PLoS ONE: Overekspression af Lin28 Formindsker kemosensitivitet af mavekræft celler til Oxaliplatin, Paclitaxel, doxorubicin, og fluoruracil i del via microRNA-107

Abstrakt

Højere Lin28 udtryk er forbundet med dårligere patologiske tumor responser i lokalt avancerede gastric kræftpatienter i neoadjuverende kemoterapi. Men de særlige kendetegn ved Lin28 og dens virkningsmekanisme i kemoterapi modstand er stadig uklart. I denne undersøgelse fandt vi, at transfektion af Lin28 i gastriske cancerceller (MKN45 og MKN28) øgede deres modstand mod de kemo-drugs oxaliplatin (oxa), paclitaxel (PTX), doxorubicin (ADM), og fluorouracil (5-FU) sammenlignet med gastrisk cancer celler transficeret med en kontrolvektor. Når knockdown Lin28 ekspression ved Lin28 lille interfererende RNA (siRNA) blev evalueret in vitro, fandt vi, at modstanden mod kemo-drugs blev reduceret. Endvidere fandt vi, at Lin28 opregulerer C-myc og P-gp og nedregulerer valsens D1. Endelig fandt vi, at miR-107 er et mål microRNA af Lin28 og at det deltager i mekanismen for kemoterapi modstand. Vores resultater tyder på, at Lin28 /miR-107 vej kunne være en af ​​mange signalveje, der reguleres af Lin28 og forbundet med mavekræft kemo-modstand

Henvisning:. Teng R, Hu Y, Zhou J, Seifer B, Chen Y, Shen J, et al. (2015) Overekspression af Lin28 Formindsker kemosensitivitet af mavekræft Cells til Oxaliplatin, Paclitaxel, doxorubicin, og fluoruracil i del via microRNA-107. PLoS ONE 10 (12): e0143716. doi: 10,1371 /journal.pone.0143716

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: Juni 23, 2015; Accepteret: November 8, 2015; Udgivet: December 4, 2015

Copyright: © 2015 Teng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. der blev ydet støtte af Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of KINA: LQ13H160014 [https://www.zjnsf.gov.cn/b/home.aspx] .

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Gastrisk kræft er en fælles klinisk fordøjelsessystem ondartet svulst med en dødelighed, der rangerer tredje i verden [1]. Vores land er et område, der er udsat for mavekræft. I de senere år har neo-adjuvant kemoterapi blevet administreret til mavecancerpatienter at forlænge overlevelse. Ikke desto mindre, den 5-års overlevelse på dem med fremskreden mavekræft er stadig lavere end 30% [2]. Kemoterapi modstand er den hyppigste årsag til svigt af gastrisk cancer og andre tumorbehandlinger. Derfor mekanismen for kemoterapi modstand af gastrisk cancer er i øjeblikket et stort problem i gastriske undersøgelser cancerpatienter.

Lin28 er et højt konserveret RNA-bindende protein, der har vist sig at deltage i induktion af pluripotente stamceller og opretholdelse stamceller celle-lignende celler i cancer. Nylige undersøgelser har rapporteret, at afvigende aktivering af Lin28 korrelerer godt med prognosen af ​​forskellige cancere, herunder bryst-, ovarie-, lunge-, tyktarms-, og leverkræft [3-6]. Vores tidligere undersøgelse viste, at Lin28 ekspression også er forbundet med ringe overlevelse i mavecancerpatienter [7], og en anden undersøgelse viste, at ekspressionen af ​​Lin28 er korreleret med paclitaxel resistens i humane brystcancerceller [8]. Desuden er Lin28 udtryk forbundet med patologisk tumor respons i lokalt avancerede gastric kræftpatienter i neo-adjuverende kemoterapi. Men den molekylære mekanisme bag disse fund er fortsat uklart, [9].

