PLoS ONE: Tenfibgen ligand Nanoencapsulation Leverer Bi-Funktionel Anti-CK2 RNAi oligomer til Key steder for prostatakræft Målretning Brug Menneskelig xenotransplantattumorer i Mice

Abstrakt

Beskyttet og specifik levering af nukleinsyrer til maligne celler er fortsat en særdeles ønskeligt tilgang til cancerterapi. Her præsenterer vi data om fysiske og kemiske egenskaber, virkningsmekanisme, og pilot terapeutiske effekt af en tenfibgen (TBG) -shell nanokapsel teknologi til tumor-rettet levering af enkelte DNA /RNA kimære oligomerer rettet CK2αα ‘at xenotransplantattumorer i mus . Sub-50 nm størrelse TBG nanokapsel (S50-TBG) er et svagt negativt ladet, ensartet partikel på 15 – 20 nm størrelse, som giver beskyttelse til nukleinsyren last. DNA /RNA-kimær oligomer (RNAi-CK2) funktioner for at mindske CK2αα ‘ekspressionsniveauer via både siRNA og antisense mekanismer. Systemisk levering af S50-TBG-RNAi-CK2 specifikt rettet mod maligne celler, herunder tumorceller i knogle, og ved lave doser reducerer størrelse og CK2-relaterede signaler i ortotopisk primære og metastatiske xenograft prostata kræft tumorer. Afslutningsvis S50-TBG nanoencapsulation teknologi sammen med den kimære oligomer målrettet CK2αα ’tilbud betydelig lovende for systemisk behandling af prostata malignitet

Henvisning:. Trembley JH, Unger GM, Korman VL, Abedin MJ, Nacusi LP, Vogel RI, et al. (2014) Tenfibgen ligand Nanoencapsulation Leverer Bi-Funktionel Anti-CK2 RNAi oligomer til Key steder for prostatakræft Målretning Brug Menneskelig xenotransplantattumorer i mus. PLoS ONE 9 (10): e109970. doi: 10,1371 /journal.pone.0109970

Redaktør: Gnanasekar Munirathinam, University of Illinois, USA

Modtaget: 4. august, 2014 Accepteret: September 2, 2014; Udgivet: 15 oktober 2014

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Forfatterne bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte informationsfiler

Finansiering:. Merit review forskningsmidler (1IO1B001731) udstedt af Department of Veterans Affairs www.va.gov (KA). Forskning tilskud CA150182 tildelt af National Cancer Institute, National Institutes of Health, Department of Health og Human Services www.nih.gov (KA). Forskningsbevillinger CA158730 og DK067436-05 tildelt af National Cancer Institute og National Institute of Diabetes, Digestive Diseases og nyresygdomme, National Institutes of Health, Department of Health og Human Services www.nih.gov (BTK). Forskning giver HHS-N261-2008-00027 /N42CM-2008-00027C, CA99366, og CA119556 tildelt af National Cancer Institute, National Institutes of Health, Department of Health og Human Services www.nih.gov (GMU). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ansvarsfraskrivelse: Synspunkterne i denne artikel er forfatternes og ikke nødvendigvis afspejler stilling eller politik Veteranministeriet eller den amerikanske regering

