PLoS ONE: Posttranslationel modifikation af 6-phosphofructo-1-kinase som et vigtigt element i Cancer Metabolism

Abstrakt

Baggrund

Menneskelige kræftformer indtage større mængder af glukose i forhold til normale væv med de fleste konverteres og udskilles som laktat trods rigelige ilt tilgængelighed (Warburg effekten). Den underliggende højere glykolyse er derfor ved roden af ​​tumor dannelse og vækst. Normal kontrol glycolytiske allosteriske enzymer synes svækket i tumorer; Men fænomenet er ikke fuldt afklaret.

Metodologi /vigtigste resultater

I nærværende papir, viser vi beviser for, at native 85-kDa 6-phosphofructo-1-kinase (PFK1) , en vigtig regulerende enzym af glykolyse, som normalt under kontrol af feedback inhibering, undergår posttranslationel modifikation. Efter proteolytisk spaltning af den C-terminale del af enzymet, en aktiv, kortere 47-kDa fragment blev dannet, der var ufølsom over for citrat og ATP-inhibering. I tumorigene cellelinjer, kun de korte fragmenter, men ikke det native 85 kDa PFK1 blev påvist ved immunblotting. Lignende fragmenter blev påvist også i en tumor væv, der er udviklet i mus efter subkutan infektion med tumorigene B16-F10-celler. Baseret på begrænset proteolytisk fordøjelse af kaninmuskel PFK-M, et aktivt citrat inhibering-resistente kortere form blev opnået, hvilket indikerer, at en enkelt posttranslationel modifikation trin var muligt. De nøjagtige molekylære masser af de aktive kortere PFK1 fragmenter blev bestemt ved at indsætte de trunkerede gener konstrueret fra menneskelige muskel PFK1 cDNA ind i en

PFK

null

E. coli

stamme. To

E. coli

transformanter koder for de modificerede PFK1s af 45.551 Da og 47.835 Da voksede i glukose medium. Indsættelsen af ​​modificeret afkortet humant

PFK Salg M-gener også stimuleret glucose forbrug og lactat udskillelse i stabile transfektanter af non-tumorigene humane HEK-celle, hvilket antyder en vigtig rolle af kortere PFK1 fragmenter i styrkelsen glycolytiske flux.

konklusioner /betydning

posttranslationel modifikation af PFK1 enzym kan være den afgørende faktor dereguleret glykolytisk flux i tumorer, der i kombination med ændrede signaling mekanismer væsentlige understøtter hurtig spredning af kræftceller

Henvisning.: Šmerc A, Sodja E, Legiša M (2011) posttranslationel modifikation af 6-phosphofructo-1-kinase som et vigtigt element i Cancer Metabolisme. PLoS ONE 6 (5): e19645. doi: 10,1371 /journal.pone.0019645

Redaktør: Anil Kumar Tyagi, University of Delhi, Indien

Modtaget: December 10, 2010; Accepteret: April 12, 2011; Udgivet: 4. maj 2011

Copyright: © 2011 Šmerc et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev finansieret af den slovenske Research Agency (kontrakt nr J4-9606 og 1000-07-310027; https://www.arrs.gov.si/sl/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

en konsekvent karakteristisk for maligne celler er forbruget af en større mængde glucose sammenlignet med normale celler og omdannelse af størstedelen af ​​glucose til mælkesyre. Tumorcellerne fortrinsvis anvende glykolyse i mitokondriel oxidativ phosphorylering for glucose-afhængig ATP-produktion, selv i nærvær af rigelig ilt til brændstof mitokondrielle respiration. [1]. Denne afvigende energisk stofskifte, kendt som “Warburg effekten,” er derfor ved roden af ​​tumor dannelse og vækst og er blevet endda diskuteret som en potentiel kendetegnende for kræft [2].