Lin28 fremmer tumorigenese ved at undertrykke tumor suppressor miRNA såsom lad-7-familien, som er forbundet med lægemiddelresistens [8]. Men som et mål miRNA af Lin28, miR-107 er sjældent nævnt som et lægemiddel modstand faktor i mavekræft. MIR-107-ekspression er nedsat hos en række forskellige maligniteter, såsom coloncancer, hoved- og halscancer, pancreascancer og gastrisk cancer [10-13]. MIR-107 regulerer nedstrøms gener, som er involveret i celle differentiering og proliferation, stofskifte, stressreaktioner og dannelsen af ​​blodkar [10-14]. I denne undersøgelse undersøgte vi Lin28 /MIR-107-vejen og dets rolle i gastrisk cancercellelinie resistens mod kemoterapi. Vi kan have identificeret en ny potentielt mål for kemoterapi-resistent mavekræft.

Materialer og metoder

1. Celledyrkning og plasmid transfektion

De humane mavekræft cellelinjer MKN-28 og MKN-45 blev opnået som en gave fra professor Sung Hoon Noh (Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea). Cellerne blev dyrket i RPMI 1640 medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (MP Biomedicals, Costa Mesa, CA, USA) i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO2 ved 37 ° C. Oxaliplatin, paclitaxel, doxorubicin, og fluoruracil blev anskaffet fra Sigma (St. Louis, MO). Plasmidet pcDNA3.1-Lin28 blev transficeret med Xtreme GENE HP DNA-transfektion Reagent (Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland) ifølge producentens protokol. Stabile Lin28-udtrykkende kloner blev yderligere udvalgt og dyrket med det passende neomycin-holdige RPMI 1640 medium.

2. Real-time kvantitativ PCR

Real-tid q-PCR-analyser blev udført med ABI Prism 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kort fortalt blev en 20-pi reaktionsblanding indeholdende 2 pi cDNA skabelon og 1 pi af hver af sense- og antisense-primere (Promega Gotaq q-PCR® Master Mix-system, Madison, WI, USA) amplificeret som følger: denaturering ved 95 ° C i 10 minutter og 40 cykler ved 95 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 40 s. Real-time q-PCR-reaktioner blev udført tre gange for hver prøve, og middelværdien blev anvendt til beregning mRNA-niveauer. Kvantitativ analyse blev udført under anvendelse af komparativ CT-metoden. De Lin28 og miR-107 kopi numre i tumorvæv blev normaliseret til mRNA kopiere numre af husholdning gen glyceraldehyd 3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) for at opnå værdien 2

-Δ CT. Primersekvenserne er som følger i tabel 1.

3. Celle Drug-resistens Assay

Cellelevedygtighed blev målt ved anvendelse af en MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid] assay (Amresco, Solon, OH, USA) ifølge fabrikantens protokol. Celler blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 5 * 10

3 celler pr. Efter behandling blev cellerne inkuberet med 5 mg /ml MTT i 4 timer. Derefter blev mediet fjernet og blev tilsat 150 ml steriliseret DMSO-opløsning, efterfulgt af inkubation ved 37 ° C i 4 timer. OD-værdien blev opnået ved bølgelængderne 570 nm og 630 nm. OD-værdien (570 nm til 630 nm) kan indirekte afspejler celletallet og aktivitet efter følgende formel: overlevelsesrate = doseret gruppe OD570-630 /nej dosisgruppe OD570-630. En celle overlevelse /lægemiddelkoncentration kurve blev derefter genereret.

4. Western Blot analyser

Cellelysater blev separeret ved elektroforese på en 4-15% natriumdodecylsulfat-polyacrylamid gradient minigel (SDSPAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA) og overført elektroforetisk til en nitrocellulosemembran (Amersham Pharmacia , Piscataway, NJ). Western blots blev probet med antistoffer mod Lin28, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), caspaser og spaltede caspaser, cyklin D1, NF-kB (Cell Signaling, Beverly, MA), CDK6, C-myc (Abcam Trading ( Shanghai) Company, Shanghai, Kina), P-gp, og Bcl-2 (Huan Biotechnology, Beijing, Kina). Proteinbåndene blev detekteret ved forøget kemiluminescens (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ).