Konkurrerende interesser:. GMU har ejerandel ( herunder patenter) i GeneSegues blev Inc. Ingen potentielle interessekonflikter videregives af andre forfattere. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Over hele spektret af malign sygdom, effektiv terapi for avancerede og /eller metastatisk cancer forbliver et kritisk mål i bestræbelserne på at reducere kræft dødelighed. Nukleinsyre-baserede cancerterapi fortsætter med at holde betydelig lovende for gen-specifikke, effektive, og lav toksicitet sygdom behandling, som har den yderligere potentiale overvinde terapeutisk resistens hyppigt observeret i aggressiv sygdom. Både antisense og siRNA-baserede lægemidler har indgået kliniske forsøg med meget moderat succes [1] – [4]. Vigtige overvejelser til systemisk brug af korte lineære nukleinsyrer som en terapeutisk del omfatter, at de er rettet specifikt til tumorceller i et beskyttet måde, effektivt cross cellemembraner og engagere cellens maskineri. Talrige tilgange inkorporerer disse begreber har vist anvendelighed i musemodeller, herunder, f.eks PSMA målrettede aptamer-siRNA kimærer, Her2 målrettede enkelt kæde fragmenteret antistof-protamin fusionsprotein formidlet siRNA levering og transferrin receptor-målrettede cyclodextrin-polymer medieret siRNA levering [1], [5], [6]. Vores tilgang til effektivt at levere nukleinsyre-terapeutiske midler til tumorer benytter en sub-50 nm størrelse nanokapsel omfatter liganden tenfibgen (TBG), det carboxyterminale fibrinogen kloden domæne af tenascin-C. TBG danner proteinliganden skallen af ​​nanokapsel og tillader receptormedieret målretning til cancerceller via tenascin receptorer, som er forhøjet i disse celler [7] – [12]. TBG nanokapsler specifikt optages af tumorceller og tumorafledte mikrokar men ikke af normale celler eller fartøjer [13] – [15].

CK2 (tidligere caseinkinase II eller CKII) er et ubikvitært protein Ser /Thr kinase med en heterotetramere struktur bestående af to katalytiske subunits (42 kDa α og /eller 38 kDa α «) og to regulatoriske subunits (28 kDa β) i α

2β

2, αα’β

2 eller α ‘

2β

2 konfigurationer. CK2 phosphorylerer et stort antal substrater med forskellige funktioner vedrørende cellevækst og proliferation, er konstitutivt aktiv, og er afgørende for overlevelse [16] – [22]. Desuden CK2 har vist sig at være opreguleret i alle cancere undersøgt, hvor en af ​​dens funktioner er at undertrykke apoptose [18], [23] – [29]. Vi har tidligere etableret effektiviteten af ​​vores 20-mer nukleinsyresekvens til målretning både CK2α og CK2α ‘. Vi har brugt denne sekvens som et antisenseoligonukleotid leveret systemisk til mus, der bærer ortotopisk PCA tumorer, som siRNA gods til S50-TBG nanokapsler leveret til dyrkede prostatakræft (PCA) celler, og som en enkeltstrenget RNAi-CK2 gods til S50-TBG nanokapsler afgives systemisk til mus, der bærer hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) xenografter [15], [30] – [32]. Her udvider vi på mekanismen og behandling nytte af både S50-TBG nanokapsel og RNAi-CK2 oligomer under anvendelse af humane prostatakræft xenograftmodeller indledt i mus i terapeutisk relevante websteder. Vi præsenterer data karakteriserer S50-TBG nanokapsel og dens systemiske levering proof-of-concept for evnen til at målrette vigtige

in vivo

PCA tumor vækst sites samt effekten af ​​at bruge RNAi-medieret nedregulering af CK2 som en terapeutisk tilgang.

Resultater

Tenfibgen nanokapsel design og stabilitet

for at opfylde vores mål om faldende CK2 udtryk specifikt i maligne prostata celler, et enkeltstrenget DNA /RNA kimære molekyle (RNAi-CK2) rettet mod CK2αα ‘subunit transkripter blev kondenseret og indkapslet i et protein shell sammensat af TBG. TBG nanokapsler er typisk 15-20 nm i størrelse, og indtast tumorceller via tenascin receptorer hjælp lipid tømmerflåde-medierede caveolar vej [13], [15]. Karakteristika og morfologien af ​​TBG-RNAi-CK2 nanokapsler samt strukturen og sekvensen af ​​RNAi-CK2 er opsummeret i tabel 1 og figur 1a, b. Stabilitet analyse af nøgne RNAi-CK2 kimære oligomer og S50-TBG-RNAi-CK2 nanokapsler (fig. 1c) viser, at efter proteinase K-fordøjelse af nøgne RNAi-CK2 oligomer (venstre panel) eller S50-TBG-RNAi-CK2 nanokapsler (højre panel), oligomeren lasten forbliver intakt. Desuden behandling af nanokapsler med DNase forud for proteinase K-fordøjelse viser, at nukleinsyren fragt er fuldt afdækket af indkapslingen procedure (fig. 1c, højre panel).

