PLoS ONE: Triclosan forstærker Epithelial-To-Mesenchymale Transition i anoikis-Resistant Menneskelig Lung Cancer Cells

Abstrakt

Ændring af cancercelle mod mesenkymale fænotype er blevet vist at forstærke tumor aggressivitet ved at øge cancercelle metastase. Heri, vi rapporterer effekten af ​​triclosan, et meget anvendt antibakterielt middel findes i mange daglige produkter, øge epitel-til-mesenkymale overgang (EMT) i aggressiv anoikis resistente menneskelig H460 lunge kræftceller. EMT har været længe kendt for at øge evner af cellerne til at øge migration, invasion, og overlevelse i cirkulerende system. Nærværende undersøgelse viser, at behandling af kræftceller med triclosan ved fysiologisk relaterede koncentrationer signifikant øget kolonien antal kræftcellerne vurderet af tumordannelse assay. Også, den mesenchymale morfologi og fald i celle-til-celle adhæsion observeret i triclosan-behandlede celler. Vigtigere, western blot-analyse afslørede, at triclosan-behandlede celler udviste nedsat E-cadherin, mens niveauerne af EMT markører, nemlig N-cadherin, vimentin, snegle og slug fandtes at være signifikant opreguleret. Endvidere EMT induceret af triclosan behandling blev ledsaget af aktivering af fokal adhæsion kinase /ATP-afhængig tyrosinkinase (FAK /Akt) og Ras-relaterede C3 botulinustoksin substratet 1 (Rac1), som udvidede cellernes evne til at migrere og invadere . Afslutningsvis demonstrerede vi for første gang, at triclosan kan forstærke overlevelse cancerceller i fritliggende tilstand og motilitet via processen med EMT. Som nævnt kapaciteter er nødvendige for succes i metastase, den nuværende undersøgelse giver romanen toksikologiske oplysninger og tilskynder bevidstheden om triclosan brug i kræftpatienter

Henvisning:. Winitthana T, Lawanprasert S, Chanvorachote P (2014) Triclosan forstærker epiteliale-To-Mesenchymale Transition i anoikis-Resistant Menneskelig Lung Cancer Cells. PLoS ONE 9 (10): e110851. doi: 10,1371 /journal.pone.0110851

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: Juli 21, 2014 Accepteret: September 24, 2014; Udgivet: 16 Okt 2014

Copyright: © 2014 Winitthana et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Research Fund Thailand (til PC) (https://www.trf.or.th), Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund af Chulalongkorn ( RES560530132-HR), den 90. årsdagen for Chulalongkorn Fund (Ratchadapiseksomphot Endowment Fund), og Chulalongkorn Graduate Scholarship for at fejre den 72. årsdagen for Hans Majestæt Kong Bhumibol Adulyadej (https://www.grad.chula.ac.th/eng /stipendier). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den velkendte bredspektret antibakterielt middel triclosan (2,4,4 ‘-trichloro-2’-hydroxydiphenylether; TCS) (figur 1A) er blevet kommercielt anvendt i en lang række produkter til inhibere væksten af ​​bakterier, svampe og meldug [1], [2]. TCS har været brugt under regulering af Food and Drug Administration (i kosmetik, deodorant, håndsæber, tandpasta) samt Miljøstyrelsen (i materialer konserveringsmiddel inkorporeret i husholdningernes plast og tekstiler) [2], [3]. De anvendte koncentrationer af FKS i forskellige produkter kan variere; Men dens niveauer i de fleste produkter til personlig pleje i området fra 0,1-2% [1], [3]. Den omstændighed, at signifikante niveauer af FKS kan påvises i plasma hos TCS-eksponerede menneske ved koncentration i området fra 0,02 og 20 ug /ml (0,069 og 69 uM) fører til den mulige udformning, at dette middel eventuelt kan påvirke human fysiologi [4 ].

