PLoS ONE: Forbedret funktionalitet karrene under Konventionelt Fraktioneret strålebehandling af prostatakræft

abstrakt

Selvom endotelcelle apoptose deltager i tumoren krympning efter en enkelt højdosis strålebehandling, vides der kun lidt om den vaskulære respons efter konventionelt fraktioneret strålebehandling. Derfor vurderede vi hypoxi, perfusion og vaskulære microenvironment ændringer i en ortotopisk prostatacancer model af konventionelt fraktioneret strålebehandling ved klinisk relevante doser (2 Gy fraktioner, 5 fraktioner /uge). Først konventionelt fraktioneret strålebehandling nedsat tumorcelleproliferation og forøget celledød med kinetik sammenlignelige med human prostatacancer strålebehandling. For det andet injektion af Hoechst 33342 eller fluorescerende-dextraner viste en øget tumor perfusion inden for 14 dage i bestrålede tumorer, som blev korreleret med en klar reduktion af iltmangel. Forbedret perfusion og faldt hypoxi blev ikke forklares ved øget blodkar tæthed, størrelse eller netværk morfologi. Men en tumor vaskulær modning defineret ved perivaskulære desmin + /SMA + -celler dækning blev klart observeret langs med en stigning i endotel- zonula occludens (ZO) -1 positive, intercellulære junctions. Vores resultater viser, at der ud over tumorcelledrab, vaskulær modning spiller en udækket rolle i tumor reoxygenering under fraktioneret strålebehandling

Henvisning:. Potiron VA, Abderrahmani R, Clément-Colmou K, Marionneau-Lambot S, Oullier T, Paris F, et al. (2013) Forbedret funktionalitet karrene under Konventionelt Fraktioneret strålebehandling af prostatakræft. PLoS ONE 8 (12): e84076. doi: 10,1371 /journal.pone.0084076

Redaktør: Zhaozhong Han, Alexion Pharmaceuticals, USA

Modtaget: Juni 17, 2013; Accepteret: 20. november 2013; Udgivet: December 31, 2013

Copyright: © 2013 Potiron et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Institut National du Cancer (INCA PAIR-prostata 2010), Foreningen pour la Recherche sur le Cancer, Ligue nationale Contre le Cancer og Région Pays de Loire. Den finansieringskilde var ikke involveret i indsamling, analyse og fortolkning af data, udarbejdelse af manuskriptet og beslutning om at offentliggøre

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Indledning

Selv følsomheden af ​​tumorer til strålebehandling (RT) er i høj grad afhængig af iboende radioresistance cancerstamceller [1], andre data antyder, at følsomheden af ​​endothelium spiller også en vigtig rolle [2] . Som et resultat af overdreven produktion af angiogene molekyler, blodkar i solide tumorer viser karakteristiske træk såsom dilaterede mikrokar, ufuldstændige endothelbeklædning, komprimering af tumorceller, overdreven forgrening og højt uregelmæssig arkitektur. På et cellulært niveau, er en ufuldstændig modning af kapillærerne noterede sig med fraværende eller fritliggende perivaskulære celler, fraværende eller for tyk basalmembran og mangel på endotel celler krydset. Denne unormale vaskulatur forårsager hypoxi at yderligere påvirker effekten af ​​bestråling, fordi 1) iltmangel reducerer mængden af ​​reaktive oxygenarter induceret af bestråling og 2) hypoxi vælger radioresistente mutantceller [3]. Under fraktioneret strålebehandling, er andelen af ​​hypoksiske celler stiger hurtigt efter fraktionen behandling siden normoksiske celler fortrinsvis og hurtigt dræbes ved bestråling. I de næste timer, på grund af mindre forbrug ilt beskadigede celler, forbedret perfusion, og reduceret celledensitet kan hypoxiske tumorceller få en lettere adgang til iltning, og derfor blive mere følsomme over for den efterfølgende brøkdel af bestråling. Denne proces med reoxygenering menes at give en terapeutisk fordel CFRT gennem en progressiv reduktion af normoksiske tumorceller og lettere adgang for hypoxiske celler til ilt [3].

