PLoS ONE: prognostiske værdi af Malic Enzyme og ATP-citratlyase i ikke-småcellet lungekræft i unge og ældre

Abstrakt

Baggrund

Lungekræft er den hyppigste dødsårsag blandt maligniteter verdensplan. Forståelse dens biologi er derfor af afgørende betydning for at forbedre patientens prognose. I modsætning til ikke-neoplastiske væv, kræftceller udnytte glucose hovedsagelig til produktion af basale cellulære moduler “(dvs. nukleotider, aminosyrer, fedtsyrer). Ved cancer, æblesyreenzym (ME) og ATP-citratlyase (ACLY) er nøgleenzymer forbinder aerob glykolyse og fedtsyresyntese og kan derfor være af biologisk og prognostisk signifikans i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC).

Materiale og metoder

ME og ACLY ekspression blev analyseret i 258 NSCLC i sammenhæng med klinisk-patologiske parametre, herunder patientens overlevelse.

Resultater

Selvom samlet udtryk for både enzymer korrelerede positivt, blev ACLY forbundet med lokal tumor stadie, mens ME korreleret med forekomsten af ​​mediastinale lymfeknudemetastaser. Unge patienter overekspression ACLY og /eller ME havde en signifikant længere total overlevelse. Dette viste sig at være en uafhængig prognostisk faktor. Dette står i kontrast ældre NSCLC patienter, hos hvem overekspression af ACLY og /eller ME ser ud til at forudsige det modsatte.

Konklusion

I NSCLC, ME og ACLY viser forskellige enzym udtryk vedrørende lokale og mediastinum spredning . Vigtigst, vi har registreret en omvendt prognostisk effekt af ACLY og /eller ME overekspression i yngre og ældre patienter. Det kan derfor forventes, at behandling af NSCLC især, hvis målrette metaboliske veje, kræver forskellige strategier i forskellige aldersgrupper

Henvisning:. Csanádi A, Kayser C, Donauer M, Gumpp V, Aumann K, Rawluk J et al. (2015) prognostiske værdi af Malic Enzyme og ATP-citratlyase i ikke-småcellet lungekræft i unge og ældre. PLoS ONE 10 (5): e0126357. doi: 10,1371 /journal.pone.0126357

Academic Redaktør: Anthony W.I. Lo, Queen Mary Hospital, HONG KONG

Modtaget: December 26, 2014 Accepteret: April 1, 2015; Udgivet: Maj 11, 2015

Copyright: © 2015 Csanádi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data findes i papiret og dets støtte Information filer

Finansiering:. forfatterne anerkender støtten fra denne undersøgelse fra Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB850. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til malignitet dødsfald på verdensplan [1]. Trods enorme fremskridt inden for medicinske behandlinger, prognosen for patienter med lungecancer er stadig fattige med en 5-års overlevelse på mellem 7,9% og 16,5% [1, 2].

Ved at vise, at patienter gavn af forskellige kemoterapiregimer afhængig på histologiske subtype, Scagliottti afskaffet dogme til behandling af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) som et oncologically homogen gruppe [3]. Således behøver de store NSCLC undergrupper, adenocarcinom (LAC), planocellulært karcinom (SCC) og storcellet carcinom (LCC) ikke kun vise forskellige histologiske mønstre, men de nuværende specifikke biologiske og molekylære egenskaber, også. En bedre indsigt i disse særlige karakteristika vil hjælpe til direkte personlige behandlinger. I denne sammenhæng metaboliske ændringer forbundet med malign cellulær transformation er af afgørende betydning.

I årtier er det kendt, at maligne tumorer producere for meget lactat selv i nærvær af tilstrækkelig oxygen (Warburg virkning) [4]. Alligevel er mekanismerne bag dette fænomen ikke fuldt forstået. Maligne celler fungerer med metabolisk autonomi og glucose, dets metabolitter samt glutamin er ikke kun energikilder. De tjener også som grundlæggende bygningsenheder via generation af vigtige molekyler, der er nødvendige for cellulær og dermed ondartet tumor vækst [5, 6].