(A) Den kemiske struktur af TCS. (B) multicellulær aggregering af anoikis resistente H460-celler. Scale bar er 1000 um. (C-D) Efter behandling med TCS (0-10 uM) i 24 timer, procentdelen af ​​cellelevedygtighed blev bestemt ved MTT-assay, og procentdelen af ​​apoptotiske celler blev detekteret ved Hoechst33342 farvning hhv. Værdier er gennemsnit af de tre uafhængige tredobbelte prøver ± SE. *

P

0,05 versus ikke-behandlede kontrol. (E) Efter den angivne behandling, cellekernemorfologi af cellerne blev påvist ved Hoechst33342 /PI co-farvning-assay og visualiseret under et fluorescensmikroskop. Scale bar er 50 um. (F) Celler blev behandlet med TCS (0-7,5 uM) i 24, 48 eller 72 timer. Cellelevedygtighed blev bestemt ved MTT-assayet. Dataene repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige tredobbelte prøver ± SE. *

P

0,05 versus ikke-behandlede kontrol på hvert angivne tid. (G-H) Celler blev behandlet med TCS (0-7,5 uM) i 48 timer. Celle cyklus af TCS-behandlede celler blev bestemt ved PI-farvning og flowcytometri. *

P

. 0,05 versus ikke-behandlede kontrol

Med fokus på kræft, up-to-date information har påpeget, at FKS har ubetydelige virkninger på carcinogenese og direkte genmutation [2], [5], [6]. Men i betragtning af, at TCS er et stof, som folk kan blive udsat for i en lang periode i deres liv, er det vigtigt fuldt ud at forstå de mulige virkninger af dette middel ikke kun på carcinogenese men også den mulige indvirkning på kræft celle adfærd. Nylige undersøgelser har indikeret, at overgangen af ​​cellulær fænotype fra epithelial til mesenkymale navngivet epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) er en kritisk faktor for at lette metastase af mange cancere [7] – [9]. EMT har fået stor opmærksomhed i kræftrelaterede undersøgelser og EMT er blevet anerkendt som et adelsmærke for kræft stemness samt aggressivitet [10]. EMT proces har medført ændring af celle- adfærd, der i de fleste tilfælde, forbedrer evnen til at metastasere, herunder potenseret migrering af cellerne fra dets primære tumor, og forøget resistens over for apoptose [11] – [13].

Mest bevis har foreslået, at sub population af cancerceller, der udviser anoikis resistent egenskab er størstedelen af ​​celler, der undergår vellykket metastase [14] – [18]. Anoikis resistente celler er også kendt som cirkulerende tumorceller (CTCs) [19]. I klinisk praksis har CTCs blevet betragtet som en potentiel biomarkør der afspejler cancer aggressivitet af mange typer af cancer, herunder bryst-, prostata-, tyktarms-, blære-, mave-, lever- og lungekræft [20] – [24]. Tilstedeværelsen og mængden af ​​CTCs i perifert blod er vist at korrelere godt med dårlig prognose hos cancerpatienter [19], [20]. Bestanden af ​​CTCs udviser heterogene celle fænotyper herunder epitel, mesenkymale, og disse fænotyper i en overgangsfase fra epitelial til mesenkymale [20], [24] – [27]. Som processen med EMT resulterede i mesenkymale fænotyper med stigning metastase kræfter herunder anoikis modstand og invasiv evne celler [14], [20], [23] faktorer eller stimuli som letter denne EMT i CTCs kan ændre fænotyper CTCs befolkning og påvirker metastase potentialer cellerne. Som CTCs findes i systemisk cirkulation [19], [24], [28], cellerne kan forventes at blive udsat for flere kemikalier, der findes i blodet. Baseret på en sådan bekymring, har flere forbindelser blevet undersøgt og rapporteret at have en EMT-fremkaldende ejendom, såsom TGF-β [29], [30], epidermal vækstfaktor [31], [32], celecoxib [33] gefitinib [ ,,,0],34] og hexavalent chrom [35].

Selv om tilstedeværelsen af ​​visse fusioner af FKS er blevet rapporteret i humane oplag, oplysninger om virkningerne af en sådan agent på EMT proces med CTCs er stadig stort set ukendt. Nærværende undersøgelse har til formål at undersøge virkningerne samt de mulige virkninger af dette stof på den aggressive population af lunge kræftceller. Bedre forståelser opnået fra denne undersøgelse kan bidrage til sikrere brug af FKS og give ny vurdering tilgange til kræft-relateret toksicitet.