Blodkar er i høj grad påvirket af RT afhængigt af antallet af fraktioner, dosis rente total dosis stråling og fraktion størrelse [4], [5]. Enkelt højdosis bestråling kan inducere hurtig apoptose af vaskulaturen [6], [7]. Desuden har både enkelt højdosis og hypofractionated bestråling inducerer endotelcelle apoptose og derved reducere vaskulær densitet [8], med overlevende fartøjer mere dilateret [9], [10]. Men betydningen af ​​vaskulær skade i tumorer modtager konventionelt fraktioneret strålebehandling (CFRT: 1,8-2 Gy per fraktion) er mere kontroversiel [11], [12]. I normale hjerne blodkar, meget seneste oplysninger tyder på, at omvendt til større doser, en 2 Gy-bestråling inducerer minimal endothelceller apoptose efterfulgt af en senere stigning i beholderen diameter, mikrovaskulær tæthed og fartøj utætheder [13]. Imidlertid hvilende endotelceller er mere modstandsdygtige over for bestråling end prolifererende endotelceller [14], [15]. Derfor kan virkningen af ​​CFRT på tumorendotelet afviger fra den normale endotel. Desuden at forstå virkningerne af klinisk stråleterapi, specifikke undersøgelser af tumor blodkar har skal gennemføres i ortotopisk modeller siden omfanget af hypoxi og vaskularisering er i høj grad påvirket af det sted, tumor transplantation [16], [17].

for at undersøge virkningerne af CFRT på tumorvaskulaturen og hypoxi, valgte vi en prostatakræft model, fordi CFRT op til de samlede doser af 74-80 Gy spiller en stor rolle i lokaliserede patienter med prostatacancer [18], og fordi reaktion af prostatatumorer for bestråling er meget følsom for hypoxi [19], [20]. Desuden prostatakræft vise terminal vækst anholdelse funktioner som den dominerende form for stråling-induceret celledød [21], [22], og denne langsomme kinetiske celle dræbe efter RT kan i høj grad påvirke tumor reoxygenering. Vi analyserede udviklingen af ​​tumor og kar strukturelle og funktionelle ændringer og deres indvirkning på tumor mikromiljø ved hjælp af en klinisk relevant fraktionering ordningen (2 Gy × 5 fraktioner /uge i løbet af 2 uger) i en ortotopisk prostatakræft model. Vores resultater tyder på, at omvendt til hypofractionated strålebehandling, er CFRT ikke påvirke fartøj tæthed, men remodels tumorvaskulatur ved at øge perivaskulær dækning, forbedre fartøj perfusion og fører til nedsat hypoxi.

Resultater

Konventionelt fraktioneret stråling kontrol terapi prostata tumorvækst

for at studere ændringer i tumor og dens mikromiljø under en klinisk relevant protokol af strålebehandling, vi inducerede ortotopisk prostatakræft hos mus. To uger efter celler blev injiceret, modtaget tumorbærende dyr en daglig dosis på 2 Gy bestråling centreret på underlivet, hver dag i ugen i to uger (konventionelt fraktioneret strålebehandling, CFRT;. Figur 1A). Denne protokol efterligner de første to uger af strålebehandling for patienter med prostatacancer. Dyr blev aflivet og analyseret ved 0 (ikke bestrålet), 1 (2 Gy), 3 (6 Gy), 7 (10 Gy) og 14 dage (20 Gy) under behandlingen. Som forventet, bestråling førte til et markant fald i tumor vægt sammenlignet med ikke-behandlede dyr (bestrålet: 237 ± 37 mg versus ikke-bestrålede: 777 ± 135 mg, p 0,01, figur 1B.). Også, bestråling havde en privilegeret effekt på prolifererende tumorceller, sammenlignet med tilstødende sunde væv (Fig. 1C). Reduktion af celleproliferation var synlig fra dag 1, og mere udtalt med tiden (-54% ved T14 vs. t0, s 0,01, figur 1D, E.). Parallelt hermed celledød steget hurtigt på dag 3 (+ 109%, p 0,05) og forblev ikke-signifikant højere end baseline derefter (Fig 1D, F.). Samlet set har disse resultater er i overensstemmelse med de langsomme-kinetiske respons observeret for patienter med prostatacancer.