Som enzymer af glukosemetabolismen udgør en fælles nedstrøms endepunkt for forskellige tumor driver mutationer, de kunne være lovende mål for nye kemoterapeutiske stoffer, også [7]. Blandt disse enzymer, ATP-citratlyase (ACLY) og æblesyre enzym (ME) er to centrale spillere: ME tjener som kilde til reduktive ækvivalenter i højt cataplerotic maligne celler. ACLY bygger en fysiologisk shunt mellem glukosemetabolismen og fedtsyre-syntese [6].

Vi analyserede derfor udtrykket mønstre af disse to enzymer til at belyse deres tilknytning til klinisk-patologiske træk og deres biologiske indvirkning på patientens overlevelse i NSCLC . Vores resultater viser tydeligt, at funktionelle metaboliske ændringer i NSCLC er komplekse, forskellige i histologiske undertyper og forudsige forskellige resultater afhængig af patientens alder.

Materialer og metoder

Etik erklæring

undersøgelse er blevet godkendt af University Medical center Freiburg (Etik udvalg University Medical center Freiburg, EK 10/12). Patient data er blevet pseudonymiserede og resultater opnået ved denne undersøgelse ikke påvirke patientens behandling. Arkiverede materiale var blevet brugt i mindst tre år efter den første diagnose. Ved at underskrive behandlingen kontrakt med University Medical Center Freiburg, hver patient enig i, at hans /hendes pseudonymiseret væv (r) kan være under mistanke tilbagevirkende kraft forskningsforsøg ikke forstyrre eller påvirke de nuværende behandlingsmuligheder. Den etiske komité af University Medical Center Freiburg derfor godkendt, at ingen enkelt undersøgelse specifik tilladelse fra hver patient skulle indhentes.

Kohorte

258 patienter NSCLC blev inkluderet i denne undersøgelse. Patienterne gennemgik kirurgisk behandling mellem 1990 og 2007 (Institut for Thorax kirurgisk, University Medical Center Freiburg, S1 datasæt) og ikke havde modtaget neoadjuverende terapi. Fiksering, ekstrapolationsfaktoren og paraffinindlejring blev udført ifølge rutinemæssige protokoller. Alle kræfttilfælde blev omklassificeret i overensstemmelse med den gældende WHO klassifikationen [8] blev iscenesættelse revurderet i konkordans med den nyeste UICC klassifikation [9]. Tissue multi arrays (TMA) blev konstrueret med en kernediameter på 2 mm. Fra alle prøver tre TMA-kerner blev taget fra forskellige steder for at undgå bias fra intratumoral heterogenitet. En TMA 36 tilsvarende ikke-neoplastiske lungevæv tjente som kontrolgruppe. (S1 Tabel: resumé af klinik-patologisk data)

Immunhistokemi og scoring

Heat-induceret antigen hentning blev udført ved pH 9,0 for ACLY og ved pH 6,0 for mig.. Primært antistof inkubation var 30 minutter (ACLY: 1: 400, cellesignalering Technologies 4331S; ME: 1: 2000 fortynding klon 3H5, Abnova Biozol). Visualisering blev udført ved alkalisk fosfatase med Fast Red-typen chromogen (DAKO REAL K5005) og peberrodsperoxidase med diaminobenzidin baseret chromogen (DAKO FLEX EnVision) for ME og ACLY hhv. Nuklear kontrastfarvning blev gennemført med hematoxilin (Mayers sure haemalaun, Waldeck, katalog nr. 1A-552). Den DAKO Autostainer platform blev brugt til farvning procedurer.

For begge immunhistokemiske pletter, ACLY og ME, protokoller blev valideret for specifik farvning ved udeladelse af de primære antistoffer. Disse valideringsprocedurer viste ikke uspecifikke kromogene reaktioner.

