PLoS ONE: A Novel og effektiv Cancerimmunterapi Mouse Model Brug antigen-specifikke B-celler in vitro

Abstrakte

immunterapier såsom adoptiv overførsel af T-celler eller naturlige dræberceller, eller monoklonalt antistof (MoAb) behandling er for nylig blevet anerkendt som effektive midler til behandling af kræftpatienter. Imidlertid har adoptiv overførsel af B-celler eller plasma celler, der producerer tumorspecifikke antistoffer ikke er blevet påført som en terapi, fordi langtidsdyrkning og selektiv ekspansion af antigen-specifikke B-celler har været teknisk meget vanskelig. Her beskriver vi en hidtil ukendt cancer immunterapi, der bruger B-celle adoptiv overførsel. Vi viser, at germinale-centrum-lignende B-celler (IGB celler) induceret in vitro fra muse naive B-celler bliver plasmaceller og producere IgG antistoffer i mere end en måned i knoglemarven af ​​ikke-bestrålet recipientmus. Når de overføres i mus, IGB celler, der producerer antistof mod et surrogat tumorantigen undertrykt lunge metastase og vækst af muse-melanomceller, der udtrykker det samme antigen og forlængede overlevelsen af ​​modtagerne. Derudover har vi udviklet et hidtil ukendt kultursystem kaldet Fais til selektivt udvide antigenspecifikke iGB celler anvender det faktum, at IGB celler er følsomme for Fas-induceret celledød, medmindre deres antigenreceptorer ligeres ved membranbundne antigener. De valgte IGB celler effektivt undertrykt lunge metastase af melanom celler i adoptiv immunterapi model. Som humant blod B celler kan opformeres som IGB celler under anvendelse dyrkningsbetingelser der svarer til muse IGB cellekulturer, vore data antyder, at det vil være muligt at behandle cancerpatienter-bærende ved adoptiv overførsel af cancer-antigen-specifikke IgE celler udvalgt i vitro. Denne nye adoptiv immunterapi bør være et alternativ til den møjsommelige udvikling Moabs lægemidler mod kræft, for hvilke der i øjeblikket findes ingen effektive behandlinger

Henvisning:. Moutai T, Yamana H, Nojima T, Kitamura D (2014) A Novel og effektiv Cancerimmunterapi musemodel Brug antigenspecifikke B-celler in vitro. PLoS ONE 9 (3): e92732. doi: 10,1371 /journal.pone.0092732

Redaktør: Yoshiki Akatsuka, Fujita Health University, School of Medicine, Japan

Modtaget: December 28, 2013; Accepteret: 24. februar, 2014 Udgivet: 19 marts 2014

Copyright: © 2014 Moutai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Takeda Science Foundation, Grants-in-Støtte til videnskabelig forskning (B) (22.390.097) fra Japan Society for fremme af Science (JSP’er) og tilskud-in-Støtte til videnskabelig forskning på prioriterede områder (22021042) fra Ministeriet for uddannelse, kultur, sport, videnskab og teknologi i Japan (MEXT) (til DK), og ved Grants-in-Aid for JSP’er Fellows (til TM). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Immunterapi er for nylig blevet mere bredt accepteret som et effektivt middel til behandling af kræftpatienter. Den vigtigste spiller i cellemedieret cancerimmunterapi har været cytotoksiske T-lymfocytter (CTL’er) rettet mod tumorceller, som genkender via deres T-celle-receptor (TCR) et bestemt peptid afledt fra et tumorantigen (Ag) præsenteret af MHC I på tumorceller. Sådanne T-celler fra udskårne tumorvæv eller patienternes blod selektivt ekspanderes in vitro på syngene Ag-præsenterende celler (APC’er), som udtrykker tumoren Ag med cytokiner såsom IL-2 og derefter overført tilbage til patienterne [1], [2]. Relativt ikke-specifikke versioner af cellulær immunterapi er også blevet klinisk testet, herunder dem, der anvender T-celler og NK-celler ekspanderede gennem stimulation med IL-2 og anti-CD3-antistoffer (Abs), med /uden yderligere cytokiner [3], [4] . For nylig, in vitro ekspanderede dendritiske celler (DC’er), som er meget effektiv APC, er også blevet anvendt til at stimulere tumor-Ag-specifikke CTL’er samt CD4