Materialer og metoder

1. Celler og reagenser

NCI-H460 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Cancercellerne blev dyrket i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 IE /ml penicillin, og 100 ug /ml streptomycin (Life Technologies, MD, USA) i 37 ° C med 5% CO

2 fugtig inkubator. Triclosan blev opnået fra Sigma (St. Louis, MO, USA). TCS blev fortyndet med sterilt medium til at opnå de arbejdende koncentrationer med 0,1% DMSO i den endelige opløsning. Hvad angår kilderne af reagenser, Hoechst33342, propidiumiodid (PI), phalloidin tetramethylrhodamin B isothiocyanat blev okseserumalbumin (BSA) og dimethylsulfoxid (DMSO) købt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) blev erhvervet fra Gibco (Life Technologies, MD, USA). Matrigel blev opnået fra BD Biosciences, Inc. (Woburn, MA, USA). BCA assay kit og Supersignal vest pico kemiluminescerende blev opnået fra Thermo Scientific, Inc. (Rockford, IL, USA). Kanin monoklonale antistoffer til E-cadherin, N-cadherin, vimentin, slug, snegle, Akt, phosphoryleret Akt (S473), fokal adhæsionkinase (FAK), phosphoryleret FAK (Y397), β-actin, peroxidasekonjugeret anti-kanin IgG og peroxidasekonjugeret anti-muse-IgG blev opnået fra Cell Signaling (Denvers, MA, USA). Muse monoklonale antistoffer til Active Rac1-GTP og Active Rho-GTP blev opnået fra NewEast Biosciences (Malvern, PA, USA). Immobilon Western kemiluminescerende HRP-substrat blev opnået fra Millipore, Corp. (Billerica, MA, USA) og Thermo Fisher Scientific Inc. (Rockford, IL, USA).

2. Anoikis resistente celler

anoikis resistent cellekultur blev udført ifølge fremgangsmåden ifølge Sakuma et al. [36] og Khongmanee et al. [37] med mindre modifikationer. Kort fortalt, blev fastgjort H460 celler trypsinbehandlet, når cellerne nåede 80-90% konfluens med 0,05% trypsin /0,02% EDTA. Derefter blev cellerne dyrket i ultralav fastgørelse 6-brønds plade (Corning Costar, MA, USA) i RPMI-1640-medium, mens andre betingelser som beskrevet for fastgørelse kultur blev opretholdt. Celler blev dyrket ved en densitet på 2 x 10

5 celler /ml i 48 timer. Suspenderede celler blev derefter opsamlet og forberedt til en enkelt cellesuspension ved 1 mM EDTA behandling. Derefter blev cellerne vasket med komplet RPMI-1640 medium. Cellernes levedygtighed blev målt ved hjælp af automatiseret celletæller. Levedygtige celler blev anvendt til yderligere eksperimenter.

3. Cellelevedygtighed assay og celleproliferationsassay

Celler levedygtighed blev bestemt ved MTT-assayet. Celler blev podet ved en tæthed på 1 x 10

4 celler /brønd på 96-brønds plade natten over. Efter at de blev behandlet med forskellige koncentrationer af FKS i 24 timer. Efter behandlingen blev mediet derefter erstattet med MTT-opløsning (5,0 mg /ml i PBS) og inkuberet ved 37 ° C i 4 timer. Derefter blev mediet erstattet med 100 pi DMSO til solubilisere formazan produkt og intensiteten af ​​formazanprodukt blev målt ved 570 nm under anvendelse af en mikropladelæser (Anthros, Durham, NC, USA). Cellelevedygtighed blev udtrykt som procentdelen beregnet ud fra den optiske densitet af behandlede celler i forhold til de kontrollerede celler. I mellemtiden blev celleproliferativ virkning bestemmes også ved hjælp af MTT-assayet. Celler blev podet ved en densitet på 2 x 10

3 celler /brønd i 96-brønds plade og inkuberet natten over. Derefter blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af FKS i 0, 24, 48 og 72 timer. Celleproliferation blev målt ved MTT-assay som beskrevet i vurderingen cellernes levedygtighed.