5. Flowcytometrisk Assay

Celler (2 * 10

5 per brønd) blev udpladet i en seks-brønds plade og behandlet med paclitaxel. Efter 72 timer blev cellerne fikseret i 70% ethanol og farvet med propidiumiodid (PI). DNA-indholdet blev analyseret med en Epics Profile II flowcytometer (Beckman Coulter, Fullerton, CA) med Multicycle software (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA). Alle forsøg blev gentaget mindst to gange. PI blev også anvendt sammen med Annexin V (BD Biosciences, San Jose, CA) at bestemme, om cellerne var levedygtige, apoptotiske eller nekrotiske.

6. MiRNA Transfektion og Detection

Celler blev udpladet i seks-brønds dyrkningsplader og transficeret med 50 nM pre-MIR-107 købt fra Applied Biosystems (Carlsbad, CA) eller kontrol præ-miRNA ifølge fabrikantens protokol. Kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (PCR) blev udført under anvendelse af TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit og Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokoller. Den fold ændring i miR-107 microRNA-niveauer blev beregnet og normaliseret til en HSA-mir-423 lastning kontrol.

7. Dyr

BALB /c mus i alderen 3-4 uger vejer 18-22 g blev købt fra SLAC forsøgsdyr selskab (SCXK-2007-004, Shanghai, Kina) og husede fem pr bur i en SPF- (SPF) miljø. Dyrene fik lov at akklimatisere til huset faciliteter i 7 dage før forsøgene begyndte. procedurer håndtering af dyr blev udført i overensstemmelse med P. R. Kina lovgivning om anvendelse og pleje af forsøgsdyr og godkendt af Experimental Animal Etisk Komité Zhejiang University (Zhejiang, Kina).

8. Xenograft Assay og behandling

Kort fortalt grupper af seks BALB /c-mus blev injiceret subkutant med 1 * 10

6 MKN45 /Lin28, MKN45 /Vector, eller MKN45 celler i højre flanke. Tumoren volumen blev beregnet ved hjælp af formlen: V = 1/2 *

en

*

b

2, hvor

en

b

er den længste og den korteste diametre af tumormassen (i mm), hhv. Når tumorerne nåede ca. 80 mm

3, blev musene behandlet med injektion af ADM (50 mg /kg) og OXA (5um /kg) hver uge i 2 uger. Kvantitative ændringer i kropsvægt og tumorvolumen blev målt hver tredje dag af en enkelt person ved anvendelse af en balance og Vernier skydelære. Ingen bedøvelsesmidler blev brugt i musen eksperimenter.

9. Statistisk analyse

Alle forsøgene blev udført tre gange med tredobbelte prøver. Variansanalyse og t-test blev anvendt til at sammenligne værdierne af test- og kontrolprøver. En P-værdi mindre end 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant. Statistica 6.1 software blev anvendt til alle statistiske analyser. Betydningen blev evalueret af den studerende t-test.

Resultater

1. In vitro test af kemoterapi følsomhed ændringer gastriske kræftceller stabilt udtrykker Lin28

To stammer af mavekræft celler med negativ Lin28 udtryk (MKN45 og MKN28) blev udvalgt og dyrket. Vi identificerede gastriske cancerceller med stabil Lin28 ekspression fra resistente transficerede kloner (MKN45 /Lin28 /C2 og MKN28 /Lin28 /C3) anvendelse af Western blotting og q-PCR (figur 1).

(A). Gastrisk cancer cellelinje MKN45 og MKN 28 med Lin28 overekspression foregik via Lin28 plasmid transfektion blev Lin28 ekspression detekteret ved Western-blot. (B). mRNA niveau af Lin28 blev påvist ved QRT-PCR, hvert datapunkt repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. (** P 0,01). (C). MKN45 med Lin28 overekspression viste øget modstand mod OXA, PTX, ADM, 5-Fu. (D). MKN28 med Lin28 overekspression viste øget modstand mod OXA, PTX, ADM, 5-Fu.