I det sidste årti, opdagelsen af ​​onkogener omdirigeret interesse væk fra studier af cellulær metabolisme i tumorer over for dem, der tager sigte på at afdække funktionen af ​​onkogener, der styrer stofskiftet. Hidtil de afgørende faktorer anerkendt til fremstilling af kræft metaboliske fænotype synes at være de onkogene mutationer, der ændrer vækstfaktor signalering gennem PI3K /Akt /mTOR pathway [3]. Aktivering af denne vej øger metaboliske aktiviteter af glykolysen af ​​to store begivenheder. For det første er syntesen af ​​sukker transporteren Glut1 induceret at lette glukoseoptagelse af cellerne [4], [5]. Sekund, aktiviteten af ​​transkription kompleks HIF-1α steget, hvilket i samarbejde med transkriptionsfaktor c-Myc forøger syntesen af ​​de fleste af glycolytiske enzymer [6]. Øgede mængder af de vildtype-enzymer derfor medføre øgede specifikke aktiviteter. Imidlertid er glycolytiske flux i eukaryote organismer stramt kontrolleret af allosteriske enzymer, der bevarer deres regulering ved feedback-inhibering på trods af de forhøjede aktiviteter af formidlende enzymer. Denne erklæring er blevet bekræftet af eksperimenter i

E. coli

[7] og

S. cerevisiae

[8], hvor overekspression af alle glycolytiske enzymer havde ingen effekt på forekomsten af ​​glukose forbrug og /eller produktion ethanol. Derfor er man tvunget til at konkludere, at vigtige ændringer af kinetikken af ​​regulatoriske enzymer skal også involveret i metaboliske ændringer, der opstår under transformationen af ​​normale pattedyrceller til kræftceller.

Glykolyse er centralt for primær stofskifte, og normalt er det stramt reguleret af tre allosteriske enzymer, hexokinase, 6-phosphofructo-1-kinase (PFK1) og pyruvatkinase (PK), som katalyserer individuelle irreversible trin. Hexokinase, der er involveret i det første regulatorisk trin, vises, overvejende en HK2 isoenzym form tumorer, der er bundet til den mitokondriske ydre membran vender cytosolen. Mikrosted af dette enzym muliggør fortrinsret til nysyntetiserede ATP til phosphorylering af glucose, og det er modstandsdygtigt over for produktinhibering [9]. En anden allosterisk enzym er pyruvatkinase, som regulerer metabolisk flux over terminale del af glykolyse. Tumorceller er blevet vist at udelukkende udtryk embryonale M2 isoform af PK, som kan aktiveres ved fructose-1,6-bisphosphat. Men bindingen af ​​tyrosin-phosphorylerede peptider til PK-M2 resulterer i frigivelse af den allosteriske aktivator, hvilket fører til inhibering af enzymatisk aktivitet. Deaktivering af PK-M2 i tumorceller menes at aflede glukosemetabolismen fra energiproduktion til anabolske processer [10].

Men det mest komplekse kontrol over glykolytisk flux tilskrives PFK1 (EF 2.7.1.11), som overvinder de regulatoriske roller de to andre allosteriske enzymer. PFK1 katalyserer phosphorylering af fructose-6-phosphat til fructose-1,6-bisphosphat, under anvendelse MgATP som phosphoryldonor [11]. PFK1 stimuleres af fruktose-2,6-bisphosphat (F-2,6-BP), ADP /AMP og ammoniumioner, mens citrat og ATP handle som stærke inhibitorer [11], [12].

Under evolution, eukaryote PFK1 enzymer udviklet af dobbeltarbejde, tandem fusion og divergens af katalytiske og effektor bindende steder af en prokaryot forfader [12]. Men den strenge konservering mellem aktive steds rester i den N-terminale segment af den eukaryote enzym og dem af bakteriel PFKs antyder, at det aktive site af eukaryot PFK1 ligger kun i den N-terminale del [12]. På den anden side er de allosteriske ligand-bindingssteder, der udvikles under evolutionen af ​​mutationer i C-terminalen aktivere finindstilling af den regulerende enzym ved de forhøjede niveauer af specifikke downstream metabolitter. En af de allosteriske ligander er citrat, der virker som en potent inhibitor af alle pattedyrarter PFK1 isoformer. Undersøgelser af citrat allosteriske steder i kanin muskel PFK1 konkluderede, at disse steder er udviklet fra phosphoenolpyruvat (PEP) /ADP allosterisk sted på

Escherichia coli

. Aminosyrerester danner citrat allosterisk sted er placeret både i N- og C-terminale ender af molekylet [13].