4. Nuklear farvning assay

Apoptotisk og nekrotisk celledød blev bestemt ved Hoechst33342 og PI co-farvning. Celler blev podet ved en tæthed på 1 x 10

4 celler /brønd på 96-brønds plade og inkuberet natten over. Celler blev derefter behandlet med TCS i 24 timer. Efter særlige behandlinger, blev celler inkuberet med 10 ug /ml Hoechst33342 og 5 ug /ml PI i 30 minutter ved 37 ° C. De apoptotiske celler har kondenseret kromatin og /eller fragmenterede kerner og PI-positive nekrotiske celler blev visualiseret og scoret under et fluorescens mikroskop (Olympus IX51 med DP70, Olypus America Inc., Center Valley, PA, USA).

fem. Cellecyklusanalyse

Efter behandlingen af ​​cellerne med TCS i 48 timer blev cellerne trypsiniseret og fikseret med 70% absolut ethanol ved -20 ° C natten over. cellerne blev derefter vasket med koldt PBS og inkuberet i PI-opløsning indeholdende 0,1% Triton-X, 1 ug /ml RNase, og 1 mg /ml propidiumiodid ved 37 ° C i 30 minutter. DNA i hele celler blev farvet med PI og cellecyklus profil blev analyseret ved anvendelse af flowcytometri (FACSort, Becton Dickinson, Rutherford, NJ, USA).

6. Kolonidannelse assayet

Ved behandling med TCS, blev forankringsuafhængig vækst undersøgt via kolonidannelse assayet i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Koleske et al. [38] med mindre modifikationer. Kort beskrevet blev celler behandlet med FKS ved ikke-toksiske koncentrationer i 24 timer og derefter behandlet med 1 mM EDTA til fremstilling af enkelt cellesuspension. Cellerne blev suspenderet i RPMI-1640 indeholdende 10% FBS og 0,33% agarose, derefter 250 pi indeholdende 1 x 10

3-celler blev indlejret som et andet lag i en plade med 24 brønde over et 500 pi basislag indeholdende 10% FBS og 0,5% agarose. Cellerne blev tilført hver 3. dag ved at tilsætte 250 pi komplet medium. Efter 7 og 10 dage blev de resulterende kolonier fotograferet ved × 4 forstørrelse. Colony nummer og kolonistørrelse blev fastlagt på 10

th dag i kulturen.

7. Filopodia karakterisering

filopodia var præget af phalloidin-rhodamin farvning assay som beskrevet i Kowitdamrong et al. [39]. Celler blev behandlet med FKS ved ikke-toksiske koncentrationer i 24 timer i løsrive tilstand og podet med en tæthed på 2 x 10

3 celler /brønd på 96-brønds plade i 4 timer. Cellerne blev derefter vasket med PBS, fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS i 10 minutter ved 37 ° C, permeabiliseret med 0,1% Triton-X100 i PBS i 4 min, og blokeret med 0,2% BSA i 30 min. Efter denne blev cellerne inkuberet med 1:100 phalloidin-rhodamin i PBS i 15 minutter og vasket med PBS 3 gange. Filopodia blev derefter afbildet af en fluorescens mikroskop (Olympus IX51 med DP70).

8. Migration assay

Migration blev bestemt ved Boyden kammer assay som tidligere beskrevet i Kowitdamrong et al. [39]. Celler blev forbehandlet med FKS ved ikke-toksiske koncentrationer i 24 timer i fritliggende tilstand. Derefter blev cellerne podet ved en densitet på 5 x 10

4 celler /brønd på en øvre 24-transwell plade af Transwell filter (8-uM porestørrelse) i medium indeholdende 0,1% serum og 500 pi komplet medium var tilsat til det nederste kammer. Efter 24 timer blev ikke-migrerede celler i oversiden membran fjernet ved bomuld-swab aftørring. De celler, der migrerede til undersiden af ​​membranen blev farvet med 10 pg /ml Hoechst33342 i 30 min. Cellerne blev derefter visualiseret og scoret under et fluorescens mikroskop (Olympus IX51 med DP70).