(A) Ordning af den traditionelle fraktioneret strålebehandling (CFRT) protokol, der bruges til behandling af etablerede prostata tumorer. (B) Vægt af dissekerede tumorer efter den angivne tid CFRT. Værdier = gennemsnit af n≥6 ± sem. Statistisk sammenligning vs. T14 bestrålet. (C) Eksempel på en tumor behandlet i en uge, viser TUNEL + tumorceller ( “T”) og normale tilstødende væv ( “N”), hovedsagelig TUNEL-. Tumor og normalt væv blev identificeret med DAPI baseret på kerner morfologi, størrelse, farvningsintensitet og rumlig gruppe af celler. (D) Pseudo-konfokal billeder af tumorer under CFRT, farvet for Ki-67 /TUNEL /CD31. (E, F) Billede kvantificering af celleproliferation (Ki-67 indeks, E) og celledød (TUNEL indeks, F). Statistiske sammenligninger vs. t0.

CFRT reducerer hypoxi og øger tumor perfusion

Hypoxi resultater fra ilt overforbrug af tumorceller samt tumor blodkar abnormitet. For at bestemme mønster af hypoxi, en stor radioresistance faktor, under CFRT, brugte vi den ydre markør EF5 [23], som fremhæver alvorlige. ( 0,2% O

2), radiobiologically-relevant hypoxi (fig S1A-C ). EF5-positive overflade var moderat forøget på dag 1 (+ 45%), men ikke signifikant, med nogle hypoxiske områder i nærheden af ​​blodkar, hvilket antyder, at ikke alle fartøjer blev perfuseret (fig. 2A-B). Men hypoxi faldet, i alle efterfølgende tidspunkter, for at nå kun 11,4% af t0 på 2 uger (p. 0,05, figur 2A-B).

(A) Pseudo-konfokal billeder af tumorer under CFRT, farvet for hypoxi (EF5) og endotelceller (CD31). (B) Billede kvantificering af EF5 + overflade i tumorer under CFRT. Værdier repræsenterer gennemsnittet af n≥13 per point ± sem. (C) Pseudo-konfokale billeder af tumorer perfunderet med Hoechst 33342 og 10 kDa /2 MDA dextraner før (t0) eller efter 2 uger af CFRT (T14). SYBR green blev anvendt som en modfarve af totale cellekerner. (D, E, F) Billede kvantificering af Hoechst + (D), og medium (E) og store (F) dextran + overflader i tumorer under CFRT (n = 6). (B, D, E, F). Statistiske sammenligninger vs. t0.

For at vurdere fartøj funktionalitet, blev fluorescerende molekyler af forskellige størrelser intravenøst. Stor (2 MDa dextran) molekyler, der forbliver intravaskulær konto for perfusion, medium (10 kDa dextran) for interstitiel diffusion og små (Hoechst 33342, 616 Da) for permeabilitet. Mens i ikke-bestrålede tumorer, kun diskrete områder blev positivt farvet, blev fordelingen overflade af alle molekyler i høj grad forøget efter 2 ugers CFRT og var mere homogen (fig. 2C-F). Fordeling af Hoechst nået en værdi nær den for normal prostata (t0: 0,10 vs. T14: 0,33, p 0,01, figur 2C-D, normal:. 0,41, figur S2.). Den samlede overflade af medium (10 kDa) og store (2 MDA) dextraner blev også forøget (t0: 0,011 vs. T14: 0,029, p 0,05, figur 2C, E og t0: 0,0054 vs. T14:. 0.010, s 0,05, fig. 2C, F), men ikke kan sammenlignes med normale væv (0,12 og 0,02, fig. S2) som mikrokar densitet (MVD) er ≈ 3 gange lavere i tumorer (fig. S3A-C). Begge dextraner forblev afbrudte, viser ingen tegn på væsentlig diffusion, der ville repræsentere fartøj utætheder (2 MDA) eller unormal permeabilitet (10 kDa). Den tilsvarende stigning uanset molekyle størrelse er konsistent med en stigning i perfusion (fx øget blodgennemstrømning). Interessant nok blev ingen signifikant stigning i perfusion observeret i den normale prostata-acini (fig. S4A-D). Således CFRT fortrinsvis forbedrer fartøj perfusion i forbindelse med tumor mikromiljø.