+ T-celler in vivo [5] – [7]. Disse behandlinger er baseret på adoptiv celle transfer hidtil ikke været almindeligt vedtaget som en mulighed for kræftbehandling, da deres kliniske succes har været begrænset, mens de kræver tidskrævende laboratoriearbejde, herunder individuel cellekultur i flere uger i en kvalitet-kontrollerede rene rum .

på den anden side, har Ab-baserede immunterapi været hastigt voksende som et lovende cancer immunterapi. Faktisk mere end et dusin monoklonalt Abs (MoAb’er) er i dag godkendt til behandling af cancer hos mennesker [8] – [10]. Som en anti-cancer stof, MoAbs har enorme fortjenester i forhold til kemoterapi, da de målrette kun de celler, der udtrykker specifikke Ags. Den biokemiske natur og biologiske træk ved hver isotype af Ab’er er velkendte, og så er de mekanismer, hvorved de medierer målcellelysis, nemlig Ab-afhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC) og komplementafhængig cytotoksicitet (CDC) [11], [12]. Som naturligt eksisterende proteiner i alle personer, forventes Abs at have færre bivirkninger, og som sådan, er det lettere at forudsige deres resultater som et lægemiddel. Sammenlignet med de cellemedierede immunterapier ovenfor beskrevne, Ab-medieret immunterapi er enklere at udføre, hvis leveringen af ​​MoAb er passende. Men MOAB lægemidler har også ulemper: De er dyre, og deres udvikling stadig udfordrende, kræver megen tid og omkostninger, fra animalsk immunisering gennem screening af hybridomer, til genkloning og rekombination fremgangsmåder til deres humanisering, hvilket er nødvendigt for at undgå en immunrespons af modtageren [10], [13]. Tumor Ags at MoAb lægemidler rettet mod typisk transmembrane proteiner, som ofte er svære at forberede som et opløseligt immunogen. Selv med humaniserede MoAb’er kan resterende muse-afledte segmenter af V-regionen være antigene i mennesker og inducerer humane anti-muse Ab’er [14]. På grund af disse problemer, farmaceutiske virksomheder har en tendens til at begrænse MoAb mål for dem, der udtrykkes af forholdsvis almindelige kræftformer.

I betragtning af de ovennævnte fordele ved MoAb narkotika og berettigelsen af ​​adoptivforældre celle transfer behandlingsformer som værende primært skræddersyet og koster mindre at udvikle, forekommer det sandsynligt, at udvikle en terapi til at overføre patientdata-afledte plasmaceller, der producerer tumor-Ag-specifik, fuldstændig human Ab. Men vi er uvidende om alle tilfælde, hvor en sådan behandling har været en succes. Plasmaceller er terminalt differentierede celler og er således ikke i stand til at vokse i kultur. I stedet B-celler, en direkte precursor af plasmaceller, kunne anvendes til overførslen. Imidlertid har selv B-celler vist sig vanskeligt at ekspandere i et tilstrækkeligt antal til adoptiv overførsel terapi. Desuden er det ikke fastslået, om og i hvilket omfang de overførte B celler kan overleve og differentiere til plasmaceller in vivo.

Normalt er MoAb’er afledt af Ag-specifikke hybridomer, hybride celler mellem milt B-celler fra gentagne gange immuniserede dyr og en fusionspartner plasmacytoma cellelinie. I dyret immuniseret med en given Ag, er Ag-bundne B-celler aktiveret og prolifererer til dannelse af kimcentre (GCS) i miltene eller lymfeknuder. I GCS, B-cellerne undergår isotypeskift og somatisk hypermutation af immunoglobulingener at øge affiniteten af ​​deres Ag receptorer (B-celle receptor, BCR). Blandt dem er de B-celler, der udtrykker BCR specifikt til det immuniserede Ag selektivt udvidet og differentieret i memory B-celler eller langlivede plasmaceller (LLPCs) [15], [16]. Om en endelig booster-immunisering, er AG-specifikke memory-B-celler aktiveret og prolifererer til at blive plasmablasts, som normalt danner Ag-specifikke hybridomer. Selv om Ag-specifikke memory-B-celler kan findes i et betydeligt antal i immuniserede individer, antigenspecifikke B-celler er normalt sjældne i ikke-immuniserede individer. Derfor ville enhver B-celle adoptiv overførsel terapi kræver en fremgangsmåde til selektivt at udvide de sjældne tumor-Ag-specifikke B-celler fra de ekstremt polyklonale perifere B celler fra patienterne.