I pattedyrgenomer, tre forskellige PFK1 gener er til stede og er forskelligt udtrykt i individuelle væv. I humane væv, deres proteinprodukter har følgende molekylære masserne: muskel type (PFK-M), 85.051 Da [14]; lever type (PFK-L) 84.917 Da [15]; og blodplade type (PFK-P), 85.596 Da [16].

Alle tre isoenzymer er stærkt inhiberet af citrat, med IC

50 værdier på 0,08, 0,13 og 0,18 mM for hjernen (blodplade), muskel og lever PFK1 henholdsvis [17]. rapporteres også alle menneskelige PFK1 isoformer, der skal intenst inhiberet af ATP-koncentrationer højere end 0,05 mM, endnu (F-2,6-BP) kan antagonisere de negative virkninger af ATP til en vis grad [18].

Currently , i cancerceller, er aktiviteten af ​​PFK1 enzymer menes at være opreguleret kun ved tab af p53-funktion, hvilket resulterer i nedreguleringen af ​​Tigar protein, der fungerer som en fructose-2,6-bisphosphatase [19 ]. Følgelig niveauet af F-2,6-BP forblev høj i tumorer og fungerede som en stærk positiv stimulus.

Men en PFK1 isoform, der var mindre følsomme over for citrat inhibering (K

i = 0,75 mM citrat) og mere følsomme over for aktivering af F-2,6-BP blev beskrevet i human glioma [20]. En PFK1 isoformen med lignende kinetiske egenskaber blev også observeret i den hurtigt voksende gnaver AS-30D hepatomaceller, som viste fuldstændig ufølsomhed over for sine allosteriske inhibitorer, citrat og ATP, i nærvær af fysiologiske koncentrationer af F-2,6-BP. Desuden blev enzymet stærkt aktiveret af dens aktivatorer NH

4

+, AMP, og F-2,6-BP [21]. Alligevel, arten af ​​PFK1 isoformer udviser ændringer i enzymkinetik blev ikke undersøgt i detaljer.

En citrat inhibering-resistent form for PFK1 der blev aktiveret til et højere niveau ved allosteriske aktivatorer er for nylig blevet beskrevet i det kommercielt vigtige svamp,

Aspergillus niger

[22] – [24]. Disse kinetiske egenskaber blev tilskrevet 49-kDa underenheder, som er relativt små PFK1 molekyler med hensyn til andre eukaryote PFK1s på ca. 85 kDa. Yderligere undersøgelser viste, at de kortere 49-kDa fragmenter dannet af en to-trins Posttranslationel modifikation af det native 85-kDa enzymet [23] – [25].

I denne rapport præsenterer vi dokumentation for, at en lignende posttranslationel modifikation af det native muskel-typen PFK1 kan også forekomme i mammale cancerceller, der følgelig fører til dannelsen af ​​aktive kortere PFK1 fragmenter med ændrede kinetiske parametre.

Resultater

Analyser af aminosyre sekvenser af det humane PFK-M-protein

oprindelsen af ​​mammale gener, der koder PFK1 enzymer ved overlapning af prokaryote forfader gener [12] kan bekræftes ved justeringen af ​​aminosyresekvenserne for de N- og C- halvdele restkoncentrationer af den humane PFK-M isoenzym, der viser væsentlig homologi (supplerende fig. S1). Analyse foretaget af CLUSTALW [26] afslørede 25,4% identitet, 21,6% stærk lighed, 11,6% svag lighed og 41,8% forskel blandt aminosyrerester af begge halvdele af den primære struktur.