CFRT inducerer ikke ændringer i fartøj tæthed, har størrelse eller distribution

Forbedret perfusion i forbindelse med tumor kemoterapi været forbundet med vaskulær normalisering, og potentierer strålebehandling [24]. Imidlertid har ændringer af det tumor-associerede vaskulatur løbet CFRT ikke undersøgt. Vi undersøgte derfor mikrokar tæthed og struktur i tumorer bestrålet på forskellige tidspunkter. MVD var stabil i tidsforløbet for eksperimentet fra 51 ± 8 mikrokar /mm

2 ved t0 til 54 ± 7 ved T14 (Fig. 3A), i modsætning til ubestrålede tumorer, som udviste en signifikant stigning (fra 47 ± 7 til 80 ± 8, s. 0,01, figur S5A, B). Notatet, dette er et godt stykke under, der er observeret i den normale prostata med en MVD på 166 ± 6 (fig S3C, s. 0,01 vs. tumor ved t0), hvilket kan forklare den hypoxi påvist i ubehandlede tumorer. Vedligeholdelsen af ​​MVD fået os til at afgøre, om endotel celledød opstår under CFRT. Derfor målte vi TUNEL indekset i CD31 + celler. CFRT inducerede ikke EF død (fig. 3C, D), trods en tendens på dag 1 (+ 28%, p = 0,37), der var i overensstemmelse med den ikke-signifikant MVD minimum på dag 3 (fig. 3A). Endvidere er mængden af ​​TUNEL + farvning var ikke i overensstemmelse med massiv endotelcelle beskadigelse. Dernæst til grund for fordelingen blodkar heterogenitet, vi bestemt afstand af celler (identificeret ved DAPI) til den nærmeste fartøj. Under anvendelse af denne analyse, den svage og forbigående MVD reduktion observeret ved dag 3 (. Figur 3A) resulterede i en mild, men unsignificant skift af celler mod et teoretisk hypoksisk miljø ( 100 um fra den nærmeste fartøj, fig 3B.). Men på det tidspunkt, hvor hypoxi var til stede og perfusion blev augmented (T14), afstanden profil celler til blodkar var identisk med ubestrålede tumorer (t0: 21.3 vs. T14: 24,9% af celler til mere end 100 um). Desuden værdier var stort set længere end dem, der optræder i den normale prostata (S3A, F). Således kan den øgede tilførsel af Hoechst /dextraner observeret efter bestråling skyldes fartøj kvalitet frem for kvantitet. Derfor analyserede vi fartøj netværk morfologi ved at scanne væv over en 100 um tykkelse. Alligevel sammenlignet med bestrålede tumorer, tumorer høstet på dag 14 under CFRT viste ingen forskel i beholderen forgrening (t0: 8.9 gren /mm vs. T14: 7,6, p = 0,32, Fig 3E, F.), Diameter (t0: 9,5 um vs. T14: 8,6 um, p = 0,21). Samlet indikerer disse resultater, at den reducerede hypoxi /augmented perfusion under CFRT ikke korrelerer med bedre vaskulær densitet, topografi eller morfologi.

(A) mikrokar tæthed i tumorer under CFRT. Værdier repræsenterer gennemsnittet af n≥13 per point ± sem. (B) Afstand profil mellem celler og det nærmeste blodkar, fra tumorer under CFRT. Profiler er baseret på n≥13. Statistiske sammenligninger vs. t0. (C) Pseudo-konfokale billeder af tumor-associerede blodkar (CD31 +) farvet for TUNEL under CFRT. Pile: TUNEL + /CD31 + celler. (D) Billede kvantificering af CD31 + /TUNEL + overflade. Værdier repræsenterer gennemsnittet af n≥13 per point ± sem. (E) Repræsentative Z-stack billeder af 100 um tyk tumorsnit før (t0) eller efter 2 uger af CFRT (T14) og farvet for blodkar (CD31 + /Fli-1 +). (F) Billedanalyse af blodkar netværk fra 100 um tykke tumorsnit. Værdier repræsenterer gennemsnittet af n = 9 pr punkt ± sem.