Enzym udtryk blev betragtet positivt, hvis specifik cytoplasmatisk farvning blev opdaget. For ACLY, blev specifikke nukleare positivitet også vurderet. Immunhistokemisk scoring fulgt tidligere beskrevne protokoller [10, 11] og blev evalueret i analogi med internationalt accepterede scoring af prædiktive markører [12, 13]. Farvningsintensitet blev evalueret semikvantitativt anvendelse af en 4-træt pointsystem (figur 1). Procentdelen af ​​positive tumorceller blev bestemt ved at betragte alle positive tumorceller i forhold til deres absolutte antal. Procent tal blev afrundet til næste decimal. Nukleare og cytoplasmatiske udtryk for ACLY blev vurderet separat

(A) -. (D) Specifik ACLY-ekspression var påviselig i kernen, eller i cytoplasmaet. (EN); tumorvæv uden specifik ACLY farvning intensitet score = 0; (B) svag specifik cytoplasmatisk ACLY farvning intensitet score = 1; (C) moderat nukleare ACLY farvning intensitet score = 2 og moderat cytoplasmatisk ACLY farvning intensitet score = 2; (D) stærk cytoplasmatisk ACLY farvning intensitet score = 3, derudover moderat nuklear farvning er til stede; (E) – (H) Særlig cytoplasmatisk ekspression af ME, (E) tumorvæv uden specifik cytoplasmatisk ME farvning intensitet score = 0 (F); svag specifik cytoplasmatisk ME farvning intensitet score = 1 (G); moderat cytoplasmisk ME farvning intensitet score = 2 (H) og med stærk specifik cytoplasmatisk ME farvning intensitet score = 3 (E). (Forstørrelse; 20x)

Statistik

For alle statistiske analyser betyder værdier af de tre TMA-kerner i hvert enkelt tilfælde blev anvendt. Forskelle i enzym udtryk blev evalueret af ikke-parametriske tests.

Survival analyse inkluderet Kaplan-Meier kurver og log-rank test. For multivariate analyser, blev Cox-regressionsmodeller anvendt. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS 21,0 softwarepakke. Niveau af signifikans blev sat til 5% (dvs.

s

0,05). Den overordnede betydning er korrigeret for multipel testning ved hjælp af Benjamini-Hochberg metoden [14] (S2 tabel).

Resultater

ACLY og ME er opreguleret i NSCLC

ACLY ekspression i tumorvæv blev påvist i både, cytoplasmaet og kernen (figur 1), hvorimod ME var påviselig kun i cytoplasmaet (figur 1). Immunohistokemisk enzymekspression var signifikant højere i tumorceller (ACLY Nucl .: 19.92 +/- 21.57; ACLY cytopl .: 22.23 +/- 21.57; ME: 52,49 +/- 37,86) end i tilsvarende ikke-neoplastisk lungevæv (ACLY Nucl. : 16,57 +/- 16,75; ACLY cytpl .: 11,43 +/- 20,97; ME: 9,53 +/- 10.50;

s

0,001)

ME, men ikke ACLY er forskelligt udtrykt i histologiske NSCLC undertyper

Som differentiering mellem LAC og SCC i lungerne er af terapeutisk betydning, vi analyserede ekspressionsmønstre i forhold til disse to histologiske NSCLC undertyper. ME udtryk var højere i SCC i forhold til LAC (

s

0,001). ACLY viste ikke en signifikant sammenhæng med histologisk undertype. Desuden blev en signifikant højere udtryk kun for ME fundet hos rygere sammenlignet med ikke-rygere (

s

= 0,012).

ACLY men ikke ME udtryk er forbundet med lokal tumor stadie

Analyse immunologiske mønstre af ACLY og ME i sammenhæng med lokale tumor stadier, dvs. pT, bemærkede vi, at ACLY udtryk var signifikant lavere i fremskredne pt-etaper. Selvom en signifikant positiv samlet korrelation af ME og ACLY blev fundet (nuklear ACLY-ME: korrelationskoefficient = 0,179,

s

0,001; cytoplasmatisk ACLY-ME: korrelationskoefficient = 0,155,

p

= 0,001), har ME udtryk ikke vise en sammenhæng med lokale tumor etaper. Analoge resultater blev observeret for ACLY udtryk i sammenhæng med metrisk tumorstørrelse (ACLY cytoplasmatisk: korrelationskoefficient -0,135,

s

= 0,003; ACLY nukleare: korrelationskoefficient: -0,144,

s

= 0,001 ; ME: korrelationskoefficient = 0,006,

s

= 0,887). Mens infiltration af visceral lungehinden bidrager også til lokal tumor fase, blev der ikke observeret nogen statistisk signifikant sammenhæng med hensyn til pleural invasion (ACLY cytoplasmatisk:

s

= 0,186; ACLY nukleare:

s

= 0,532; ME :

s

= 0,971)