De undersøgelser Posttranslationel modifikation af

A. niger

PFK1 viste, at det native enzym først blev spaltet med serin protease til en kortere protein, der oprindeligt var inaktiv, men genvandt aktivitet efter phosphorylering af et specifikt threoninrest, der var placeret i enzymet aktive center [25]. En negativt ladet aminosyrerest (phosphoryleret threonin) var nødvendig til frembringelse af enzymaktivitet [25]. Ved at erstatte kodonen for threonin-rest med en for glutaminsyre i den trunkerede

A. niger PFK

A, blev behovet for fosforylering af oprindeligt inaktive kortere PFK1 fragmenter elimineret og aktive kortere PFK1 fragmenter blev kodet direkte af den modificerede

PFK

A gener [25]. Ved at tilpasse de udledte aminosyresekvenser for tre humane isoenzymer med den

A. niger

enzym (supplerende Fig. S2), en negativt ladet aminosyrerest (asparaginsyre) blev kun fundet i sekvensen for PFK-M i positionen svarende til threoninrest i

A. niger

protein. De to andre isoenzymer, PFK-L og PFK-P, indeholdt en ikke-polær alaninrest på den matchende site. PFK-M med en negativt ladet asparaginsyrerest på dette kritiske locus blev derfor konkluderet at være den mest sandsynlige kandidat til generering aktive kortere PFK1 fragmenter efter en enkelt posttranslationel modifikation trin.

In vitro

posttranslationel modifikation af pattedyr PFK1

for at kontrollere, at blev PFK1 isoleret fra kanin muskel. Det oprensede enzym blev inkuberet med forskellige proteaser og testet for tilstedeværelse af nyligt genererede, aktive, citrat inhibering-resistente kortere PFK1 fragmenter. Forskellige kommercielt tilgængelige proteaser fra forskellige arter blev anvendt i individuelle forsøg.

Forsøget blev udført i en puffer indeholdende 5 mM citrat, der fungerer som en stærk inhibitor af det native enzym, men ikke af de kortere fragmenter. Efter begrænset proteolyse af det oprensede native PFK1 med proteinase K (0,001 mg /ml), blev PFK1 aktivitet, der registreres. En gradvis stigning i PFK1 aktivitet blev påvist i prøver, der blev udsat for proteolytiske virkning i længere tid (fig. 1). Med SDS-PAGE, blev der observeret fragmenter af ca. 45 kDa efter begrænset proteolyse med 0,001 mg /ml proteinase K (supplerende Fig. S3), hvorimod inkubation med proteinase K ved en højere koncentration (0,01 mg /ml) fremstillet inaktive, lidt kortere fragmenter. Ingen aktive fragmenter kunne detekteres efter spaltning af det native enzym med andre kommercielt tilgængelige enzymer af mikrobiel eller pattedyroprindelse.

Arbejdet i native PFK1 isoleret fra kaninmuskel efter begrænset proteolyse af proteinase K (mørke) og ubehandlet native enzym (lys) som målt i et system indeholdende 5 mM citrat. Data er repræsentative for tre uafhængige målinger og præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse.

Dette eksperiment viste primært, at et enkelt trin Posttranslationel modifikation af pattedyr PFK1 var muligt for at give aktive kortere PFK1 fragmenter. Den protease, der rent faktisk var involveret i produktionen af ​​sådanne fragmenter i humane celler er endnu ikke fastslået, men de mest sandsynlige kandidater er serinproteaser, der skal aktiveres intracellulært.

Afsløring korte PFK-M fragmenter i metastatisk tumor celle linjer ved immunoblotting

for at undersøge hvilke PFK1 former er til stede i tumorceller, fire forskellige neoplastiske cellelinier, som vides at inducere metastatiske tumorer efter indsætning i forsøgsdyr blev anvendt. Følgende cellelinjer blev testet: human carcinoma HeLa-celler; muse melanoma B16-F10-celler; og to lymfomer, rotte Nb2-11 linje og den menneskelige TF-1 linje. Til Western blotting, et antistof dannet mod en epitop af enzymets aktive center, der var identisk i forskellige mammale PFK1-M isoformer, men ikke i L eller P isoformer, blev anvendt.