CFRT inducerer modning af karvæggen

Unormale tumorkar ofte udviser ikke-kontinuerte endotel væg, hvilket resulterer i forværret permeabilitet og utætheder. For at forstå endotel væg samhørighed, vi farvet for zonula-occludens (ZO) -1, et protein involveret i tætte forbindelser. Endotel (CD31 +) – specifikke ZO-1-indekset var signifikant opreguleret efter 2 uger af CFRT (+ 38% af t0, s. 0,05, Fig 4A, B). Mere vigtigt var dette forbundet med øget dækning af endotelceller med alfa glat muskel-actin (SMA) positive celler (+ 111% af t0, s 0,05;. Figur 4A, C). Ved konfokal mikroskopi og histogram analyse blev ZO-1 bekræftet at være endotel (inde CD31-udtrykkende celler) og udtrykkes kontinuerligt, specielt efter bestråling (fig. S6A-B). I modsat, SMA var ikke-endotel og sidestillet til endotel væg. Til præcis arten af ​​de perivaskulære celler, blev vævene co-farvet for desmin, en pericyt markør [25]. Ud over den SMA-indekset blev desmin + perivaskulære celler også steget (t0: 0,034 vs. T14: 0,065, p 0,01, Fig 4D.). Desuden SMA og desmin blev co-udtrykt af de samme celler (fig. 4E, F). Også frekvensen af ​​desmin + /SMA + overdækket fartøjer fordoblet mellem dag 0 og dag 14 i CFRT (t0: 20,0 vs. T14: 39.4, s 0,05). Notatet SMA og desmin blev også co-udtrykt i de sjældne overdækkede ikke-bestrålede skibe (fig. S7). I den normale prostata blev desmin udtrykt af både mikro- (intra-acini) og makro (inter-acini) -beholdere, selv om SMA strengt begrænset til makro-skibe (Fig.S3A, D-E, fig. S8A-B). Desuden blev der ikke opregulering af SMA detekteret i bestrålede normale mikrokar (fig. S9A, C), ej heller i ikke-bestrålede tumor mikrokar (fig. S5C, D). Således stigningen i perivaskulære desmin + /SMA + celler er specifik for bestrålede tumor mikrokar.

(A) Pseudo-konfokal billeder af tumor blodkar under CFRT og farvet for ZO-1 /CD31 (øverst) eller SMA /CD31 (nederst). (B, C). Billede kvantificering af ZO-1 + /CD31 + (B) og peri-CD31 + SMA overflader (C). Værdier repræsenterer gennemsnittet af n≥13 per point ± sem. (D) Billede kvantificering af peri-CD31 + desmin overflade og hyppigheden af ​​desmin + /SMA + fartøjer. (B, E, D) Statistiske sammenligninger vs. t0. (E) Repræsentative konfokale billeder af et blodkar fra en 14-dages behandlet tumor farvet for CD31 /desmin /SMA. (F) histogram analyse af CD31 /desmin /SMA pseudofarve profil konfokal billede tværsnit.

Diskussion

Selv om flere undersøgelser tyder på, at bestråling fører til fartøj ødelæggelse, effekten af konventionelt fraktioneret bestråling har været stort set uudforsket. Vi brugte en ortotopisk model for prostatakræft med en klinisk-relevant fraktionering ordning, overtalelse beskeden celledød, stigende proliferationsstandsning med dosis og differentieret effekt mellem normale /tumorceller. Vi finder, at CFRT næsten ophævet tumor hypoxi efter 2 ugers behandling, sammen med en øget perfusion. Uventet blev disse virkninger ikke forbundet med væsentlige ændringer i fartøjets morfologi eller densitet, men snarere med fænotypisk modning af karvæggen, herunder endotelceller (CD31 + /ZO-1 +) og pericytes (desmin + /SMA +). Samlet set har disse observationer indikerer, at vaskulær tilpasning spiller en udækket rolle i tumor reoxygenering under fraktioneret strålebehandling.