ME, men ikke ACLY udtryk er forbundet med mediastinale metastatiske begivenheder

for at undersøge forholdet mellem ME og ACLY udtryk med systemisk tumor ekspansion, vi. særskilt analyseret NSCLC af nodal positive patienter i sammenhæng med placeringen af ​​lymfeknudemetastaser. Tilstedeværelsen af ​​mediastinal lymfeknudemetastaser var signifikant korreleret med højere udtryk for ME i primær tumorvæv (

s

= 0,041), men ikke af ACLY (cytoplasmatisk:

s

= 0,511; nukleare:

s

= 0,446). Denne forening var særlig stærk i LAC (ME:

s

= 0,030)

Overekspression af enten ME, ACLY eller begge er en uafhængig prognostisk faktor

For at undgå statistisk bias. , middelværdier af ME og ACLY udtryk blev brugt til dichotomization. I den samlede analyse blev fundet nogen signifikant korrelation mellem ME og ACLY overekspression med patientens overlevelse. Lignende resultater blev opnået i undergruppe analyser efter rygevaner, køn, histologiske sortering, Pt- eller PN-etaper. Alder stratificering blev udført ved hjælp af median alder (65 år) ved NSCLC diagnose. Ingen signifikant sammenhæng mellem alder og pT PN eller samlet UICC stadium blev opdaget. Hos unge patienter, nuklear ACLY overekspression vist sig at være forbundet med en gunstig samlet overlevelse (

s

= 0,029), mens dette ikke var tilfældet hos patienter over 65 år (

s

= 0,626 ). ME overekspression i disse to aldersgrupper undergrupper viste kun en statistisk tendens hos ældre patienter (

s

= 0,093). Unge patienter med overekspression af ME eller nukleare ACLY eller begge i deres tumorer, havde en signifikant længere total overlevelse sammenlignet med dem uden overekspression af disse enzymer (

s

= 0,007, Fig 2). Multivariat analyse, som omfattede UICC stadium, den eneste yderligere prognosticator i denne patientgruppe, bevist dette at være en uafhængig prognostisk faktor (

s

= 0,002; tabel 1). På den anden side, overekspression af en af ​​de to enzymer eller begge resulterede i kortere samlet overlevelse hos ældre patienter (fig 2,

s

= 0,058).

A) Overekspression af ACLY er forbundet med et bedre resultat i unge patienter, men ikke hos ældre patienter. B) ME overekspression viser en statistisk tendens til en dårligere samlet overlevelse hos ældre patienter. C) Unge patienter, hvis tumorer afsløret enten ACLY og /eller ME overekspression havde en signifikant længere total overlevelse sammenlignet med dem uden overekspression af enten enzym. Men i ældre patienter overekspression af enten ACLY og /eller ME kan være forbundet med dårligere samlet overlevelse.

Diskussion

På grund af sin høje forekomst og dødelighed, lungekræft stadig fortsat en af ​​de store sundhedsmæssige byrder, på verdensplan. Det er derfor af afgørende betydning for bedre at kunne forstå biologi for at udvikle nye egnede behandlingsmuligheder.

Den metaboliske skifte af tumorceller til aerob glykolyse er en velkendt begivenhed. På den ene side, det tjener til at lette optagelsen og inkorporering af næringsstoffer i basale cellulære byggesten. På den anden side, resulterer i produktion af lactat, som letter metastasedannelse og terapi resistens [15, 16].