I homogenater af al neoplastisk celle linjer, mængden af ​​nativt PFK1 på 85 kDa var under immunoblotting detektionsgrænsen (fig. 2). Imidlertid blev en række lavere molekylvægt fragmenter spottet. I alle cellehomogenater, fragmenter af ca. 47 kDa var til stede, mens nogle andre fragmenter optrådte sporadisk. I modsætning til de tumorgene cellelinier blev kun de native 85 kDa PFK1 enzymer observeret i lymfocytter isoleret fra perifert humant blod. Native enzymer var også fremherskende i human nyre embryonale celler (HEK 293-cellelinje) under anvendelse af en identisk immunfarvning metode. HEK celler blev udødeliggjort af adenovirus, men var ikke tumorigen. Selv om ingen 47 kDa lav molekylvægt fragment blev påvist i HEK-celler, blev nogle lidt forkortede native enzymformer observeret, at kunne være et produkt af alternativ splejsning. I human muskel, har et alternativt transskript koder for et PFK-M isoenzym blevet rapporteret, hvilket gav et aktivt enzym med 749 aminosyrerester og en molekylmasse på 81.776 Da [27]. Evidens for alternativ splejsning af PFK-M-genet er også blevet rapporteret i mus [28].

Western blots af fire tumorigene cellelinjer (ovenfor) viste tilstedeværelsen af ​​fragmenter med forskellige længder, med et fragment af 47 kDa regelmæssigt til stede, mens der ikke native 85-kDa PFK1 kunne observeres. I ikke neoplastiske cellelinier (nedenfor) (HEK-celler), de native PFK1 former var dominerende, mens i normale lymfocytter isoleret fra perifert humant blod blev detekteret kun et enkelt proteinbånd svarende til 85 kDa nativt PFK1. I Western blot af lymfocytter to volumener cellelysat blev påført gelen:. 10 pi (til venstre), og 20 pi (højre)

I kontrolgruppen blev der ikke observeret nogen bånd, når en prøve vækstmedium blev immunoblottedes med antistofferne, der anvendes til PFK1 detektion. Salg

detektering korte PFK-M fragmenter i tumorer ved immunoblotting

i en tumor, der har udviklet sig på en C57BL /6 mus, 10 dage efter den subkutane injektion af B16-F10-celler, blev næsten identiske fragmenter detekteret som i B16-F10-celler vokser i en vævskultur (fig. 3). Men i en tumor, en stærk bånd svarende til det native PFK-M-enzym var til stede, der sandsynligvis stammer fra ikke-tumorigene understøttende væv, såsom blodkar, stroma eller inflammatoriske celler. Mere detaljeret inspektion af de kortere fragmenter fra B16-F10-celler og tilsvarende tumor afslørede, at 47 kDa fragmentet var til stede i individuelt voksende celler, mens de, der er udviklet i en tumor udtrykt en 45 kDa fragment.

Ingen native PFK1 enzym var påvist i celler, der vokser i en vævskultur, mens i en tumor, et stærkt signal svarende til det native enzym var til stede. Kortere fragmenter blev påvist i begge homogenater med en 47-fragment til stede i individuelt voksende celler og en 45 kDa fragmentet til stede i et tumorvæv.

afkortet humant muskel PFK1 cDNA koder aktive kortere PFK-M-fragmenter i

E.coli

celler med forstyrret indfødte

PFK

A

i det næste trin, effektiviteten af ​​aktive kortere humane PFK-M fragmenter blev testet i en

E. coli

stamme, der manglede sin egen native PFK1 proteiner. Selv om den nøjagtige molekylmasse af de kortere fragmenter ikke kunne bestemmes ud fra western blots, blev en række trunkerede gener fremstillet fra human muskel PFK1 cDNA. Trunkerede gener blev indsat i

E. coli

RL 257 [29] stamme, og transformanter blev testet for ændrede vækstkarakteristika på et medium indeholdende glucose. Proteinerne kodet af trunkerede gener afveg flere aminosyrerester og er omfattet molekylmasser i området fra 45 kDa til 46 kDa og 47 kDa til 48 kDa (supplerende tabel S2). To transformanter stand til at vokse på suppleret glucose minimalmedium blev afsløret, en fra hver gruppe af molekylmasser (fig. 4). Den første stamme syntetiseret Fragment nummer 4 (supplerende tabel S2) med 422 aminosyrerester og en molekylmasse på 45.551 Da, mens anden stamme kodet Fragment nummer 9 (supplerende tabel S2) med 443 aminosyrerester og en masse på 47.835 Da. Cellerne i begge stammer multipliceret til en optisk densitet på 2 i cirka 24 timer, hvilket indikerede, at begge rekombinante proteiner var aktive og i stand til effektivt at deltage i bakteriel metabolisme. Ingen vækst af transformanter koder for andre kortere PFK-M fragmenter kunne observeres, selvom syntetiserede rekombinante proteiner blev påvist ved western blots (supplerende fig. S4). Ingen vækst på glucose medium kunne påvises ved en kontrol, den parentale RL257 stammen bærer pALTER-Ex1 plasmid uden indsatte gen. Overraskende transformanten koder for det native humane PFK-M (85.051 Da) var ude af stand til at proliferere under identiske betingelser, selv om der blev påvist høj enzymatisk aktivitet (mere end 600 mU /ml) i det cellefrie ekstrakt.