(a) Cartoon skildring af nanokapsel design. (B) Transmission elektronmikrografi af S50-TBG-RNAi-CK2 nanokapsler til

in vivo

undersøgelser. Forstørrelse 230.000 ×. Scale bar 100 nm. (C) Venstre panel: Naked RNAi-CK2 oligomer blev fordøjet med proteinase K i 24 til 96 timer. InP, ufordøjet input oligomer. Højre panel: Naked og S50-TBG indkapslet RNAi-CK2 oligomerer blev fordøjet med DNase efterfulgt af proteinase K som angivet ovenfor panelet. Bane 1 2, nøgne RNAi-CK2; 3 4, nøgen RNAi-CK2 med TBG-sukker nanokapslernes indgår i fordøjelsen; 5-7,

in vitro

brug formulering af S50-TBG-RNAi-CK2; 8-10,

in vivo

brug formulering af S50-TBG-RNAi-CK2

Potentielle virkningsmekanismer for RNAi-CK2 DNA /RNA-kimær oligomer

Den fælles DNA /RNA oligomer fragt RNAi-CK2 kunne fungere for at mindske CK2 udtryk gennem antisense- og /eller siRNA-mekanismer. For at løse dette, vi først undersøgt, om vores RNAi-CK2 oligomer design bestående af 14 standard phosphodiester DNA-rester i 5′-enden, 6 2 ‘

O

methyl RNA rester i 3′-enden, og en terminal propyl linker (mærket RNAi-CK2-6R i fig. 2a) kunne tjene som et incitament for RNase H1 aktivitet. Til sammenligning, vi medtaget den samme sekvens helt bestående af phosphorthioat (PS) modificeret DNA rester (AS-CK2-PS) samt en oligomer design med 8 standard DNA-rester ved 5′-enden, 12 2 ‘

O

-methyl RNA-rester i 3′-enden, og en terminal propyl linker (RNAi-CK2-12R). Dataene i figur 2a viser, at RNAi-CK2 oligomer med 14 DNA-rester (RNAi-CK2-6R) tjener som en effektiv tilskyndelse til RNase H1 aktivitet. I hele den resterende del af manuskriptet, er RNAi-CK2-6R benævnt RNAi-CK2 og er den terapeutisk lægemiddel indkapslet i TBG nanokapsler.

(a) RNase H1-substrat prøvning af forskellige DNA /RNA sammensætning formularer af RNAi-CK2 oligomerer. 5′-enden-mærket (*) RNA-probe blev udglødet med RNAi-CK2-6R, RNAi-CK2-12R eller AS-CK2-PS komplementære oligomerer, derefter inkuberet i forskellige perioder med RNase H1. Bogstaverne på venstre side af gelen og indpresningsdybde repræsenterer sekvensen stiger til 5′-enden-mærket RNA-substrat. Dimensionering stiger er angivet som AL (alkalisk lysis), C (minus RNase T1), og T1 (RNase T1 spaltning). RNase H1 fordøjelsesperiode er 0, 30, 60 og 120 s (banerne henholdsvis 1-4). Identiteten af ​​testen oligomeren angivet ovenfor banerne. Det indsatte viser en lysere eksponering af RNAi-CK2-12R RNase H1 reaktionsprodukter. Oligomerer suppleret med den mærkede RNA-probe er vist med pilespidser indikerer store spaltningssteder. For RNAi-CK2-6R og RNAi-CK2-12R oligomersekvenser, små bogstaver betegner 2 ‘

O

methyl RNA rester og store bogstaver er konventionelle phosphodiester- forbundne DNA-rester. AS-CK2-PS er en phosphorthioat bundet DNA-oligomer. (B) Påvisning af Ago2 /RISC spaltningsprodukter produceret af RNAi-CK2 transfektion i PC3-LN4 celler. 5’RNA ligase-medieret RACE blev udført for CK2α og CK2α ‘udskrifter som skitseret i online metoder. Bane 1 5, siControl transficerede celler; 2 6, siCK2 transficerede celler; 3 7, RNAi-CK2 transficerede celler; 4 8, ingen cDNA vand kontrol; M, DNA størrelsesmarkører. De forudsagte RACE produkter (CK2α, 242 bp, CK2α ‘, 236 bp) er angivet til venstre, og genet specifikke primere anvendte angivet ovenfor de baner. (C) Kortlægning af RACE spaltningsstedet blev opnået ved sekventering produkterne opnået i (b). Det mRNA sekvens er vist i små bogstaver, det transficerede oligomer er afbildet under mRNA, og spaltningssteder er angivet med en pilespids.