At udvikle et system til selektivt udvide tumor Ag-specifikke B celler til adoptiv overførsel terapi, vi udnyttet den inducerede GC B (iGB) cellekultursystem at vi for nylig rapporteret [17]. I dette system, mus naive B-celler dyrkes successivt med IL-4 og IL-21 på en feeder cellelinie, der udtrykker CD40L og BAFF (40 LB), hvilket resulterer i omfattende proliferation (op til 10.000 gange i 8 dage) af klasse- switched B-celler med en GC fænotype, betegnet IGB celler. Efter dyrkning med IL-21 og overføres til bestrålede mus, IGB celler differentierer til plasmaceller og har tendens til at kolonisere knoglemarven (BM) og udskiller Abs [17]. Ved at tilpasse dette system til humane B-celler, vil det være muligt at fremstille store antal af humane B-celler, der ville producere fuldstændigt humane Ab’er, når de overføres til patienter. Mod vores mål at etablere B-cellemedieret adoptiv overførsel terapi for kræft, har vi evalueret i en musemodel, hvor meget og hvor længe de overførte IGB celler producerer Ab i ikke-bestrålede mus, og om de hæmmer væksten af ​​kræftceller, der udtrykke en Ag genkendes af den samme Ab in vivo. Desuden ved anvendelse af iGB dyrkningsteknik, har vi udviklet et system til at vælge relativt sjældne B-celler, som binder til et membranbundet Ag, og viste, at de udvalgte B-celler er effektive til adoptiv overførsel cancerimmunterapi model.

Resultater

IGB celler kolonisere knoglemarv og Produce Ab efter Overførsel til ikke-bestrålede mus

Som vi rapporterede tidligere, de fleste IGB celler efter den sekundære kultur med IL-21 har gennemgået klasseskift og udtrykke enten IgG1 eller IgE ved dag 8. Meget få af dem udtrykker IgM, IgG2b eller IgA, og næsten ingen udtrykkelig IgG2c eller IgG3 (figur 1A). Vi viste tidligere, at IGB celler differentierer til plasmaceller i knoglemarven (BM), når de blev overført til bestrålede mus. Her evalueret vi Ab produktionen fra iGB-afledte plasmaceller i ikke-bestrålede mus. IGB celler blev frembragt fra Hy10 mus, som bærer en hønseæglysozym (HEL) -specifik tung kæde (VDJ9) og let kæde (κ5) gener i knock-in og transgene konfigurationer, henholdsvis [18]. Blandt IGB celler, IgE

– CD138

– HEL-binding (HEL

+) celler blev FACS-oprensede og overføres til ikke-bestrålede C57BL /6 (B6) -mus, der blev tappet ugentligt for at måle koncentrationen af ​​anti-HEL lgG1. Som vist i figur 1B, blev påvist et højt HEL-specifik IgG1 i seraene en uge efter overførsel, og så faldt gradvist til en lav, men stadig påviseligt niveau ( 1 pg /ml) ved 10 uger. Anti-HEL IgG1 var ikke påviselig i sera fra kontrolmusene, der modtog IGB celler afledt fra WT B6 mus. blev påvist signifikante antal af anti-HEL lgG1 Ab-producerende celler (APC’er) i BM, men meget få i milten, af mus, der modtog de Hy10-afledte IGB celler 4 uger tidligere (figur 1C). Anti-HEL Ab af IgG2b klasse, men ikke af IgG2c eller IgG3 (data ikke vist), var også detekterbar en uge efter overførsel med Hy10-afledte IGB celler, men ikke med WT IGB celler (figur 1D). Selv om den nøjagtige koncentration af IgG2b anti-HEL ikke kunne estimeres på grund af manglen på en standard isotype-matchet anti-HEL Ab, IgG2b titer var langt lavere end for anti-HEL IgG1 (data ikke vist). Taget sammen indikerer disse data, at der genereres IGB celler in vitro er i stand til at differentiere til plasmaceller, der koloniserer BM af ikke-bestrålede mus og kan fortsætte med at producere Ab dér i mindst 4 uger.