To

E.coli

transformanter koder Fragment 4 (⧫) og Fragment 9 (□) var i stand til at vokse i suppleret glukose minimalt medium. Ingen vækst af den parentale stamme, RL 257, bærer pALTER-Ex-1-plasmid uden indsatte gen (•) kunne detekteres. Data er repræsentative for tre uafhængige målinger og præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse.

I begge transformanter, der var i stand til at vokse på glucose-medium blev PFK1 aktivitet påvist i homogenater. I begge transformanter, der var i stand til at vokse på glucose medium, blev PFK1 aktiviteter påvist i homogenater. I transformanten kodende Fragment 9, aktivitet resistente over for ATP og citrat inhibering blev registreret ved 0,5 mM F6P, som er nær fysiologisk koncentration [30]. Fragmentet 9 viste høj affinitet mod ATP (K

m på ca. 0,05 mM), mens koncentrationer over 0,2 mM, kunne der ikke ATP inhibering påvises (fig. 5A). Tværtimod det rekombinante humane native 85 kDa PFK-M isoleret fra

E.coli

RL257 stamme viste en top i enzymaktiviteterne ved stigende koncentrationer af ATP. Ved lave ATP-koncentrationer steg aktiviteterne langsommere i forhold til den kortere fragment, hvilket indikerer lavere affinitet for det native enzym mod ATP (K

m~0,3 mM). Men ATP koncentrationer over 0,6 mM forårsagede et kraftigt fald af det native enzym aktivitet og kun en beskeden PFK1 aktivitet blev påvist ved ATP-koncentration på 1 mM (fig. 5A). Natriumcitrat hæmmede ikke aktiviteten af ​​kortere PFK-M-fragment (fig. 5B). Dette er i modsætning til de kinetiske egenskaber af de rekombinante humane native PFK-M-enzym, hvor en stærk sensitivitet mod citrat blev afsløret [31]. kunne ikke påvises inhibering af kortere fragment med lactat enten (fig. 5B), en metabolit, der for nylig blev foreslået at nedregulere muse PFK1 aktiviteter [32].

I figur 5A relative specifikke PFK1 aktiviteter påvist i homogenat af transformanten koder Fragment 9 (□) og med nativt PFK-M-enzym isoleret fra

E. coli

transformant (○) er vist, der blev målt ved stigende koncentrationer af ATP. I figur blev 5B specifikke PFK1 aktiviteter målt i homogenat af transformanten kodende Fragment 9 uden inhibitor (□), i nærvær af 5 mM Na

3-citrat (◊), og med 5 mM Na-lactat (Δ) . Alle målinger blev udført med 0,5 mM af F6P. Data er repræsentative for mindst tre uafhængige målinger og præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse.

Fructose-6-phosphat mætningskurver uden og med f-2,6-BP udviste en ændring i PFK- M aktiviteter af både det native enzym (fig. 6A) og fragmentet 9 (fig. 6B). Ved at tilføje F-2,6-BP til målesystemet blev en sigmoid plot konverteret til Michaelis-konstanten, karakteriseret ved en kraftig stigning i aktiviteter i forhold til substrat koncentration. Selvom F-2,6-BP forøget affiniteten af ​​begge enzymer mod det F6P som et substrat, aktivatoren også forårsaget en markant stigning i maksimal hastighed af kortere Fragment 9 (fig. 6B), mens ingen sådan virkning kunne optages med native enzym (fig. 6A).

i figur 6A F6P mætningskurver af det isolerede native PFK-M-enzym med (○) og uden (◊) 4 uM af F-2,6-BP præsenteres. I figur 6B F6P mætningskurver påvist i homogenat af transformanten kodende Fragment 9 med (□) og uden (Δ) 4 pM af F-2,6-BP er vist. Målingerne blev udført med 1 mM ATP. I begge grafer vises relativt specifikke aktiviteter. Data er repræsentative for mindst tre uafhængige målinger og præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse.