Den valgte MKN45 /Lin28C2, MKN45 /Vector, MKN45, MKN28 /Lin28C3, MKN28 /Vector, og MKN28 celler blev testet for kemoterapi stof modtagelighed. Vi valgte følgende fire almindeligt anvendte kliniske kemoterapi lægemidler til behandling af mavekræft: OXA, PTX, ADM, og 5-Fu. Behandling med OXA, PTX, og ADM varede i 48 timer, mens 5-FU behandling varede i 72 timer. Efter Lin28 transfektion, MKN45 og MKN28 celler havde en nedsat følsomhed over for OXA, PTX, ADM, og 5-Fu, at de fleste blev udtalt for OXA og PTX. IC50-værdierne var mere end dobbelt så stor som kontrolgruppen (figur 1).

På grundlag af MTT-assayet anvendte vi flowcytometri til at detektere forskelle i apoptose mellem Lin28-positive og Lin28-negative celler efter kemoterapi PTX eksponering. Den MKN45 /Lin28, MKN45 /Vector og MKN45 cellegrupper modtaget 0 pM og 0,1 pM PTX behandling i 24 timer, og dobbelt-farvning blev udført for at detektere celle apoptose. Den apoptotiske sats af transficerede Lin28 celler var lavere end den for ikke-transficerede celler (p 0,05). Desuden Western blots af protein opsamlet fra celler behandlet med 0,1 pM PTX viste, at apoptose blev reduceret i MKN45 /Lin28 celler som vist ved fald i aktiveringen af ​​caspase 9 og caspase 3 (fig 2).

( A) og (B). Apoptose på MKN45 /Lin28, MKN45 /Vector, MKN45 behandlet med PTX på 0.1um blev vist. Data viste MKN45 /Lin28 havde mindre apoptose end MKN45 /Vector og MKN45. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. (* P 0,05). (C). Cleaved- caspase9 og caspase3 blev påvist ved Western blot. Cleaved- casepase 9 og casepase 3 blev nedsat i MKN45 /Lin28.

Transient transfektion af siRNA-Lin28 bør hæmme Lin28 ekspressionsniveauerne i MKN45 /Lin28 og MKN28 /Lin28 celler 48 timer efter overførsel i overensstemmelse med den eksperimentelle retningslinjer fra producenten reagens. Lin28 proteinekspression blev detekteret, og den tilknyttede lægemiddelfølsomhed blev testet. Lin28 RNA-ekspression i gastriske cancerceller blev påvist ved q-PCR, medens proteinekspression blev detekteret ved western blotting (fig 3).

(A) .MRNA niveau af Lin28 efter Lin28 knockdown blev påvist ved QRT-PCR på 48 timer, 72 timer efter transfektion i MKN45 /Lin28 C2 og MKN28 /Lin28 C3. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. (** P 0,01, * p 0,05). (B). Protein niveau af Lin28 i MKN45 /Lin28 C2 og MKN28 /Lin28 C3 blev påvist ved western-blot 72 timer efter Lin28-siRNA transfektion. (C). Chemo-følsomhed MKN45 /Lin28 og MKN28 /Lin28 til OXA, PTX og ADM ved MTT assay efter Lin28 udtryk blev knockdown. (D) og (E) .Apoptosis forandring blandt MKN45 /Lin28 /SI-Lin28, MKN45 /Lin28 /SI-kontrol, MKN28 /Lin28 /SI-Lin28, MKN28 /Lin28 /SI-kontrol ved OXA 3.2ug /ml, PTX 1uM.After Lin28 var knock-down, blev apoptose af MKN45 /Lin28 faldet. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. (* P 0,05)

Q-PCR viste, at Lin28 mRNA ekspression i MKN45 /Lin28 /SI-Lin28 (48 h) og MKN45 /Lin28 /SI-Lin28 (72 h) celler var. meget lavere end i MKN45 /Lin28 /si-kontrolceller (p lt; 0,01). Denne transfektion effekt blev også bekræftet i MKN28 /Lin28 celler. Western blotting viste, at Lin28 si-RNA signifikant hæmmet Lin28 proteinekspression i MKN45 /Lin28 og MKN28 /Lin28 celler.