I flere maligne tumorer er det blevet vist, at ACLY er ikke kun elementære til de-novo fedtsyresyntese [17], men også dens hastighedsbegrænsende trin [18-21]. Som en af ​​de vigtigste enzymer af de-novo-fedtsyresyntese, ACLY genererer cytosolisk acetyl-coenzym A (acetyl-CoA) [22, 23] og oxaloacetat. Sidstnævnte reduceres til malat ved malat dehydrogenase. Den cytosoliske isoform af æblesyreenzym omdanner malat til pyruvat [24]. Pyruvat, der ikke shuttled ind i mitochondriet at generere oxaloacetat, er yderligere omdannes til lactat [6]. ACLY og ME ekspression kan derfor ændres i maligne tumorceller sammenlignet med ikke-neoplastiske væv. Sammenligning ikke-neoplastisk lunge- og NSCLC væv, fandt vi en statistisk signifikant stigning i både, ACLY og ME udtryk inden neoplastiske celler. Dette er i konkordans med andre konklusioner vedrørende ændret kulhydrat metabolisme i kræft [10, 11, 25-27]. I vores kohorte, ME og ACLY udtryk, nuklear samt cytoplasmatisk, viste en positiv sammenhæng. Det faktum, at korrelationskoefficienter er ret små kan afspejle komplekse vekselvirkninger mellem flere metaboliske enzymer samt høj histomorfologisk heterogenitet NSCLC. Sammenligning af immunhistokemiske ekspressionsmønstre af ME og ACLY støtter yderligere denne erklæring kun ME-udtryk betydeligt forskellig mellem LAC og SCC. Denne form for differentiel ekspression mønstre i NSCLC-undertyper er også blevet vist for andre enzymer i forbindelse med ændrede cellulære cancer metabolisme [10, 11, 28].

Siden SCC ofte findes i storrygere og LAC er såkaldte typisk ikke-ryger carcinomer, signifikant højere ekspression af ME i tumorer fra patienter med rygevaner er ikke overraskende. Dette kan skyldes forskellige hypoxiske tilstande af tumorer og /eller patienter, der fører til forskellige metaboliske stater i NSCLC og sandsynligvis i SCC i forhold til Latinamerika og Caribien, også. Størstedelen af ​​rygning associeret NSCLC besidder p53-mutationer og dermed er frekvensen af ​​p53-mutationer i SCC højere sammenlignet med LAC [29]. For nylig, Jiang kunne kontrollere, at ME udtryk er reguleret af p53. Ifølge deres resultater, p53 er ansvarlig for nedregulering ME udtryk [30]. Disse resultater er i god overensstemmelse med vores, at ME ikke kun overudtrykt i NSCLC forhold til tumor gratis lungevæv, men også, at ME udtryk er højere i SCC i forhold til LAC og hos rygere sammenlignet med ikke-rygere.

Slående til os var, at ACLY og ME afslørede forskellige ekspressionsmønstre afhængig lokal eller mediastinal tumor spredning. Mens ACLY var negativt korreleret med lokal tumor forlængelse målt ved pT-stadium, samt metrisk tumorstørrelse, ME kun viste en signifikant sammenhæng med mediastinale metastatiske begivenheder i forhold til hilar lymfeknudemetastaser (PN1 vs pN2 /pN3). Ændringer i tumor stofskifte, derfor synes at være kompliceret og kan være forskellig, ikke kun i histologiske undertyper, men også i henhold til lokal eller systemisk tumor spredning.