Vi har ikke observere en drastisk stigning i apoptotiske endotelceller 24 timer efter daglig 2 Gy bestrålinger, og MVD forblev stabil, konsekvent med seneste oplysninger i normale hjerne blodkar [13]. Disse resultater er i kontrast til tidligere undersøgelser under anvendelse af højere dosis bestråling, hvor endothelial celledød og fald i kardensitet blev rapporteret, skønt med tidligere tidspunkter [2], [4]. Især fraktioner af 4 og 12 Gy i 2-3 uger førte til øget endotel celledød og nedsat MVD i subkutane tumorer [8], [9], [10]. Dette er overraskende, da endotel apoptose menes at opstå kun enkeltdoser ≥ 10-15 Gy [2], [4]. Dog kan EF død afhænger af indstillingen tumor, idet kun mindre vaskulære ændringer blev noteret 24 timer efter en enkelt dosis på 15 Gy i et andet prostatacancer model [26]. Forskellige endotheliale celletilstande mellem undersøgelser kan kompensere for forskelle mellem radiosensitivitet, da hvilende endotelceller er mere modstandsdygtige over DNA beskadigelse induceret af bestråling, men ikke til kortsigtet membran-induceret celledød [14] [15]. Dette kan forklare, at de observerede stigninger i pericytic dækning og perfusion var kun signifikant i det bestrålede tumor rum, hvor mikrovaskulære miljø kan være mere lydhør /eftergivende. Disse resultater illustrerer kompleksiteten af ​​tumorvaskulatur og dets heterogene respons på behandlinger. Måske betydningen af ​​en orthotopisk indstilling er ofte under-værdsat da blodkar vise stærk heterogenitet mellem organer (fx androgenreceptor udtryk for prostata endotel, blod-hjerne-barrieren etc ..). Faktisk PC3-afledte tumorer dyrket subkutant har væsentligt større fartøj størrelse og densitet (≈ x3, data ikke vist). Vigtigst er det, de seneste undersøgelser ved hjælp af højere doser fraktion er i overensstemmelse med vores arbejde for et fald i tumor hypoxi og øget perfusion sammen med pericyt dækning [9], [10], undtagen én rapport ved hjælp af meget høj (30 Gy) enkeltdosis bestråling [ ,,,0],27]. Kollektivt, disse undersøgelser tyder på, at øget perivaskulær dækning kan spille en væsentlig rolle i beholder perfusion og reoxygenering efter fraktioneret bestråling.

Bevarelse vaskulaturen er nu set positivt til kræftbehandling på grund af begrebet vaskulære normalisering. Konceptet ud over denne observation var, at ødelægge vaskulaturen ville producere hypoksi som gør bestråling mindre effektiv. Den oprindelige observation var, at inhibering af den overproducerende angiogenese med et anti-VEGFR2 antistof midlertidigt rekrutterer pericyter og nedregulerer tumor hypoxi [24]. Da ukontrolleret EF spiring er blevet forbundet med ikke-funktionel angiogenese, kan bestråling-induceret beskæring af vaskulære spirer resultere i nedsat netværkskompleksitet og forbedret perfusion [15]. Men vi fandt ikke vigtigste funktioner, der kendetegner normaliserede blodkar siden forgrening, MVD, snoning og diameter fartøj var uændret. Selvom perfusion var ens i nogle aspekter, til den normale prostata, fartøj fænotype var tydelig, med højere ZO-1 i bestrålede skibe, end hvad der normalt forekommer. Hertil kommer, i den normale prostata, omkredsen af ​​mikro-fartøjer var konsekvent desmin + /SMA-, hvorimod SMA udtryk strengt var begrænset til store, inter-acini skibe. Denne vaskulære hierarki findes også i humane prøver [28]. I modsætning hertil bestrålede tumor mikro-skibe (≈ 10 um diameter) fik perivaskulær SMA udtryk. Disse data indikerer, at karvæggen kan adskille entydigt efter bestråling, i overensstemmelse med andre rapporter om perivaskulær celle respons på inflammatorisk stress (TGFb, PDGFb).

afvigende ekspression af endotelceller forbindelsesepitoper proteiner, herunder ZO-1, kan forekomme i fravær af endotelcelle polarisering [29] eller kort (f.eks min.) efter bestråling [30]. Den øgede endotel ZO-1 observeret, her efter 2 uger er sandsynligvis relateret til stabilisering fartøj siden 1) vores perfusion data antyder, at de fleste skibe effektivt lumenized og 2) mønstret af ZO-1 er membranøs, lineær og kontinuert. Som for perivaskulær modning, det tætte samarbejde med CD31-kontrastfarvet endotelceller og tilstedeværelsen af ​​to markører (desmin /SMA) identificere de omkringliggende celler som pericytter [25]. Perivaskulære celler er vigtige regulatorer af vaskulær dannelse, stabilisering, remodellering og funktion til at generere et modent, hvilende vaskulatur [31]. Modning af skibe sker gennem gensidig parakrin signalering, hvor EF-afledte faktorer tiltrække pericytter og senere til fordel for etablering af endotel celle vejkryds [32]. Af betydning, pericyt-udskilte stikord beskytter EC’er fra stråling-induceret død

in vitro

[33]. Dette antyder, at fartøjer uden pericyt dækning ville være mere sårbare over for bestråling, som hypotese for nylig af Chen et al [9]. Derfor kan fraktionerede bestråling regimer, som giver mulighed for vaskulær modning, forbedre tumor vaskulær funktion.

