-CCRI: CCRI gener ikke er berørt af SUZ12; Rand: 1000 tilfældige gen-apparater, n = median af de andre fire gen sæt). E. Samme som (D) med undtagelse af H3K4me3 CHIP signaler i kunde-id’er 1-4 (dvs. dem med høj H3K27me3).

Small Molecule EZH2 Inhibitors Augment Multiple Immune Pathways

Vores data hæve den mulighed, at lægemidler, der hæmmer PRC2 kan øge immunforsvaret pathway aktivering i kræftceller. Når fire cancer cellelinjer blev behandlet med 2 pM GSK343 ​​[37] eller UNC1999 [38], enten narkotika markant reduceret H3K27me3 niveauer (Fig R i S1 File). RT-PCR-analyse viste, at ud af 8 SUZ12-undertrykte ISGs (ZR-ISGs) i 4 cellelinier (32 tilfælde) UNC1999 augmented IFNy-responsivitet i 30 tilfælde (94%) og GSK343 ​​gjorde det i 15 (50%) (fig S i S1 fil). Behandlingen havde ingen effekt på ikke-ISGs såsom

PITX2

eller

HPRT

eller på mRNA eller protein niveauer af IRF1, en PRC2-uafhængig ISG (fig R, S i S1 File). UNC1999 inducerede mRNA i højere grad end GSK343 ​​trods tilsyneladende lignende virkninger på store H3K27me3 niveauer. Dette kan afspejle små forskelle i kinetikken og /eller samlede H3K27me3 udtømning ved specifikke enhancere eller promotorer, som ikke ville afsløret ved Western-analyse af totalt H3K27me3. Uanset, disse data viser, at EZH2 hæmmere, ligesom siSUZ12, forøge mRNA induktion af PRC2-undertrykte ISGs.

Endelig har vi vurderet, om PRC2 hæmning øger cytokin induktion som reaktion på andre immun signaler og om disse virkninger observeres på proteinniveauet. For dette, vi behandlede A549 lunge kræftceller med TNF, IL1β,

E

.

coli

lipopolysaccharid (LPS), samt IFNy, og vurderet sekretion af cytokinerne CXCL10, IL6 og IL8 . I modsætning mRNA induktion, alene PRC2 inhibering forstærkede ikke proteinniveauer men når celler blev udsat for en af ​​de fire immune signaler, siSUZ12 eller UNC1999 augmented cytokin protein induktion (fig 7A-7C, Fig T i S1 File, S2 Table). Disse data er i overensstemmelse med den veletablerede, post-transkriptionel regulering af cytokinproduktion at forebygge negative immunreaktioner, såsom kronisk inflammation. For eksempel, i tillæg til gentranskription (inden den direkte styring af PRC2), cytokiner også tæt reguleret på niveauet for mRNA-stabilitet og /eller translation gennem motiver såsom AU-Rich Element (ARE), Konstitutiv Decay Element (CDE ), Coding Region determinant af ustabilitet (CRD) og flere andre [39]. Vores resultater antyder, at PRC2 regulerer den transskriptionelle komponent, men ikke den post-transkriptionel kontrol, der kræver en ekstra signal fra immunsystemet.