Et MTT-assay blev udført på de fire celletyper (MKN45 /Lin28 /SI-kontrol, MKN45 /Lin28 /SI-Lin28, MKN28 /Lin28 /SI-kontrol, og MKN28 /Lin28 /SI-Lin28 celler), der blev transficeret med Lin28 siRNA i 48 timer for at vurdere kemoterapi følsomhed. Vi valgte at bruge kemoterapi narkotika, der havde de mest udtalte effekter i den præ-test: OXA, PTX og ADM. Vi valgte en koncentrationsgradient på 5-6 ifølge de foreløbige resultater af indledende forsøg. Interferens af siRNA reducerede udtryk for Lin28, og Lin28-positive cellelinjer havde en øget følsomhed over for kemoterapeutiske stoffer (Fig 3).

Vi næste opdaget følsomheden af ​​celler til forskellige kemoterapi narkotika efter nedregulering af Lin28 . Celler var inddelt i 4 grupper, MKN45 /Lin28 /SI-kontrol, MKN45 /Lin28 /SI-Lin28, MKN28 /Lin28 /SI-kontrol og MKN28 /Lin28 /SI-Lin28, og blev testet med kemoterapi narkotika OXA og PTX henholdsvis . De kemoterapi narkotika koncentrationer (OXA 3,2 mikrogram /ml og PTX 1 uM) blev udvalgt i henhold til resultaterne af indledende forsøg. Antallet af apoptotiske MKN45 /Lin28 og MKN28 /Lin28 celler var mindre end den for MKN45 /Lin28 /SI-Lin28 og MKN28 /Lin28 /SI-Lin28 celler (p 0,05). Dette resultat indikerer, at nedregulering af Lin28 ekspression kan øge celle apoptose (figur 3).

2. De molekylære mekanismer, som Lin28 ændringer i kemoterapi følsomhed

Vi har detekteret lægemiddelresistens-relateret genekspression niveauer ved q-PCR i MKN45 /Lin28 og MKN45 /vektor cells.P-gp, og c-myc RNA-niveauer var markant forøget og cyclin D1 RNA-niveauet blev reduceret, mens andre Bcl-2, CDK6, NF-kB, TOP II viste ikke signifikant forskel mellem MKN45 /Lin28 og MKN45 /vektor cells.Also disse medikamentresistens-relateret genekspressioner blev undersøgt ved western blot i MKN45 /Lin28 og MKN45 /Vector celler, som viste konsistent tendens, P-gp og C-myc proteinekspression steget mens cyclin D1 faldet. Imidlertid Bcl-2-ekspression faldt, havde NF-kB-ekspression ikke ændre sig, og ekspression af cyclin D1 og proteinkinasen CDK6 blev reduceret (figur 4).

(A) .Differential ekspression af lægemiddelresistens-associerede protein mellem MKN45 /Lin28 og MKN45 /Vector. (B) og (C) .P-gp og C-myc ekspressionsniveauet blev reduceret i både protein og RNA-niveauer efter Lin28 knockdown i MKN45 /Lin28 celle, mens cyklin D1-ekspression blev øget. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. (** P 0,01, * p 0,05).

Efter Lin28 ekspression blev hæmmet af transfektion med Lin28 siRNA blev RNA-niveauer af P-gp, C-myc og cyclin D1 revurderes. Efter reduktion i RNA niveau af Lin28, P-gp og C-myc var signifikant nedreguleret, mens cyclin D1 niveauet steget betydeligt. Påvisning af P-gp, c-myc, og cyclin D1-ekspression ved Western blotting viste, at efter inhibering af Lin28 ekspression, P-gp og C-myc proteinekspression var signifikant nedreguleret, mens ekspressionen af ​​cyclin D1 blev signifikant opreguleret ( fig 4).