De kortere PFK-M fragmenter syntes at være ekstremt ustabilt i de in vitro-betingelser. Aktiviteten kunne stabiliseres i et vist omfang i et cellefrit ekstrakt, der indeholdt ca. 10 mg proteiner pr ml ved tilsætning af fructose-6-phosphat til en slutkoncentration på 6 mM. Imidlertid blev hurtig deaktivering registreret i måle- hætteglas (supplerende Fig. S5), når mængden af ​​opløste proteiner blev reduceret signifikant. Efter cirka 10 minutters inkubation ved 30 ° C, kunne påvises nogen NADH forbrug i systemet.

Angivelse af h

PFK

MFrg9 i ikke-tumorigen HEK 293 celler fremmer væksten, glucose forbrug og laktat produktion

for at bestemme om modificerede PFK-M-enzymer har lignende fysiologiske virkninger i ikke-tumorigene humane celler (Flp-i T-Rex HEK 293-cellelinje), blev stabile transfektanter forberedt på, at aktiveret konstitutiv ekspression af h

PFK

M koder for den native PFK-M og h

PFK

MFrg9 koder for PFK-M Fragment 9. vækst sats, glucose forbrug og laktat ophobning blev sammenlignet med dem i transfektanter transporterer integreret tom plasmid under identiske vækstbetingelser. De celler, der udtrykker h

PFK

M og h

PFK

MFrg9 spredt hurtigere sammenlignet med de parentale celler, som observeret på semi-logaritmisk graf, men detaljerede analyser af en lineær afbildning af de samme data foreslog en lidt kortere lag-fase af transficerede celler i forhold til den parentale stamme (fig. 7A). Den mest drastiske forskel blandt testede transfektanter blev observeret for lactat udskillelse. Efter 24 timers inkubation, mængden af ​​lactat akkumuleret i mediet og normaliseret til 1 million celler afslørede fire folder højere produktivitet ved stammen syntetisering Fragment 9 i forhold til den stamme, der koder for det native PFK-M og seks folder højere i sammenligning med den parentale stamme. På dag to, mængden af ​​lactat akkumuleret var stadig omkring 30% højere af cellerne med fragment 9, hvorimod senere blev lignende værdier opnået ved alle tre testede cellelinier (fig. 7C). Øget produktion laktat af celler, der udtrykker h

PFK

MFrg9 genet blev afspejlet også i glukose forbrug satser. Efter 24 timer, det højeste beløb af glukose, normaliseret til den faste celle nummer, er blevet taget op af de celler, der koder for Fragment 9, blev omkring 40% mindre glukose forbruges af de celler, der syntetiserer den indfødte PFK-M-enzymet, mens forældrenes celler metaboliseres endnu mindre glukose (fig. 7B).

i figur 7A vækst i Flp-In T-Rex HEK 293 celler med integrerede h

PFK

MFrg9 (h

PFK

MFrg9 /HEK – ▪) koder for Fragment 9; integreret h

PFK

M (h

PFK

M /HEK – •) koder for den native PFK-M-enzym; og celler med integreret tomme plasmid (HEK – ◊) er præsenteret i logaritmisk funktion. I figur 7B glucose forbrug af transfektanter normaliseret til 1 million celler er vist. I figur 7C lactatproduktion omregnet til 1 million celler er præsenteret. Identiske symboler for individuelle transfektanter anvendes i alle figurer. Data er repræsentative for tre uafhængige målinger og præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse.