Vores data indikerer en reduktion af den hypoxiske fraktion efter to ugers behandling og er i overensstemmelse med de seneste data i subkutane tumorer [9 ], [10], [34]. Tumor reoxygenering blev defineret som det koncept, at kronisk hypoxiske tumorceller få en bedre adgang til ilt under fraktioneret strålebehandling fordi aerobe tumorceller elimineres af tidligere fraktioner [35]. I vores model, tumor reoxygenering sket ikke kun i forbindelse med nedsat tumorcelleproliferation og forøget celledød, men også med en forbedret funktionalitet vaskulaturen fremgår af perfusion og diffusion af små molekyler. Det betyder, at tumor reoxygenering er ikke kun på grund af øget drab af tumorceller og mindre forbrug oxygen, men også til en bedre fordeling af oxygen ved blodkar. I forskellige eksperimentelle tumormodeller samt i kliniske studier, blev intertumoral heterogenitet i kinetikken for iltning under fraktioneret vist [36], [37], [38], [39]. For eksempel i pladecellecarcinomer, hypoksi faldt i CFRT i et flertal af tumorlinjer, mens der i nogle tumorcellelinier blev observeret en tidsmæssig stigning eller ingen ændring og fraktion af perfunderede fartøjer og vaskulære område viste kun beskedne ændringer [34]. Desuden er vores resultater tyder på, at i løbet af CFRT, stabilisering af fartøjer er nødvendig, således at 2

nd uge fraktioner blive mere effektive. Mens der er voksende interesse for højdosis hypofractionated protokoller, især hos patienter med prostatacancer [40], og disse data rejser spørgsmålet om, hvorvidt sådanne protokoller bevare den fordel stigende iltindhold og dermed det terapeutiske indeks [41]. I andre tumormodeller dog, hypofractionated (3 Gy /fraktion strålebehandling) forbedret iltning kun i den tidlige fase af behandlingen, men førte til et betydeligt fald i tumor iltning i den senere fase af bestråling ( 45 Gy) [42]. Således er der behov for mere viden om indflydelsen af ​​vaskulær modning på radiosensitivitet af tumorceller.

Sammenfattende fandt vi, at konventionelt fraktioneret bestråling inducerer vaskulær modning, sammen med øget perfusion /nedsat hypoxi. Disse resultater antyder, at den vaskulære mikromiljø spiller en rolle i tumor reoxygenering, udover de kendte virkninger på tumorceller. Det er uklart, om hypofractionated protokoller kan tillade vaskulær modning eller i stedet føre til vaskulær sterilisation og hypoxi. Virkningen af ​​disse protokoller på tumor blodkarrene og på det kliniske resultat bør være udsigten til yderligere undersøgelser.

Materialer og metoder

ortotopisk prostata tumorigenese og væv samling

Seven -Uge gammel mand NMRI-nøgne mus (Janvier, Saint Berthevin, Frankrig) blev bedøvet ved hjælp af ketamin /xylazin (50/15 mg /kg) og 2 × 10

6 PC3-luc celler (Caliper Life Sciences, Villepinte, Frankrig ) injiceret i den venstre dorsolaterale lap af prostata ved operation. Efter to uger blev tumor optagelse verificeret ved luminescens ved hjælp af en PhotonImager (BiospaceLab, Paris, Frankrig) og grupper med lignende tumor bioluminescens signal blev dannet. Eksperimenter begyndte 3 dage senere. Når passende, dyr aflivet, blev vævene udskåret og om nødvendigt vægtet, og frosset (-80 ° C) indlejret i OCT medium (Sakura Finetek, Villeneuve-d’Ascq, Frankrig). Prøverne blev indsamlet i forbindelse med den næste CFRT fraktion, til at analysere tumor tilstand på det tidspunkt, hvor den skal behandles.

Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med Det Europæiske Råd i direktiv 2010/63 /UE og godkendt af den lokale Animal Care og brug Udvalg (Comité d’Ethique en eksperimenteren Animale des Pays-de-la Loire, C2EA-06).