For at undersøge inddragelsen af ​​siRNA mekanismer, RNA oprenset fra TBG-RNAi -CK2 transficeret PC3-LN4 [33] celler dyrket på tenascin-C /fibronectin (TnFn) blev analyseret ved anvendelse af en modificeret 5′-RNA-ligase-medieret RACE teknik til at kortlægge potentielle spaltningssteder skyldes Ago2 /RISC-baseret behandling af DNA’et /RNA kimære oligomer. Oprenset RNA fra celler transficeret med siRNA til CK2 (samme målsekvens som RNAi-CK2) eller et ikke-targeting kontrolsekvens blev anvendt som yderligere kontrol. Som vist i figur 2b, blev spaltningsprodukter af CK2α og a ‘transkripter påvises i både RNAi-CK2 og siCK2 transficerede celler. Kortlægning af spaltningsstederne ved sekventering af RACE-produkter bekræftede placeringen spaltning i begge transkripter på det forudsagte 10

th nukleotid fra 5′-enden af ​​oligomeren [34] (Fig. 2c). Tilsammen indikerer disse resultater, at RNAi-CK2 kan nedregulere CK2α og CK2α ‘transkripter ved RNase H og Ago2 mekanismer.

Virkninger af TBG-RNAi-CK2 på maligne og benigne dyrkede celler

Vi har konsekvent observeret, at S50-TBG nanokapsler leverer deres last til perinukleære region forud nukleare indrejse, uanset kræft celletype. For ikke-nucleinsyre-arter, såsom kontrastmidler, er fragt typisk udført fra kerner til cytoplasma, hvor det ophobes i cytoplasmatiske organeller og der efterfølgende udføres. For yderligere at karakterisere menneskehandel og fragt frigivelse af S50-TBG nanokapslernes, maligne PC3-LN4 celler blev dyrket på TnFn coated tre-dimensionelle nanofiber stilladser (TnFn-3D) for at lette dannelsen af ​​lipidklumper er nødvendige for S50-TBG nanokapsel undersøgelser [15] . Figur 3a illustrerer transport til cellekernen, fragt frigivelse, og eksport af FeO-dextran over en 24 h periode efter behandling af cellerne med S50-TBG-FeO-dextran nanokapsler. I en lignende undersøgelse blev en sammenligning af S50-TBG-FeO-dextran optagelse 8 timer efter tilsætning af nanokapsler til celler udføres i PC3-LN4 og godartet prostatahyperplasi (BPH-1) celler. Resultaterne demonstrerer ivrig optagelse af TBG-Feo nanokapsler ved maligne men ikke godartede celler (fig. 3b).

(a) Optagelse over 24 timers S50-TBG nanokapsler med FeO-dextran gods i PC3-LN4 celler udpladet på TnFn-3D. Celler blev farvet med DAB-forstærket preussiske blå for jern og modfarvet med Fast Red. Scale bar 100 pm. (B) malignt celle-specifikke optagelse af S50-TBG nanokapslernes. S50-TBG-FeO-dextran optagelse blev bestemt ved jern farvning på 8 timer i PC3-LN4 og BPH-1-celler dyrket på TnFn- eller laminin-belagt nanofiber stilladser, hhv. Scale bar 100 pm. (C) celleproliferation virkninger af S50-TBG-RNAi-CK2 behandling i benigne og maligne prostata celler. PC3-LN4 og c4-2 dyrket på TnFn-3D og BPH-1-celler dyrket på laminin-3D i plader med 96 brønde blev behandlet med S50-TBG-RNAi-CK2 eller kontrol TBG nanokapsler indeholdende RNAi-RFP-6R målretning rød fluorescens protein som angivet.