9. Invasion assay

invasion assay blev udført ved anvendelse af 24-transwell kamre som tidligere beskrevet i Kowitdamrong et al. [39]. Transbrøndene blev overtrukket med 50 pi 0,5% matrigel på den øvre flade af kammeret og inkuberet natten over ved 37 ° C i en fugtig inkubator. Efter behandling med FKS ved ikke-toksiske koncentrationer i 24 timer i fritliggende tilstand blev cellerne podet ved en tæthed på 5 x 10

4 celler /brønd på den øvre kammer i medium indeholdende 0,1% serum og 500 pi komplet medium var tilsat til det nederste kammer. Efter 24 timer blev ikke-besatte celler i oversiden af ​​membranen fjernet ved bomuld-swab aftørring. Invaderet celler ved den basolaterale side af membranen blev fikseret med kold absolut methanol i 10 minutter og farvet med 10 pg /mL Hoechst33342 i 30 min. Cellerne blev derefter visualiseret og scoret under et fluorescens mikroskop (Olympus IX51 med DP70).

10. Western blot-analyse

Efter særlige behandlinger, celler blev inkuberet i en lysepuffer indeholdende 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1,5% Triton X-100, 150 mM natriumchlorid, 10% glycerol, 1 mM natrium orthovanadat, 50 mM natriumfluorid, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, og en kommerciel protease inhibitor blanding (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) i 2 timer på is. Cellelysater blev opsamlet og proteinindholdet blev bestemt under anvendelse af Bradford-metoden (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Lige store mængder protein fra hver prøve blev denatureret ved opvarmning til 95 ° C i 5 minutter med påsætningsbuffer og efterfølgende påsat en 7,5% SDS-polyacrylamidgelelektroforese til påvisning af EMT markører og E-cadherin ekspression eller 10% SDS-polyacrylamid gelelektroforese til påvisning af vandrende-relateret protein ekspression. Efter separation blev proteinerne overført til 0,45 um nitrocellulosemembraner. De overførte membraner blev blokeret i 5% fedtfri tørmælk i TBST (25 mM Tris-HCI (pH 7,5), 125 mM NaCl, 0,05% Tween 20) i 1 time, og derefter inkuberet med et specifikt primært antistof (1: 1.000 fortynding) natten over ved 4 ° C. Membranerne blev vasket tre gange med TBST i 5 minutter og inkuberet med peberrodsperoxidase-koblet isotypespecifikke sekundære antistoffer (1:2,000 fortynding) i 2 timer ved stuetemperatur. Membranerne blev vasket tre gange med TBST i 5 minutter og immunkomplekserne blev påvist ved forbedring med et kemiluminescerende substrat og kvantificeret under anvendelse analytiker /PC densitometri software (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

11. Statistisk analyse

Data blev indhentet fra tre uafhængige forsøg og præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse (SE). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af en-vejs ANOVA og post hoc-test (Tyrkiets test) på et signifikansniveau på

P

-værdier 0,05. SPSS 17.0 blev anvendt til alle statistiske analyser.

Resultater

1. Effekter af FKS på anoikis resistente H460 celler

anoikis resistente kræftceller blev brugt som model til at studere CTCs [36], [37], [40]. Anoikis resistent lungecancerceller blev genereret som beskrevet i Materialer og Metoder. Det konstateredes, at løsrevne H460 celler spontant dannede multicellulære aggregater efter dyrkning i 48 timer (figur 1b). For at belyse den mulige virkning af FKS på CTC lungecancerceller blev cytotoksiske virkning af forbindelsen på cellerne først karakteriseret. FKS ved koncentrationer i området fra 0,069 og 69 pM blev fundet i plasmaet fra TCS-eksponerede individer [4]. Derfor blev de anoikis resistente celler blev inkuberet med FKS på koncentrationerne af 0-10 uM i 24 timer og cellelevedygtighed vurderes ved MTT-assayet. Figur 1C viser, at TCS behandling faldt betydeligt celleoverlevelse ved dosen på 10 uM med ca. 80% af cellerne resterende levedygtige, mens behandling af cellerne med TCS på 0-7.5 uM forårsagede ingen signifikant toksisk virkning. Hoechst33342 /PI farvning assay bekræftede, at apoptose og nekrose ikke var påvises i TCS-behandlede celler på 0-7,5 uM. De apoptotiske celler med fragmenterede eller kondenserede kerner blev kun fundet i de celler behandlet med 10 pM TCS (figurerne 1D og E). Derfor blev koncentrationerne af FKS på 0-7.5 pM bruges til følgende eksperimenter.