In vivo

hypoxi og perfusion

Hypoxi og perfusion blev bestemt ved hjælp af specifikke markører, der blev administreret iv i saltvand buffer. For hypoxia, blev 300 pi 3 mg /ml EF5 (hypoxia-imaging.org) injiceret 2h før at ofre [23], [43], mens 300 pi blandede perfusion markører (1,6 mg /ml Hoechst 33342, 0,6 mg /ml Alexa

647-10 kDa dextran og 3 mg /ml rhodamin-2 MDa dextran, Life Technologies, Saint Aubin, Frankrig) blev injiceret 3 min foran væv samling [44] væv blev snap-frosne, cryosected, modfarvet med SYBR Green (Fisher Scientific, Illkirch, Frankrig) for samlet cellekerner og monteret i Prolong Gold uden DAPI (Life Technologies).

Strålebehandling

Bestrålinger blev udført under anvendelse af en CP-160 røntgen strålerøret (Faxitron, Lincolnshire, IL) med en 0,3 mm Cu-filter, en accelererende spænding på 160 kV og en dosis på 1,3 Gy /min. Dyrene modtog en dosis (fraktion) 2 Gy dagligt mandag til fredag ​​i to uger, centreret på en nedre abdomen på 2 cm x 2 cm under anvendelse af bly skjolde designet til at minimere bestråling til normale væv og knogler (HIPS). Denne ordning (her defineret som konventionelt fraktioneret strålebehandling, CFRT) er standard klinisk praksis for prostatakræft

Immunhistokemi

Væv blev cryosected ved 5 um tykkelse. (Med undtagelse af netværksanalyse: 100 pm) , fikseret med 4% paraformaldehyd og permeabiliseret med 0,05% Triton-X100. IHC blev udført ved anvendelse af standard-farvning og vaskeprocedurer [45]. For flere farvning blev antistoffer inkuberet sekventielt: den første, natten efterfulgt af sekundære og fastsættelse, derefter CD31 som det andet og SMA som den tredje. De følgende primære antistoffer blev anvendt: rotte-anti-muse CD31 (BD Biosciences, Le Pont-de-Claix, Frankrig), kanin-anti-ZO-1 (Life Technologies), kanin-anti-desmin (Ozyme, St-Quentin-en- Yvelines, Frankrig), kanin-anti-Ki67 (Dako, Les Ulis, Frankrig), kanin-anti-Fli1 (Fisher Scientific) Alexa488-konjugeret muse-anti-EF5, Cy3-konjugeret muse anti-alfa glatmuskelactin (Sigma, Saint-Quentin Fallavier, Frankrig). De sekundære antistoffer var: Alexa

647-konjugeret gede-anti-kanin, Alexa

488-konjugeret gede-anti-rotte (Life Technologies). TUNEL blev udført som anbefalet af producenten (Roche, Boulogne-Billancourt, Frankrig) som det sidste farvning trin. Slides blev monteret i Prolong guld med DAPI (Life Technologies) for kerner kontrastfarvning (bortset perfusion assay).

Slides blev observeret under en Axiovert 200M ApoTome ( “pseudo-konfokal”) mikroskop, med Axiovision 4,8 software ( Carl Zeiss Le Pecq, Frankrig). Mosaik af marker på op til 4 mm

2 blev registreret ved 63x olie mål og fire Z-trin på 1 um blev stablet i et billede. Skiver af 100 um tykkelse blev sædvanligvis registreret i ≈ 60 Z-trin på 1 um, på grund af væv udfladning efter dehydrering. Konfokal mikroskopi blev gjort med et A1R (Nikon Instruments, Champigny-sur-Marne, Frankrig) med Nis-Elements software, en numerisk apertur på 1 og skive scanning gennemsnitsberegning af 4.

Billedanalyse

analyser blev udført på ukomprimerede originale 16-bit billeder af høj opløsning mosaikker (pseudo-konfokale), bortset fra farve fordeling langs fartøj tværsnit (konfokal “histogram analyse”, se senere). To typer af værdier blev registreret: værdierne for overfladeaktive baserede analyser svarer til farvning overflader (um

2) betragtes som positive for farvning af interesse (ex, CD31-området) divideret med overfladen af ​​området af interesse (ROI; ex , samlede væv); værdier for objekt-baserede analyser svarer til det absolutte antal elementer anses positive (ex, antal fartøjer) divideret med overfladen af ​​ROI (tidligere, alt væv).

Surface-baserede analyser blev udført ved hjælp af ImageJ 1.46r software (National Institutes of Health, USA).