3H-thymidin blev tilsat efter 48 timer, og cellerne analyseret ved 72 timer efter nanokapsel tilsætning. Resultater er udtrykt i forhold til behandling med S50-TBG sukkerindhold nanokapsler. S50-TBG nanokapsel last- og cellelinjer anvendte angivet under søjlerne. Midler ± SE er vist (n = 3 for alle). * P 0,005 i forhold til S50-TBG-sukker og -RFP; # P 0,01 i forhold til TBG-sukker; $ P = 0,006 i forhold til TBG-RFP. (D) S50-TBG-RNAi-CK2 behandling reducerede CK2α og CK2α ‘mRNA steady-state ekspressionsniveauerne i PC3-LN4 celler. mRNA isoleret fra PC3-LN4 celler dyrket på TnFn 24 og 48 timer efter S50-TBG-RNAi-CK2 eller -sugar behandling som indikeret, blev analyseret ved revers transkriptase real-time kvantitativ PCR for CK2α og CK2α ‘ekspression. HPRT transkript blev anvendt til at normalisere ekspressionsniveauer. Betyder, SE og p-værdier er præsenteret (24 timer CK2α n = 5, CK2α ‘n = 6; 48 h CK2α n = 2, CK2α’ n = 2).

Vi undersøgte effekten af S50-TBG-RNAi-CK2 om spredning af dyrkede prostata celler ved hjælp af meget tumorgene PC3-LN4 og c4-2 cellelinjer i sammenligning med BPH-1. Behandling af PC3-LN4 og c4-2 celler dyrket på TnFn-3D med S50-TBG-RNAi-CK2 i 3 dage resulterede i et betydeligt tab af celledeling målt ved [

3H] -thymidininkorporering, hvorimod TBG-RNAi -CK2 behandling af BPH-1-celler dyrket på en laminin matrix ikke reducere deres proliferation (fig. 3c). Brug af kvantitativ revers transkriptase real-time PCR, CK2α og CK2α ‘mRNA niveauer blev fundet signifikant reduceret i TnFn dyrkede PC3-LN4 celler 24 og 48 timer efter behandling med S50-TBG-RNAi-CK2 (fig. 3d), og faldet var svarende til den observeret efter behandling med TBG-siCK2 [31].

Biofordeling af TBG nanokapsler

for at vise, at S50-TBG nanokapsler binder maligne og ikke normal væv celler, og at de ikke gør akkumulere ikke-specifikt i det reticuloendotheliale system, blev frosne snit af PC3-LN4 ortotopisk xenograft tumor såvel som ikke-tumorbærende mus lever, nyre og milt underkastet nanokapsel bindingsassays. I disse assays blev vævssnit inkuberet med S50-TBG-RNAi-CK2 nanokapsler indeholdende syrisk hamster IgG inkluderet i proteinet skallen. Efter vasketrinene blev sektionerne behandlet til indirekte immundetektion af hamster IgG. Data i figur 4a og figur S1 påvise bindingen af ​​S50-TBG-RNAi-CK2 nanokapsler til tumorvæv, men ikke på lever, nyre og milt. Yderligere bevis for ligand-induceret nanokapsel vævsspecificitet er vist i figur 4b og fig S2 hvori asialoorosomucoid (ASOR) nanokapsler med syrisk hamster IgG inkluderet i skallen blev anvendt til at udføre nanokapsel bindingsassays. ASOR er liganden for det asialoglycoportein receptor udtrykt i hepatocytter, og dataene viser, at ASOR nanokapsel specifikt binder til leveren og ikke tumorvæv.