3. MIR-107 er målet microRNA af Lin28

Mens teste Lin28 RNA og miR-107 niveauer i gastrisk cancer cellelinjer, fandt vi gensidig hæmning af Lin28 og miR-107 i MKN45 og AGS cellelinjer. Derudover miR-107 blev nedreguleret i MKN45 /Lin28 og MKN28 /Lin28 celler. Knockdown af ekspressionen af ​​Lin28 vendt denne inhibering. I et opfølgende eksperiment, Lin28-positive celler, MKN45 /Lin28 og MKN28 /Lin28, blev transficeret med pre-mir-107 og blev efterfølgende benævnt MKN45 /Lin28 /pre-miR-107 og MKN28 /Lin28 /præ- mIR-107 celler. Transficerede pre-miR-kontrol celler blev kaldt MKN45 /Lin28 /pre-miR-Control og MKN28 /Lin28 /pre-miR-Control. Anti-miR-107 eller kontrol transfektioner i Lin28-negative celler, MKN45 /Vector, gav MKN45 /Vector /anti-miR-107 og MKN45 /Vector /anti-miR-Control celler. Otteogfyrre timer efter transfektion blev RNA indsamlet og udsat for q-PCR til påvisning af forskellene i miR-107-ekspression i MKN45 /Lin28, MKN28 /Lin28, MKN45 /Vector, og MKN28 /Vector celler. Virkningen af ​​knockdown af Lin28 ekspression ved Lin28 siRNA blev også bedømt. Efter transfektion med Lin28, miR-107-ekspression var signifikant nedreguleret, tid efter knockdown af Lin28 udtryk, udtryk for miR-107 forøget. Otteogfyrre timer efter transfektion af præ-MIR-107, Lin28 RNA-niveauer var signifikant reduceret, og 96 timer efter transfektion Lin28 proteinekspression var stadig lavere end den for den ikke-transficerede kontrolgruppe. Dette resultat indikerer, at MIR-107 kan regulere ekspressionen af ​​Lin28 (figur 5).

(A) .RNA niveau af Lin28 og MIR-107 blev påvist ved QRT-PCR i gastrisk cellelinie. (B) .MiR-107 ekspressionsniveauet blev påvist ved QRT-PCR efter Lin28 overekspression (i MKN45 og MKN28) eller Lin28 knockdown (i MKN45 /Lin28). (C). Pre-MIR-107 transfektion nedreguleret Lin28 i MKN45 /Lin28 i en tidsafhængig måde. (D). Chemo-drug følsomhed MKN45 /Lin28C2 og MKN28 /Lin28C3 steg efter transfektion af præ-miR-107. (E). Apoptose på MKN45 /Lin28 (behandlet med OXA på 3.2ug /ml) steg efter transficeret med præ-miR-107. (F). Kemo-drug følsomhed MKN45 celle ændret efter transficeret anti-MIR-107. (G) og (H). P-gp, C-myc-ekspression blev reduceret, mens CyclinD1 ekspression blev forøget i MKN45 /Lin28 celler efter transficeret med præ-MIR-107.Each datapunkt repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. (** P 0,01, * p 0,05).