Diskussion

En række onkogener, herunder Akt [33], BCR-ABL [34], c-myc og HIF [35], fremme glukosemetabolismen i kræftceller. Men aktiveringen af ​​Akt alene, som koder for en serin /threonin-kinase, som er under kontrol af phosphatidylinositide-3-kinase PI3K, har vist sig tilstrækkelig til at stimulere overgangen til aerob glykolyse [36]. Imidlertid forbliver de underliggende molekylære ændringer i niveauet af regulerende glycolytiske enzymer dårligt forstået. Konstitutiv aktivering af Akt er blevet impliceret i reguleringen af ​​celleproliferation [37] og foreslog at deltage i at fremme Glut1 transportør aktivitet [4]. Desuden har stimulerende rolle PI3K /Akt-signalvejen er rapporteret i hormonafhængig proteolytisk induktion (kallikrein-genekspression) i bryst- [38] og prostata [39] cancercellelinjer. Humane væv kallikreiner tilhører en undergruppe af serinproteaser, der ligner proteinase K, som vi har vist her til spaltning native PFK1 enzymer til dannelse aktive, citrat inhibering-resistente kortere PFK1 fragmenter. Derfor Akt-medieret induktion af aerob glykolyse kunne også være involveret i den posttranslationelle modifikation af PFK1 ved at aktivere proteolytiske enzymer.

Denne antagelse understøttes af lignende resultater opnået med transfekterede celler konstitutivt udtrykker Akt [36] og celler syntetiserer højaktive kortere PFK1 fragmenter i denne undersøgelse. Begge typer af celler forbrugt glucose hurtigere og udskilles lactat i højere udbytter i forhold til den ikke-transficerede celler.

Med Western blotting eksperimenter af tumorigene og normale celler kunne påvises nogen native 85 kDa enzym i neoplastiske celler, hvorimod et fragment på 47 kDa var karakteristisk stede. Men nogle andre mindre fragmenter plettet samt. De mest sandsynligvis stammede fra det native PFK1 siden anvendte antistof, viste sig at være specifik nok og ingen lavmolekylære peptider optrådte i lysatet af lymfocytter og HEK-celler. Desuden, kun lidt om den cytosoliske proteolytiske aktivitet i cancerceller derfor er det vanskeligt at spekulere over antallet af proteaser, som kan angribe PFK1 enzymet. Utvivlsomt vil bedre information om posttranslationelle modifikation opnås ved anvendelse af et epitop-tagget PFK1 allel. Faktisk testede vi AU1 epitopmærke [40], der var N-terminalt fusioneret til native PFK-M. Selvom mærket

PFK

-M genet blev udtrykt og protein detekteret, kunne påvises nogen enzymaktivitet (data ikke vist). Vi mener, at udvidelsen af ​​seks aminosyrerester påvirket foldningen af ​​proteinet i cellerne og forhindrede den korrekte sammenslutning af monomeres til en aktiv tertameric holoenzym. Desværre kunne inaktiv enzym ikke anvendes til studier af posttranslationel modifikation af proteolytisk spaltning.

Interessant nok blev lidt anderledes kortere fragmenter fundet i B16-F10 celler, der vokser individuelt og i et tumorvæv. Selvom in vivo forsøg udført i

E.coli

transformanter viste, at både 45 og 47 kDa PFK-M fragmenter kunne associere til en aktiv holoenzym. Denne observation tydede på, at forskellige miljøforhold kan påvirke posttranslationelle modifikation af PFK-M i B16-F10 celler.

Efter Posttranslationel modifikation af PFK-M, er enzymaktiviteten bevaret, da det aktive site i de eukaryote PFK1s er placeret i den N-terminale ende [12]. Imidlertid er kinetiske egenskaber ved de kortere PFK-M-fragmenter ændres (fig. 5-6). Vigtigste modificerede enzymer bliver ufølsom over for citrat og ATP-inhibering. Ved en proteolytisk spaltning af den C-terminale del af det native molekyle nogle af komponenterne i citrat bindingsstedet går tabt, samt et motiv ansvarlig for inhibering med ATP (supplerende fig. S1). Tilsvarende kinetiske ændringer i de modificerede PFK1 fragmenter blev også observeret efter den posttranslationelle modifikation af det native PFK1 enzym i filamentøse svamp

Aspergillus niger

[24]. 5′-AATTATGGATCCATGACCCATGAAGAGCACC-3′.

doi:10.1371/journal.pone.0019645.s006

(TIF)

Table