(a) Binding af S50-TBG-RNAi-CK2 til tumor men ikke lever, milt og nyre. Vævssnit blev underkastet immunofluorescensanalyse for syrisk hamster IgG efter inkubering med S50-TBG-RNAi-CK2. Scale bar 100 pm. (B) Binding af ASOR-DyDOTA til leveren, men ikke tumor, milt og nyre. Væv blev udsat for immunfluorescens analyse for syrisk hamster IgG efter inkubering med ASOR-DyDOTA. Scale bar 100 pm. (C) Analyse af skinneben knogle for tilstedeværelse af tumor og optagelse af TBG-DyDOTA nanokapsel 24 timer efter i.p. indsprøjtning. Øvre paneler, tumor indeholdende tibia: H immunfluorescenspåvisningen af ​​syrisk hamster IgG (grøn); direkte påvisning af Dy (rød); fusionere af grøn og rød. Center paneler, tumor indeholdende tibia: immunfluorescenspåvisningen af ​​isotypekontrol til Ck8 (grøn); immunfluorescenspåvisningen af ​​Ck8 (grøn); direkte påvisning af Dy (rød); fusionere af grøn og rød. Lavere paneler, mock injiceret tibia: immunfluorescenspåvisningen af ​​isotypekontrol til Ck8 (grøn); immunfluorescenspåvisningen af ​​Ck8 (grøn); direkte påvisning af Dy (rød); fusionere af grøn og rød. DNA kontrastfarve vises med blåt. Scale bars 100 um. (D) Analyse af lever, milt og blod for inflammatorisk respons. Immun-kompetente mus blev injiceret i.v. med 10 mg /kg af S50-TBG-RNAi-CK2 eller S50-TBG-sukker eller med tilsvarende volumen køretøjet og væv blev opsamlet efter 24 timer. Lever, milt og thymus masse præsenteres i forhold til musenes kropsvægt (venstre akse). Interferon-γ blev målt i blodet serum (højre akse).

At give validering for S50-TBG nanokapsel homing til maligne celler i mus, vi indledte prostatakræft implanteret i knogler ved direkte injektion af PC3- LN4 celler i skinnebenet. Den kontralaterale tibia i hver mus mock injiceres. Når tumorvækst var tydelig, blev musene injiceret med S50-TBG nanokapsler indeholdende dysprosium-DOTA-dextran som lasten (S50-TBG-DyDOTA) og opsamlet efter 24 timer til forarbejdning. Tumor tilstedeværelse i knogler blev verificeret ved H . Figur 5b). Den orthotopisk placering af de primære tumorer udelukket præcis måling af oprindelige tumorvolumener, således den manglende evne til nøjagtigt at bestemme start tumorstørrelser kan forklare, hvorfor den observerede primær tumor respons på 33 ng /kg var større end til 330 ng /kg.

(a) Primær tumor masse og lymfeknude tumor voluminer vises efter s50-TBG-RNAi-CK2 behandlinger på 33 og 330 ng /kg sammenlignet med køretøj. Betyder ± SE præsenteres (TBG-RNAi-CK2 n = 4; Vehicle n = 5). * P 0,05. (B) Andel af mus med fjerntliggende metastatiske tumorer efter s50-TBG-RNAi-CK2 behandlinger på 33 og 330 ng /kg sammenlignet med køretøj. Sammenligning anvendelse af Fishers eksakte test p = 0,046. (C) Immunblotanalyse for CK2α og CK2α ‘respons i primære tumorer. De øverste paneler repræsenterer 10 ug nukleare matrix lysat med normalisering til lamin B1. De nederste paneler repræsenterer 20 ug cytosolisk lysat med normalisering til laktat dehydrogenase (LDH). (D) Protein og signalering respons ekspressionsanalyse i repræsentative lymfeknude tumorer. Lymfeknude tumor frosne snit blev analyseret ved indirekte immunofluorescens co-farvning for AKT-1 phospho-S129 (grøn) og NF-KB p65 (rød). DNA kontrastfarve vises (blå). Målestokken 100 um (e) CK2α RISC spaltningsprodukter er til stede i S50-TBG-RNAi-CK2 behandlede tumorer. Totalt RNA blev isoleret fra tumorvæv og anvendes til 5’-ligering medieret RACE at bestemme, om RISC medieret spaltning af CK2α transkript indtraf. Bane 1 2, dag-10 vehikelbehandlede flanke tumorer; Bane 3, dag-5 S50-TBG-RNAi-CK2 behandlede flanke tumor; Bane 4, dag-6 S50-TBG-RNAi-CK2 behandlede flanke tumor; Bane 5, dag-10 S50-TBG-RNAi-CK2 behandlede flanke tumor; Bane 6, dag-10 S50-TBG-siCK2 behandlede flanke tumor; Bane 7, dag-6 S50-TBG-RNAi-CK2 behandlet ortotopisk tumor; Bane 8, no cDNA vand kontrol; M, DNA størrelsesmarkører. Den forudsagte 242 bp RACE produkt er angivet på venstre, størrelsen i bp af DNA-standarder, der er vist til højre og behandlingen administreres angivet ovenfor banerne.