Desuden i de seneste forskningsresultater, ekstra funktioner i ACLY siden involvering i glukosemetabolismen er blevet påvist: ACLY er også et centralt-player i histonacetylering. Disse fund tyder på en forbindelse mellem vækstfaktor ændringer i metabolisme kræft og genekspression, som er realiseret ved ACLY [31]. Analogt med Wellen, Londono Gentile offentliggjort for nylig, at ACLY mindste delvis regulerer DNA methyltransferase-1 (DNMT1) [32]. Forskellige lokalisering af ACLY kan derfor afspejle forskellige aktiviteter i cellen, dvs. cytoplasmatisk ACLY er overvejende involveret i kræft cellens stofskifte, mens nukleare ACLY overvejende involveret i regulering af genekspression [31, 33]. Af denne grund, vi vurderet forskellige lokaliseringer af ACLY, dvs. nukleare og cytoplasmatisk, hver for sig. I konkordans med vores resultater, viste Migita at ACLY var signifikant højere udtrykt i LAC sammenlignet med ikke-neoplastisk lungevæv [22]. I deres offentliggørelse, ACLY var også en prognostisk faktor, mens de viste, at høje niveauer af ACLY var forbundet med en dårligere resultat [22]. Vi kunne ikke reproducere dette fund af Migita. Men i modsætning til deres resultater, nuklear ACLY overekspression var til væsentlig gavn i unge patienter i vores kohorte. Sammenlignet med Migita, vi ikke kun omfattede LAC men også SCC samt LCC og immunhistokemisk analyse af ACLY ekspression blev vurderet ikke kun for farvningsintensitet men også efter den del af positive celler, og med hensyn til subcellulær lokalisering af ACLY. Ud over disse analytiske forskelle, Migita undersøgte udtryk for fosforyleret ACLY, mens vores antistof er rettet mod ACLY uanset sin fosforylering status.

Det er endvidere vores detaljerede undergruppe analyser, vi kunne vise, at patientens alder kan også indflydelse NSCLC biologi. Mens høje niveauer af enten ACLY og /eller ME var en god prognostisk faktor hos patienter yngre end 65 år, blev opdaget en statistisk tendens til det modsatte hos ældre patienter. Dette kan indikere forskellige ændringer i tumor metabolisme og enzym-funktion. Adskillige metaboliske ændringer er impliceret med ældre alder, såsom øget hypoxi og højere forekomst af diabetes mellitus type 2. I en stor kohorteundersøgelse blev type 2-diabetes mellitus er forbundet med en højere risiko for at udvikle flere typer af kræft, herunder lungekræft [34 ]. I denne sammenhæng både, ACLY og ME har vist sig at være vigtigt for glucose relateret insulinsekretion [24]. Af det faktum, at forekomsten af ​​type 2-diabetes samt generaliseret hypoxia grundet nedsat lungefunktion er højere hos ældre patienter, vores fund af skiftende indvirkning ACLY og ME enzymatisk montering i NSCLC funktionelt kan understøttes. Mangfoldighed NSCLC i forskellige aldersgrupper er kendt for genetiske afvigelser og forekomster af chauffør mutationer [35, 36]. Således er vores fund, at ændringer af metaboliske enzymer kan være af forskellig indflydelse på kræft biologi i NSCLC, yderligere at understøtte, at lungekræft opstår hos unge patienter kan være biologisk og genetisk forskellige fra dem af ældre patienter.

In vitro og in vivo undersøgelser viser, at nye farmakologiske midler inhiberer ACLY kan føre til betydelig nedgang i cellulær og tumorvækst [22, 33, 37, 38]. Da vores resultater viser, at overekspression af ACLY og /eller ME i patienter over 65 år har en tendens til at have en dårligere prognose, de formoder, at ældre patienter kan drage størst fordel af disse ACLY inhibitorer.

Afsluttende, ekspressionsmønstre af de metaboliske enzymer ACLY og ME er af forskellig biologisk effekt på overlevelse i NSCLC patienter. Mens der i unge patienter overekspression af enten ACLY eller ME er vejledende for en gunstig samlet overlevelse, det har en tendens til at have den modsatte effekt hos ældre patienter. Med udviklingen af ​​nye hæmmende lægemidler rettet mod ACLY, vores resultater støtte nye behandlingsmuligheder med særlig fokus på alderen NSCLC patienter.

Støtte Information

S1 Table. Oversigt over klinisk-patologiske data

doi:. 10,1371 /journal.pone.0126357.s001

(DOCX)

S2 Table. Resumé af de præsenterede relevante statistiske testresultater korrigeret for multipel testning

doi:. 10,1371 /journal.pone.0126357.s002

(DOCX)

S1 datasæt. Komplet datasæt

doi:. 10,1371 /journal.pone.0126357.s003

(XLS)

Tak

Vi takker Nicola Bittermann for hendes teknisk support og rådgive. Vi anerkender støtten fra denne undersøgelse fra Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB850 og ved tumor bred af Comprehensive Cancer Center Freiburg (CCCF).