Efter at have vist den toksiske effekt af FKS på anoikis resistente celler, vi næste undersøgt virkningerne af FKS på celledeling og cellecyklus. Celler blev behandlet med ikke-toksiske koncentrationer af FKS for 0-72 timer og proliferation af cellerne blev bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder. Proliferation respons anoikis resistente celler til FKS blev vist i figur 1F. TCS-behandlede celler viste ingen signifikant forskel med hensyn til celleproliferation i sammenligning med de ikke-behandlede kontrolceller. Disse resultater blev bekræftet ved cellecyklus-analyse under anvendelse PI og flowcytometri. Resultaterne viste, at TCS behandling forårsagede ingen signifikante effekter på cellecyklus (figur 1G og 1 H). Sammen resultaterne foreslog, at FKS besad nogen proliferativ effekt på anoikis resistente H460 celler i normal dyrkning tilstand.

2. TCS fremme cellevækst i forankringsuafhængig måde

Fordi forankringsuafhængig vækst af cancerceller er blevet vist at forøge metastase, Derefter undersøgte vi virkningen af ​​FKS på cancercellevækst i en sådan tilstand. Derved anoikis resistente celler H460 blev behandlet med TCS i 24 timer, før de blev udsat for kolonidannelse assayet. Cellerne blev derefter udsået i agarose lag for at forhindre celle-celle interaktion og binding. Koloni antal og koloni størrelse blev opnået ved at fotografere og tælling efter at cellerne blev dyrket i 7 og 10 dage. Den kolonidannelse blev vist i figur 2A. Koloni antal og koloni størrelse af hver behandling blev beregnet som en procentdel af kontrolgruppen og vist i figur 2B og C hhv. Resultaterne viste, at FKS ved koncentrationer på 5 og 7,5 uM signifikant øget kolonidannelse af anoikis resistente H460 celler. Imidlertid FKS ved begge koncentrationer væsentligt reduceret koloni størrelse sammenlignet med den for ikke-behandlede kontrolgruppe. Sådanne observationer indikerede, at FKS forfremmet forankringsuafhængig cellernes overlevelse, men faldt væksten af ​​cellerne i fritliggende tilstand. Vores resultater består med de tidligere resultater, at stigningen i forankringsuafhængig overlevelse med lav proliferativ evne er blevet observeret i kræftcellerne undergår EMT [11], [12], [41], [42].

(A) Celler blev forbehandlet med TCS (0-7,5 uM) i 24 timer og underkastet blød agar-kolonidannelse assayet, som beskrevet i “Materialer og metoder”. Repræsentative felter fra tre uafhængige forsøg blev fotograferet efter at cellerne blev dyrket i 7 og 10 dage. Scale bar er 1000 um. (B-C) Colony nummer og koloni størrelse blev bestemt ved billedet analysator på 10

th dag i kultur. Værdier er gennemsnit af de tre uafhængige tredobbelte prøver ± SE. *

P

. 0,05 versus ikke-behandlede kontrol

3. TCS inhiberende celle-celle interaktion

Tab af celle-celle-adhæsion blev fundet i cellerne under processen med EMT som et resultat fra cadherin skifte [7], [8]. For at undersøge virkningen af ​​FKS på celle-celle adhæsion af anoikis resistente H460 celler, vi podet celler i 24-brønds lav vedhæfte plade med en densitet på 1,5 × 10

5 celler /brønd og behandlet dem med ikke-toksiske koncentrationer af TCS. Den celle-celle interaktion blev observeret i dannelsen af ​​celleaggregering og fotograferet under anvendelse af et fasekontrastmikroskop. Samlede størrelse og antal blev bestemt og beregnet i forhold til den ubehandlede kontrol. Figur 3A viser, at FKS behandling signifikant ændret den samlede opførsel af cellerne til enkelt cellesuspension. Tilsætning af FKS resulterede i signifikant reduktion af både antallet og størrelsen af ​​flercellede aggregater på en dosis-afhængig måde (figur 3B og C). Disse resultater antydede, at FKS fremmet tab af celle-celle-adhæsion af anoikis resistente H460 celler, som er en dominerende egenskab ved de celler, som undergår EMT.