For at evaluere CK2 target respons, kvantitativ real -Time revers-transkriptase PCR analyse blev udført på tumor-RNA. De data, demonstreret CK2α mRNA steady state-niveauerne blev reduceret med 11 til 14% og CK2α ‘med 3 til 6% i forhold til kontrol af køretøjer. Den begrænsede reduktion i CK2-mRNA-niveauer skyldes sandsynligvis tidspunktet for prøvetagningen, dvs. 11 dage efter den anden behandling. Tumorvæv blev lyseret og fraktioneret i nukleare matrix og cytosol for immunoblot analyser. Repræsentative resultater for tumorer fra hver gruppe er vist i figur 5c. Tætheden af ​​de bands for CK2α og CK2α ‘proteiner blev beregnet for alle tumorer og i fraktion nukleare matrix gennemsnitlige CK2α protein niveauer af 1,06 ± 0,19 til 33 ng /kg og 0,68 ± 0,06 til 330 ng /kg, og gennemsnitlig CK2α’ protein niveauer af 0,83 ± 0,17 og 0,43 ± 0,03 for 33 og 330 ng /kg, blev der observeret relativt til kontroller (fig. 5c, øvre paneler). På det højeste dosisniveau, både CK2α og CK2α ‘blev protein ekspressionsniveauerne tilsvarende reduceret (CK2α 0,51 ± 0,12; CK2α’ 0,39 ± 0,11). I den cytosoliske rum samt (. Figur 5c, lavere paneler)

lymfeknude tumorer blev analyseret ved indirekte immunpåvisning til CK2-signalering respons i AKT og NF-KB pathways. Stærkt reduceret phosphorylering af CK2-specifikke AKT-1 S129 [37] site blev observeret efter behandling med enten 33 ng /kg eller 330 ng /kg S50-TBG-RNA-CK2 (fig. 5d, øvre paneler). Tilsvarende blev et dramatisk tab af NF-KB p65 totalt protein også påvist, især på 330 ng /kg TBG-RNAi-CK2 (fig. 5d, center paneler).

RNA fra S50-TBG-RNAi- CK2 behandlede tumorer på dag 5, 6 og 10 fra et uafhængigt forsøg blev analyseret ved anvendelse af den modificerede 5′-RACE teknik til at kortlægge potentielle spaltningssteder. RNA fra en S50-TBG-siCK2 behandlet tumor samt fra kontrol tumorer blev inkluderet som komparatorer. Dag 5 og 6 tumorer udgør 2 behandlinger af S50-TBG-RNAi-CK2 givet på dag 1 og 4. Dag 10 tumorer udgør 3 behandlinger af enten S50-TBG-RNAi-CK2 eller -siCK2 på dag 1, 4 og 7. data viser, at CK2α RISC spaltningsprodukter detekteret på dag 6 og 10 (fig. 5e). I modsætning til dyrkede celler blev CK2α ‘spaltningsproduktet ikke detekteret. RACE-produkter blev sekventeret for både S50-TBG-RNAi-CK2 og -siCK2 behandlede tumorer, og spaltningsstedet detekterede var den samme som vist i fig. 2c. Reduceret CK2α mRNA udtryk for 10 til 20% i dag-6 og dag-10 tumorer blev verificeret.