(A ) Milt-B-celler fra C57BL /6-mus blev dyrket i 4 dage med IL-4 og derefter i 4 dage med IL-21 på 40 LB-celler. Ekspressionen af ​​Ig isotyper, CD19 og CD138 på de ekspanderede IGB cellerne blev analyseret ved flowcytometri. Data repræsenterer celler i lymfocytporten defineret af side- og forward scatter. Tal angiver procentdele af de IGB celler i kvadranter eller vinduer. De viste data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (B) naive, HEL-binding eller total B-celler fra milt fra Hy10 eller WT C57BL /6-mus, henholdsvis blev dyrket som i (A). Efter dyrkning blev IGB celler høstet og CD138

– IgE

– IGB celler (2 x 10

7 celler /mus) blev oprenset og overført i.v. til ikke-bestrålede C57BL /6-mus. PBS blev også injiceret som en kontrol. Disse mus blev åreladet i de angivne uger efter overførsel og serummet anti-HEL IgG1 blev bestemt ved ELISA. Dataene er udtrykt som middelværdi ± S.D. individuelt museserum (n = 5 for hver gruppe). Data repræsenterer to uafhængige forsøg. (C) HEL-binding eller totale B-celler blev dyrket og overført til ikke-bestrålede mus som i (B). Fire uger efter overdragelsen, antallet af AFCs udskiller HEL-bindende IgG1 blandt milt eller knogle-marv celler blev bestemt ved ELISPOT assay. Det gennemsnitlige antal ± standardafvigelse af AFCs i 10

6 milt eller BM-celler er angivet med hver bar. Vist er kollektive data fra tre uafhængige forsøg, med hver 3 modtagende mus pr gruppe. * P 0,001. N.d .: ikke påvist. (D) Anti-HEL IgG2b titere i serumprøverne (10-gange fortyndinger) opnået efter 1 uge i (B) blev bestemt ved ELISA. Hver værdi er middelværdien ± S.D. af prøverne (n = 5 pr hver gruppe). Data er repræsentative for to uafhængige forsøg.

IGB Cells Inhibit Lung Metastase af musemelanomceller in vivo

Disse resultater tyder på en mulig anvendelse af iGB cellekultur-system til klinisk brug, nemlig i Ab-medieret cancerterapi. Vi testede denne mulighed med velundersøgte musemodel for tumormetastase hjælp af B16 muse-melanom cellelinie. Vi anvendte B16-celler med en membran-forankret form af HEL (mHEL) [19] som surrogat tumor Ag, og genererede en transfektant klon med homogen HEL-ekspression på celleoverfladen, betegnet B16-mHEL (figur 2A). Vi testede, om HEL-specifikke IGB celler kunne hæmme metastase og vækst af B16-mHEL celler in vivo ved at producere anti-HEL Abs. Da HEL-bindingsaffiniteten af ​​Hy10 milt B-celler er kendt for at være heterogent [18], vi sorteret de stærkt bindende HEL fra Hy10 milt B-celler og dyrket dem på 40 LB fødeceller i 3 dage med IL-4 og efterfølgende for 3 dage med IL-21 for at gøre IGB celler. Milt B-celler fra WT B6 mus blev også dyrket i parallel. IgE

– CD138

– B-celler sorteret fra den Hy10 iGB (Hy10-iGB) eller WT iGB (WT-IGB) -celler, eller PBS alene som en kontrol, blev derefter injiceret i.v. til ikke-bestrålede B6 mus, som havde modtaget B16-mHEL 24 timer før (figur 2B). Lunger af de modtagende mus blev inspiceret 3 uger senere. Lungerne af de mus, der modtog WT IGB celler eller PBS alene, havde mange klumper af almindeligt disseminerede tumorceller, for det meste til at fusionere med hinanden til dannelse skelnes masser. Derimod blev der kun et par små klumper af tumorceller fundet i mus, der havde modtaget Hy10 IGB celler (Figur 2C). Som kontrol mus inokuleret med parentale B16-celler udviklet talrige lungetumorer selv når behandlet med Hy10 IGB celler (data ikke vist).