4. MIR-107 deltager i Lin28-medieret resistens kemo-drug

kemoterapi følsomhed 4 cellegrupper, MKN45 /Lin28 /pre-miR-kontrol, MKN45 /Lin28 /pre-miR-107, MKN28 /Lin28 /pre-miR-kontrol og MKN28 /Lin28 /pre-miR-107, blev testet ved hjælp af MTT-metoden 48 timer efter transfektion med præ-miR-107. Vi valgte kemoterapi narkotika, der havde de mest udtalte virkninger under pre-test, OXA, PTX og ADM, og valgt en koncentrationsgradient på 5-6 ifølge foreløbige resultater fra indledende forsøg. Resultaterne antyder, at indførelsen af ​​præ-MIR-107 i Lin28-positive celler kan øge celle følsomhed over for kemoterapi. Apoptose test viste, at antallet af MKN45 /Lin28 apoptotiske celler steg efter transfektion med præ-MIR-107 (p 0,05). MTT test af MKN45 /Lin28 /anti-miR-kontrol og MKN45 /Lin28 /anti-miR-107 kemoterapi sensitivitet viste, at hæmning af ekspressionen af ​​miR-107 i MKN45 reduceret følsomheden over for PTX (figur 5).

Ved western blotting og q-PCR, vi påvises resistens-relateret gen og protein udtryk niveauer i MKN45 /Lin28 celler, der var blevet transficeret med præ-miR-107, herunder C-myc, P-gp, og cyclin D1. Resultaterne viste, at 48 timer efter transfektion med MIR-107, RNA og protein ekspression af C-myc og P-gp faldt (p 0,01), mens ekspressionen af ​​cyclin D1 forøget (p 0,05) (figur 5).

5. Lin28 forbundet kemo-resistens in vivo

Efter 2 cykler af kemoterapi, fandt vi, at de xenotransplantattumorer af MKN45 /Lin28 celler ikke reducere i mængden og blev større end de andre grupper (MKN45 /Vector og MKN45 ). I både MKN45 /Lin28 og MKN45 /Vector grupper, en af ​​musene døde, så kemoterapi blev stoppet. De tumorer blev skåret ud og deres mængder analyseret. Vi fandt, at MKN45 /Lin28 xenotransplantattumorer var større end de andre tumorer efter ADM og OXA kemoterapi (p 0,01). (Fig 6)

MKN45 /Lin28, MKN45 /Vector, MKN45 /parentale celler blev inokuleret subkutant i armhulen af ​​BALB /c-nu /nu-mus. Tumor volumen blev målt og vækstkurve blev bygget efter injektion af ADM og OXA

via

hale vene. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien ± SD af tre uafhængige forsøg. (** P 0,01).

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, vi undersøgt sammenhængen mellem Lin28 udtryk med kemo-følsomhed i gastriske kræftceller. Vi fandt, at transfektion med Lin28 reducerer følsomheden i mavens kræftcellelinjer MKN45 og MKN28 til fire typer af kemoterapeutiske reagenser (OXA, PTX, ADM, og 5-FU). Ved hjælp af siRNA interferens teknologi til knockdown Lin28 udtryk kunne vende kemo-modstand. Vi viste også, at miR-107 kunne nedregulere Lin28 udtryk, mens serveres også som en af ​​de potentielle mål microRNA, der er reguleret af Lin28. Overekspression af Lin28 opreguleret C-myc og P-gp, mens nedreguleret cyclin D1, kunne denne fænomener omvendt ved Lin28 siRNA eller transfektion pre-miR-107. Dette kan være kritiske mekanismer, som Lin28 faldt kemosensitivitet i gastriske kræftceller. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse, der viser Lin28 /MIR-107 signalvejen kan være involveret i kemo-lægemiddelresistens i gastrisk cancer.