Diskussion

Vi har tidligere foreslået løftet og tilpasningsevne af denne tumor-rettet nukleinsyre baseret terapi rettet mod CK2 i både prostatakræft og i hoved og hals pladecellekræft [14], [15], [30], [38], [39]. Her har vi givet oplysninger om beskyttelse af en oligomer gods fra TBG nanoencapsulation, maligne celle binding eller optagelse af TBG nanokapsler i dyrkede celler og i relevante prostatakræft steder i mus, muligt og observerede virkningsmekanismer for en enkelt DNA /RNA kimære RNAi oligomer, og proof-of-concept pilot mus xenograft terapidataene.

i pilot terapi studie observerede vi effekt ved hjælp af S50-TBG-RNAi-CK2 i en

in vivo

PCa model ved relativt lave dosering af 330 ng /kg, svarende til blot to behandlinger. På dette dosisniveau, virkninger på primær tumor vægt og metastatisk tumor dannelse og volumen var tilsyneladende og overensstemmende med nedsat CK2 udtryk og signalering. Vores 2-dosis resultater tåler sammenligning med en anden rapport af lavdosis

in vivo

gendæmpning, hvor ikke-målrettet lipid-baserede siRNA levering faldt target protein udtryk efter en enkelt dosis på 3 ug /kg [40] . I sammenligning med andre tumor målrettet siRNA fremføringsmidler, nået vores akut behandling undersøgelse reducerede target protein-ekspression og tumor vægt ved meget lavere dosisniveauer [5], [6]. Vi brugte et køretøj kontrol på dette særlige undersøgelse at give proof-of-concept, som TBG-RNAi-CK2 kunne producere et passende terapeutisk respons i xenograft prostata cancer tumorer. Efterfølgende gennemførte vi en separat undersøgelse designet til at identificere en oligomer indkapslet i TBG, som kunne tjene en kontrol for den indkapslede terapeutiske RNAi. Denne undersøgelse blev udført under anvendelse flank tumorer at lette den direkte måling af tumorvolumen. Sammenligning af RNAi oligomerer forhold til kontrol køretøj førte til identifikation af en passende kontrol i PCa, og sammenligningstal resultater viste, at både RNAi og køretøjets kontroller gav analoge resultater (dvs. ændringer tumor volumen helt overlapper). Dermed er resultaterne vist i fig. 5c give proof-of-concept, som TBG-RNAi-CK2 kan inducere tumor celledød

in vivo

som kan henføres til CK2 målet. Endvidere er de PC3-LN4 celler, der anvendes i disse undersøgelser er en model for PTEN-null, androgen receptor (AR) ikke-udtrykkende og androgen-uafhængige metastatisk PSA. Mens AR signalering anses for vigtigt for PCa celleoverlevelse uanset kastrationsresistent fænotype [41], [42], de PC3-LN4 xenotransplantattumorer anvendes til disse undersøgelser tjente til at give proof-of-concept data.

anvendelse af enkeltstrengede oligomerer for RNAi-aktivitet i dyrkede celler og i mus er tidligere blevet dokumenteret [43], [44]. Endvidere blev det vist, at substitution af DNA-rester i 5′-enden af ​​føringen streng (dvs. frø regioner placerer 2-8) frembringer en RNAi-molekyle med gendæmpning aktivitet og minimal ikke-tilsigtede virkninger; henviser RNA rester i 3′-enden af ​​føringen strengen er væsentlige [45]. Brug af vores DNA /RNA kimære enkeltstrenget RNAi-CK2 oligomer kombinerer effektivitet levere netop den guide streng med potentiel reduktion af off-target effekter på grund af fravær af en passager streng. Vi påvist ved

in vitro

eksperimenter, både antisense- og siRNA dæmpende mekanismer blev fremkaldt af RNAi-CK2; yderligere, efter anvendelse af S50-TBG-RNAi-CK2 til behandling xenotransplantattumorer, viste vi, at RISC spaltet CK2α mRNA blev udvundet 2 til 3 dage efter behandlingen. Vi har ikke afsløre CK2α ‘spaltning produkt i behandlede tumorer, selv om CK2α’ protein niveauer faldt. Dette antyder, at RNAi-CK2 oligomerer, som indeholder 1 mismatch til humant CK2α ‘mRNA og 2 fejlparringer til muse stromacelle CK2α’ mRNA primært kan inducere RNase H- stedet RISC-medieret spaltning af dette transkript

in vivo

. Denne ide understøttes af den væsentligt reducerede overflod af CK2α ‘spaltningsproduktet observeret med enten siRNA-CK2 eller RNAi-CK2 i studier af cellekulturer. Alternativt kan RNAi-CK2 blokere oversættelse af CK2α eller CK2α ‘udskrifter til protein.