(A) Ekspression af HEL Ag på B16 melanomceller transficeret med et mHEL udtryk vektor (B16-mHEL). B16-mHEL celler blev farvet med anti-HEL IgG1 MoAb (sort linie) eller isotype-matchet kontrol MoAb (skraveret), efterfulgt af APC-konjugeret anti-muse lgG1 Ab, og analyseret ved flowcytometri. Tallet angiver den procentvise andel af mHEL-udtrykkende celler. Data er en repræsentant for to uafhængige forsøg. (B) Eksperimentel strategi. IgE

– CD138

– IGB celler (2 × 10

7 celler /mus) stammer fra HEL-bindende milt B celler Hy10 mus (Hy10-iGB) eller total milt B-celler af WT C57BL /6 mus (WT-iGB), eller PBS alene blev overført iv til ikke-bestrålede C57BL /6-mus, som var blevet overført i.v. med B16-mHEL (C, D, E) eller B16-mHEL-GFP (F, G) celler (2 x 10

5 celler /mus) 24 timer før. (C) Fotografier af lungerne af recipientmusene beskrevet i (B) 3 uger efter overførslen. Billeder af to mus tilfældigt udvalgt fra ti pr gruppe er vist. Når det er muligt, lunger i resten af ​​musene inspiceret visuelt på dødsdagen. I de ikke-behandlede grupper, der var fusion af individuelle metastaser i meget store tumormasser, hvilket gør det meningsløst at tælle antallet af tumorer. (D) overlevelsesraten for det samme sæt af muse-grupper (n = 10 pr gruppe) som i (B) blev sammenlignet under anvendelse af logrank test. * P 0,001. (E) Koncentration af serum-anti-HEL IgG1 i de samme mus anvendt i (D) blev bestemt ved ELISA i de angivne tidspunkter. Åbne og lukkede symboler angiver værdierne af de enkelte prøver og gennemsnit af hver gruppe, henholdsvis. Data i (D) og (E) er repræsentative for fire lignende forsøg. (F) Binding af anti-HEL IgG1 til B16-mHEL celler i lungen af ​​tumorbærende mus. Lunger af mus, som havde modtaget Hy10 IGB celler (sort linje) eller PBS (skraveret) og B16-mHEL-GFP-celler (2 × 10

5 celler /mus) som i (B) blev skåret 3 uger efter overdragelsen. Enkeltcellesuspensioner fra lungerne blev farvet med anti-muse IgG1-APC og analyseret ved FACSCantoII. Repræsentative histogrammer af prøverne gatet på GFP

+ celler er vist. (G) Sammendrag af forsøgene er vist i (F). Barer repræsenterer gennemsnit ± standardafvigelse af geometriske middelværdier (Geom. middelværdi) af APC fluorescensintensitet af GFP

+ -celler fra mus fra hver gruppe (n = 3). Data er repræsentative for to uafhængige forsøg. ** P. 0,05

Langsigtet observation af det samme sæt af mus viste, at mus, der overføres med Hy10 IGB celler overlevede betydeligt længere end de overdragne med WT IGB celler eller kun PBS (figur 2D ). Blandt disse mus, blev serum-anti-HEL IgG1 detekteret ved relativ høj koncentration i den tidlige periode af tidsforløbet kun i mus, der overføres med Hy10 IGB celler, selv om Ab-koncentration gradvist faldt (figur 2E). Vi kunne vise ved flowcytometri, at anti-HEL IgG1 blev bundet til B16-mHEL celler taget fra lungetumorer ex vivo 3 uger efter overdragelsen af ​​Hy10 IGB celler (figur 2F og 2G). Kollektivt indikerer disse data, at HEL Ab’er produceres af iGB-celle-afledte plasmaceller direkte inhiberede kolonisering og /eller vækst af B16-mHEL celler i lungen og forlængede overlevelsen af ​​de modtagende mus. Mulige mekanismer for Ab-medierede tumor undertrykkelse og mulige årsager til eventuel død af de behandlede mus diskuteres nedenfor.

Udvikling af en kultur System til selektivt Udvid Ag-specifikke IGB Celler

resultaterne af disse in vivo-undersøgelser antydet, at det kunne være muligt at anvende iGB-cellemedieret tumorterapi i mennesker. Til den ende vil det være nødvendigt at vælge formodentlig sjældne B-celler med specificitet for en given tumor Ag. Derfor vi først forsøgt at udvikle et modelsystem til at berige og udvide Ag-specifikke muse B celler til stede i lave niveauer i det polyklonale B-celle pool. Vi har designet et system baseret på Fas /FasL-medieret apoptose, idet det væsentlige alle IGB celler udtrykker Fas [17] og er følsomme over for Fas-medieret apoptose (data ikke vist). Desuden IGB celler bliver resistente over for Fas-medieret apoptose, når deres IgG1 BCR ligeres med membranbundet Ag (data ikke vist), som tidligere rapporteret for aktiveret IgM