Kemoterapi er en af ​​større behandlinger for mavecancerpatienter, men mere end 50% af patienterne vil udvikle sig til kemoterapi modstand. De mulige mekanismer for kemo-resistens i gastrisk cancer i øjeblikket anses for at omfatte den transmembrane transport af ABC transportører, glutathion S transferase, aktiviteten af ​​DNA-topoisomerase, kræft p53 mutation og apoptose relaterede veje. En nylig undersøgelse viste, at microRNA spiller en vigtig rolle i gastrisk cancer kemoterapi resistens [15]. I en tumorcelle resistens model, blev det observeret, cancer stamceller også spille en vigtig rolle i resistens over for kemoterapi. C-myc-genet er en af ​​overflademarkører af cancer stamceller, men også et onkogen forbundet med ubestemt proliferation, uendelig immortalisering, og fremme af celledeling [16]. Et studie rapporterede, at 40% af patienter med gastrisk cancer har C-myc-gen overekspression og at højere C-myc-ekspression er associeret med dårligere prognose [16-18]. Undersøgelser har også rapporteret en korrelation mellem C-myc-gen og apoptose. C-myc ekspression kan føre til nedsat tumorcelle apoptose. Cellen apoptotisk sats og følsomhed over inducerede faktorer er afhængige af c-myc protein niveauer [19]. Desuden er C-myc overekspression forbundet med stråling og kemoterapi modstand. Endvidere kan C-myc opreguleret P-gp, som kan inducere effluxing af kemoterapeutiske reagenser førte til kemoterapi modstand [20]. Cellecyklusstop kan påvirke respons af cancerceller til visse kemoterapi narkotika (f.eks PTX), som spiller en rolle i G2 /S-fase reduceret lægemiddelfølsomhed. Cellecyklus protein cyclin D har tre undertyper, D1, D2 og D3, og er en cellecyklus initieringsfaktor. Dens undertrykkelse af transformerende vækstfaktor -β1 (TGF-β1) forhindrer celler i at komme ind cellecyklussen, således at de forbliver i en hviletilstand [21]. Cyclin D specifikt kombinerer med CDK4 /6 for at phosphorylere og inaktivere retinoblastoma protein (pRb) og dermed bidrage til G1 /S omstilling og initiering af DNA-syntese [21]. I den aktuelle undersøgelse, fandt vi Lin28 ikke var relevant med Bcl-2, NF-kB og TOPO II gastriske kræftceller. Partnerskabet mellem Lin28 og microRNA’er er blevet veletableret, såsom lad-7, miR-200C, miR-143 [4,22]. Lin28 overekspression nedregulerer microRNA, mens microRNA også negativt kan påvirke ekspressionen af ​​Lin28. Lin28 sammen med TUT4 udgør en negativ regulator, som påvirker modning og homeostase af microRNA [4,22]. Ved at regulere nedstrøms gener, microRNA er involveret i celledifferentiering og proliferation, cellemetabolisme, stressreaktioner og dannelsen af ​​blodkar. Cheng et al [23] fandt, at efter inhibering MIR-107, væksten af ​​HeLa cervical cancerceller og A549 lungecancerceller blev fremmet. Marijn et al [24] fandt, at ekspressionen af ​​miR-107 i lægemiddelresistente ovariecancerceller blev nedreguleret. Vores undersøgelse viste, at Lin28 også kan begrænse modningen af ​​miR-107, og indførelse af miR-107 øger gastrisk kræft celle kemo-følsomhed for OXA, PTX, og ADM. Efter transfektion af anti-MIR-107, denne følsomhed nedsættes. Pre-MIR-107 forårsagede et fald i ekspressionen af ​​Lin28, hvilket illustrerer, at Lin28 /MIR-107-vejen kan være involveret i de kemosensitivitet ændringer i gastrisk cancer.

Sammenfattende viste vi, at Lin28 kunne hæmme ekspression af mIR-107, hvorved opregulering c-myc, P-gp og nedregulering cyklin D1, efterfølgende resultere i kemo-resistens af gastriske cancerceller. Den Lin28 /MIR-107-vejen kan serveres som en af ​​mange signalveje, der er forbundet med gastrisk cancer kemo-resistens. Vores undersøgelse kan give nye indsigter i mavekræft kemoresistens mekanisme. Lin28 /miR-107 kan være en ny potentielle terapeutiske mål for kemoterapi-resistent mavekræft.

Støtte Information

S1 Table. Minimale data for alle disse tal

doi:. 10,1371 /journal.pone.0143716.s001

(XLSX)