(A) Celler blev behandlet med TCS (0-7,5 uM) i 12 , 24 eller 48 timer i fritliggende tilstand og celle-celle interaktion blev fotograferet. Scale bar er 1000 um. (B-C) Efter behandlingen med TCS (0-7,5 uM) i 24 timer i fritliggende tilstand, aggregat størrelse og samlede antal blev bestemt ved billedanalysator. Dataene foreliggende hjælp af de tre uafhængige tredobbelte prøver ± SE. *

P

. 0,05 versus ikke-behandlede kontrol

4. TCS øge ekspressionen af ​​EMT markører

Vi næste undersøgt effekten af ​​FKS behandling på EMT markører, herunder N-cadherin, vimentin, sneglen, og slug. Anoikis resistent H460 celler blev behandlet med ikke-toksiske koncentrationer af FKS i 24 timer og EMT markører blev evalueret ved Western blotting. Figur 4A og B viser, at ekspressionsniveauet af E-cadherin blev signifikant reduceret som reaktion på FKS behandling i en koncentrationsafhængig måde. Desuden TCS signifikant forøget stigningen af ​​N-cadherin, vimentin, slug, og sneglen. Ekspressionen af ​​sneglen blev signifikant forøget ved TCS behandling ved 5 og 7,5 um i en dosisafhængig måde, mens ekspressionen af ​​slug blev kun signifikant induceret af behandling med FKS ved 7,5 uM. Disse resultater antydede, at FKS øget EMT fænotyper i disse celler.

(A) anoikis resistent H460-celler blev behandlet med TCS (0-7,5 uM) i 24 timer i fritliggende tilstand. Niveauet af N-cadherin, E-cadherin, vimentin, slug og sneglen blev bestemt ved western blotting. Blots blev testet igen med β-actin at bekræfte lig belastning. (B) De immunoblot signaler blev kvantificeret ved densitometri og gennemsnitlige data fra uafhængige forsøg blev normaliseret til resultaterne. Dataene foreliggende hjælp af de tre uafhængige tredobbelte prøver ± SE. *

P

. 0,05 versus ikke-behandlede kontrol

5. TCS-medieret EMT forbedrer celler migration og invasion

Et væsentligt kendetegn ved aggressive cancerceller er deres høje evne til at migrere og invadere [43], [44]. EMT er anerkendt som en vigtig faktor letter celle motilitet [12], [45]. Celler blev behandlet med FKS ved ikke-toksiske koncentrationer i 24 timer og migrationen og invasion adfærd af cellerne blev bestemt som beskrevet i Materialer og Metoder. Figur 5A viser, at TCS-behandlede celler udviste øget polaritet og filopodia. Filopodia af TCS-behandlede celler blev farvet med phalloidin-rhodamin som vist i figur 5B. TCS-behandlede celler udviste filopodia fremspring akkumuleres ved grænsen af ​​celler på en dosis-afhængig måde. Derudover, migration og invasion assay viste, at FKS øget cellemigration og invasion (figur 5C og D). Ovenstående resultater foreslog, at EMT induktion på TCS behandling fremmes filopodia dannelse og forstærkes vandrende og invasive evner anoikis resistente H460 celler.

(A) Celler blev behandlet med TCS på 0-7,5 uM i 24 timer og derefter fastgøres på konventionelle dyrkningsskåle i 4 timer. Cellemorfologi blev påvist ved fasekontrastmikroskopi. Scale bar er 25 um. (B) Efter den angivne behandling, filopodia og levedygtige celler blev detekteret ved phalloidin-rhodamin eller Hoechst33342 farvning hhv. Celler blev visualiseret under fluorescensmikroskop. Filopodia fremspring på hver behandling blev vist med pile. Scale bar er 5 um. (C) Celler blev forbehandlet med TCS (0-7,5 uM) i 24 timer. Transwell assay blev anvendt til at undersøge cellemigration. Migrerende celler ved den basolaterale side af membranen blev farvet med Hoechst33342 og visualiseret under fluorescensmikroskopi. Scale bar er 50 um. Det gennemsnitlige antal migrerende celler i hvert felt på den basolaterale side af membranen blev afbildet i forhold til kontrolgruppen. Værdier er gennemsnit af de tre uafhængige tredobbelte prøver ± SE. *