+ B celler [20]. Derfor kun Ag-bindende IGB celler bør overleve under forhold, hvor Fas er engageret (figur 3A). For at teste denne hypotese, vi udarbejdet en model-system og genererede to nye feeder cellelinier, 40 LB celler stabilt udtrykker et surrogat Ag mHEL (40 LB-mHEL), og dem, som stabilt udtrykker mHEL og FasL (40 LB-mHEL-FasL). Vi indledte IGB cellekulturer på konventionelle 40 LB fødeceller med en blanding af milt B-celler fra CD45,1

+ Hy10 mus og CD45,2

+ WT mus i et forhold på 1:99. Efter successiv kultur med IL-4 og IL-21 på 40 LB-celler (ekspansion), blev de ekspanderede IGB celler udpladet på 40 LB-mHEL feederceller og dyrket i 6 timer (Ag-stimulation), og derefter genudpladet på 40 LB -mHEL-FasL i 8 timer (valg), og endelig på 40 LB i 5 dage (recovery), med IL-21 til stede i hele efter ekspansionsfasen. blev bestemt Disse særlige betingelser efter mange forsøg med forskellige indstillinger (figur 3B). Efter ekspansionsfasen, vi bekræftet, at andelen af ​​CD45,1

+ HEL-bindende celler forblev på 1% (figur 3C). Andelen forblev den samme efter Ag-stimulering kultur, og gjorde det i kontrolgruppen kultur på 40 LB feeder celler så godt, selv om intensiteten af ​​HEL farvning blev lavere i det tidligere sandsynligvis fordi BCR blev internaliseret (figur 3D, “valgt “). Efter den efterfølgende udvælgelse og nyttiggørelse faser, dog er andelen af ​​CD45,1

+ HEL-bindende celler steg op til -80% i gennemsnit, mens der ikke berigelse blev set efter den parallelle kontrolkultur på 40 LB-celler ( “non -Valgte “). De udvalgte IGB celler hovedsagelig udtrykt BCR af IgG1-isotypen (data ikke vist). Brug af “valgte” protokol, i gennemsnit 3 × 10

5 HEL-bindende B-celler blev udvundet fra den kultur, der begyndte med 10

4 sådanne celler blandt 10

6 B-celler i alt (figur 3E og 3F). Således har vi etableret en markering kultur protokol, der muliggør effektiv berigelse og udvidelse af Ag specifikke B-celler, der er til stede som en lille population blandt et stort flertal af ikke-specifikke polyklonale B-celler. Vi kalder dette valg system “Fas-medieret antigen-specifikke iGB celle valg (Fais) system”. Det er endvidere lykkedes at berige IGB celler specifikke for haptenet 4-hydroxy-3-nitrophenyl acetyl (NP), der oprindeligt er til stede ved -5%, op til -80% af det væsentlige det samme system under anvendelse af de FasL-udtrykkende 40 LB celler, som viser NP-konjugeret protein på deres overflade (data ikke vist).

(A) Skematisk gengivelse af princippet om Fas-medieret Ag-specifik iGB udvælgelse celle (Fais) system. Kun IGB celler, hvis BCR ligeres med Ag præsenteres på fødeceller bliver resistente over for død via Fas ligering af FasL på de samme fødeceller. (B) Protokol til Fais systemet. Milt B celler fra CD45,1

+ Hy10 mus og CD45,2

+ WT mus blev blandet i et forhold på 1:99 (1%), og dyrket på en 40 LB fødelag med IL-4 for 3 dage og efterfølgende med IL-21 i 2 dage. De resulterende IGB celler trinvis dyrket på feeder lag af 40 LB-mHEL i 6 timer (Ag-stimulation), 40 LB-mHEL-FasL i 8 h (udvalg), og 40 LB i 120 h (recovery) i “valgte” protokol. I “non-valgte” protokol blev det passende antal IGB celler genudpladet på en feeder lag af 40 LB celler med samme timing som “valgte” protokol. På hvert tidspunkt genudpladning blev IGB celler isoleret fra feeder, IgE

+ og CD138

+ celler i begge protokoller. (C-E) repræsentant flowcytometriske profiler (HEL-bindende vs. CD45,1; gatet på CD19