P

0,05 versus ikke-behandlede kontrol. (D) efter behandling med TCS (0-7,5 uM) i 24 timer blev celleinvasion evalueret under anvendelse transwell overtrukket med matrigel som beskrevet i “Materialer og metoder”. Invaderet celler ved den basolaterale side af membranen blev farvet med Hoechst33342 og visualiseret under fluorescensmikroskopi. Scale bar er 50 um. De gennemsnitlige antal invaderede celler i hvert felt over membranen blev afbildet i forhold til kontrolgruppen. Værdier er gennemsnit af de tre uafhængige tredobbelte prøver ± SE. *

P

. 0,05 versus ikke-behandlede kontrol

Desuden down-stream effektor proteiner, som er ansvarlige for celle motilitet blev bestemt ved hjælp af Western blotting. Cellerne blev behandlet med angivne koncentrationer af FKS i 24 timer og underkastet western blot-analyse. Ekspressionsniveauerne af migrerende-relaterede proteiner, herunder aktiveret FAK (phosphoryleret FAK, Tyr 397), FAK, aktiveret Akt (phosphoryleret Akt, Ser 473), Akt, aktiveret Rac1 (Rac1-GTP), og aktiveret RhoA (RhoA-GTP) var undersøgt. 6A og B viser, at TCS behandling signifikant øget niveauet for phosphoryleret FAK, aktiveret Akt, og aktiv Rac1-GTP. Men TCS besad ingen signifikant effekt på aktiveret RhoA niveau. Disse resultater antydede, at TCS-induceret EMT fremmet motilitet anoikis resistente H460 celler gennem aktivering af FAK /Akt-signalvejen samt Rac1 aktivering.

(A) anoikis resistente H460 celler blev behandlet med FKS ved 0 -7.5 pM i 24 timer i fritliggende tilstand og derefter fastgøres på konventionelle dyrkningsskåle i 4 timer. Niveauet af pFAK (Tyr 397), FAK, Pakt (Ser 473), Akt, blev aktiveret Rac1 (Rac1-GTP) og aktiveret RhoA (RhoA-GTP) bestemt ved western blotting. Blots blev testet igen med β-actin at bekræfte lig belastning. (B) De immunoblot signaler blev kvantificeret ved densitometri og gennemsnitlige data fra uafhængige forsøg blev normaliseret til resultaterne. Værdier er gennemsnit af de tre tredobbelte uafhængige prøver ± SE. *

P

. 0,05 versus ikke-behandlede kontrol

Diskussion

Lungekræft har høstet de fleste opmærksomhed i kræftforskning område siden denne type kræft betragtes som en væsentlig årsag til cancer-relaterede dødsfald [46]. Faktisk den høje metastaser sats i sådan en kræft gør den til den mest livstruende og i de fleste tilfælde metastase opdages på tidspunktet for første diagnose [47]. Fordi evne cancerceller til at metastasere kan øges ved fremgangsmåden ifølge EMT [9], [12], [48], den foreliggende undersøgelse rapporterer den positive regulerende virkning af FKS på EMT af humane cancerceller fremhæver mulige roman toksicitet forårsaget af dette stof.

TCS har været meget anvendt i over 30 år i sundhedspleje produkter samt i medicinsk udstyr. TCS er let og absorberes fuldstændigt efter oral administration. TCS er blevet identificeret i urinen, plasma og modermælk hos mennesker med en lang række niveauer afhængigt af individets daglige indtag, dens koncentrationen i produkterne samt ruten og frekvensen af ​​administration [2], [3]. De lave og høje koncentrationer af FKS i humant plasma er blevet rapporteret ved 0,02 og 20 pg /ml (0,069 og 69 uM) henholdsvis [4]. Tidligere undersøgelser rapporterede de mulige virkninger af FKS i induktion af hepatocellulære adenom og carcinom formationer i gnaver model [2]. For nylig, Ma et al. (2013) fandt, at FKS reducerede globale DNA methylering (GDM) i HepG2-celler, og de foreslog en reduktion som mulig mekanisme af FKS fremme tumor hos gnavere [49]. Eftersom global DNA hypometylering er associeret med afvigende genekspression, tab af prægning, kromosom ustabilitet og uregelmæssigheder, er det blevet vist at spille en vigtig rolle i kontrollen EMT og cancermetastase [50].