+ -celler) af de blandede IGB celler før Ag-stimulering fase (0 H; C), efter at ag- stimuleringsfase (6 h D), og efter opsvingsfasen (134 h E). På hvert tidspunkt blev oprensede IGB celler farvet med biotinyleret HEL og streptavidin-APC, anti-CD19 og anti-CD45,1 Abs og analyseret ved flowcytometri. Profiler af IGB celler dyrket med “valgt” (venstre) eller “ikke-valgte” (højre) protokol er vist. Tallene i hvert vindue repræsenterer procentdelen af ​​Hy10 IGB celler (CD45,1

+, HEL-bindende) blandt samlede CD19

+ IGB celler. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (F) Det absolutte antal (venstre) og procent (højre) af de Hy10 IGB celler efter genopretning kultur med enten det ikke-valgte eller valgte protokol som bestemt ved analysen vist i (E) er vist som gennemsnit ± S.D. af tre uafhængige forsøg. * P 0,05. ** P. 0,01

Næste vi undersøgt, om færre Ag-specifikke B-celler i en ikke-specifik pulje kunne blive beriget, foregribe muligheden for at bruge dette system til klinisk anvendelse. Denne gang, vi startede kulturerne med CD45,1

+ Hy10 milt B-celler blandet med en frekvens på 0,1 eller 0,01% i 1 × 10

6 WT B6 milt B-celler (CD45,2

+) , en frekvens, der blev bekræftet lige før Ag-stimulering kultur iGB celler (figur 4A). Hver B-celle blanding blev dyrket ifølge Fais systemet ( “udvalgt”) eller blot på 40 LB celler som en kontrol ( “ikke-valgte”). Efter genopretning dyrkning blev HEL-bindende IGB celler beriget til ~ 40% og ~ 10%, når de var til stede fra begyndelsen på 0,1% og 0,01% henholdsvis (figur 4B og 4C). Disse data antyder, at meget sjældne Ag-specifikke B-celler, så få som 1 i 10

4, kunne beriges og ekspanderes ved at gentage Fais kultur-protokollen. Salg

(A og B) milt B-celler fra CD45,1

+ Hy10 mus blev blandet ved en frekvens på 0,1% eller 0,01% med 1 × 10

6 CD45,2

+ WT milt B-celler. De blandede celler (1 x 10

6) blev dyrket som beskrevet i figur 3B. Vist er flowcytometriske profiler (HEL-bindende vs CD45,1, gated på CD19

+ celler) af de blandede celler før Ag-stimulering fase (0 h A) og efter opsvingsfasen (134 h; B ) i et repræsentativt eksperiment. Det er angivet i hvert vindue angiver den procentdel af Hy10 IGB celler (CD45,1

+, HEL-bindende) blandt samlede CD19

+ IGB celler. (C) Procentdelen af ​​Hy10 IGB celler efter helbredelse kultur i enten ikke-valgt eller valgte protokol initieret fra blandingsforholdet mellem 0,1% (venstre panel, n = 3) eller 0,01% (højre panel, n = 2), som bestemt ved analysen vist i (B), er angivet som gennemsnit ± SD af uafhængige eksperimenter. * P 0,01. ** P. 0,05

In vitro Selected Ag-specifikke IGB Celler Undertryk tumorvækst in vivo

Endelig har vi testet, om de in vitro udvalgte IGB celler er en effektiv antitumorterapi i melanom-metastase-model i mus. CD45,1

+ HEL-bindende B-celler fra Hy10 mus blev blandet med CD45,2

+ polyklonale B-celler fra WT B6 mus i et forhold på 1:99 og dyrket i Fais system eller på 40 LB-celler som en ikke-valgt kontrol, som beskrevet i figur 3 (figur 5A). Efter genopretning kultur, frekvensen af ​​HEL-bindende IGB cellerne nåede 85%, en mere end 400-fold berigelse, efter Fais kulturen sammenlignet med i kontrolkulturen (figur 5B). Vi overførte disse IGB celler (2 × 10

7) enten valgt eller ikke-valgt, eller kun PBS, til ikke-bestrålede B6-mus, der var blevet overført med 2 × 10

5 B16-mHEL celler. Tre uger senere blev B16-mHEL celler formidlet i hele lungerne og dannede talrige klumper af forskellige størrelser i de mus, der havde modtaget ikke-udvalgte IGB celler eller PBS. Derimod kun et lille antal tumorer, for det meste lille i størrelse, blev observeret i lungerne hos de mus, der havde modtaget de valgte IGB celler (figur 5C). Disse data indikerer, at IGB celler valgt in vitro ud fra deres Ag bindingsspecificitet er stadig i stand til at differentiere til plasmaceller in vivo og inhibere væksten af ​​tumorceller, som udtrykker det samme Ag.

(A) Eksperimentel strategi. En 1:99 blanding af milt B-celler fra CD45,1

+ Hy10 mus og CD45,2

+ WT mus blev underkastet den Fais som beskrevet i figur 3B. De valgte eller ikke-valgte IGB celler efter inddrivelse fase, eller PBS alene blev injiceret i ikke-bestrålede C57BL /6 mus, der var blevet overført intravenøst med B16-mHEL celler som beskrevet i figur 2B. (B) Repræsentative flowcytometriske profiler (HEL-bindende vs. CD45,1) i IGB celler efter inddrivelse fase af “udvalgt” og “ikke-udvalgte” protokoller. Tallene i hvert vindue angiver procentdel af Hy10 IGB celler (CD45,1

+, HEL-bindende, gated på CD19

+ celler) blandt samlede CD19

+ IGB celler. (C) Fotografier af lungerne af mus behandlet som i (A) 3 uger efter overførslen. Repræsentative billeder af to mus ud af tre er vist.

Diskussion

Baseret på resultater ved hjælp af vores musemodel, her foreslår vi et nyt system for adoptiv overførsel kræft immunterapi hjælp B-celler. Med dette system kan man udvide naive B-celler til at producere et stort antal GC-lignende B (IGB) celler og fra dem, kan sjældne Ag-specifikke B-celler udvælges og yderligere udvidet ved Fais til anvendelse i adoptiv overførsel terapi . Vi viste, at de overførte IGB celler koloniseret knoglemarven og produceret Ab, hovedsageligt af IgG1-klassen, i flere uger. Anvendelse af dette system viste vi et eksempel på en effektiv behandling af kræft. Overførslen af ​​IGB celler specifikke for et surrogat tumor Ag (HEL) undertrykkes metastase og vækst i lungerne hos melanomceller, der udtrykker det samme Ag og forlængede overlevelsen af ​​de modtagende mus. Hvis dette system kan tilpasses til at arbejde med humane B-celler, bør B-celle adoptiv overførsel være et meget attraktivt alternativ til Moab i cancerimmunterapi: det vil kræve en kortere periode fra identifikation af en tumor Ag at starte behandlingen af patienter end at producere et humaniseret Moab, derfor vil tjene som en skræddersyet behandling, der kunne målrette sygdomme i lav forekomst. Desuden bør humant afledte IGB celler producerer komplette humane Ab i recipienten.

I den foreliggende undersøgelse, står det tilbage at formelt vist, hvordan overførslen af ​​IGB celler resulterede i suppression af melanom vækst i lungerne . Betragtning af den høje serum titer af HEL-specifikke IgG1 opretholdt i mindst 4 uger efter overførslen (figur 1B og 2E), og bindingen af ​​sådanne IgG1 til HEL-udtrykkende melanomceller ex vivo (figur 2F og 2G), tumor suppression sandsynligvis medieres af anti-HEL IgG1 produceret af iGB-celle-afledte plasmaceller. Således kan de mekanismer, der er ansvarlige for tumor undertrykkelse være ADCC og /eller CDC, de samme mekanismer tilskrives til Moab narkotika in vivo [9], [10]. I denne henseende tidligere undersøgelser sammenligner forskellige isotyper af muse MoAb’er for deres antitumorvirkninger in vivo samt in vitro viste, at IgG1 viste moderate virkninger in vivo og in ADCC, men ikke i CDC, hvorimod IgG2a var den mest effektive i de fleste tilfælde, med IgG2b og IgG3 være variabel blandt rapporterne ved hjælp af forskellige sæt af MoAbs og target-celler [21] – [24]. Således er tilbøjeligheden af ​​B celler afledt fra vores muse iGB cellekultursystem skifte næsten udelukkende til enten IgG1 eller IgE isotyper kan have begrænset effektiviteten af ​​terapien i vores musemodel; alle de mus, selv dem behandlet med Ag-specifikke IGB celler, til sidst døde. Det skal bemærkes, at sådanne mus døde med enorme klumper af melanomtumorer i bughulen, men kun et par små tumorer blev fundet i deres lunger selv ved døden (data ikke vist), hvilket indikerer, at anti-tumor aktivitet af Ab isotyper kan variere afhængigt af væv bliver infiltreret.