PLoS ONE: Anvendelse af Exome Genotypning at forudsige Patologisk Gleason Score Opgrader efter radikal prostatektomi i lavrisiko-Prostata Cancer Patients

Abstrakt

Baggrund

Aktiv overvågning (AS) er en lovende mulighed for patienter med lav risiko prostatakræft (PCA), men nuværende kriterier kunne ikke vælge patienterne korrekt, mange patienter, som opfyldte de seneste AS kriterier oplevede patologiske Gleason score opgradering (PGU) efter radikal prostatektomi (RP). I denne undersøgelse, vi havde til formål at udvikle en nøjagtig model til forudsigelse PGU blandt lavrisiko-PCA patienter ved hjælp exome genotypning.

Metoder

Vi genotypede 242,221 enkelt nukleotid polymorfier (SNP) s på en custom HumanExome BeadChip v1.0 (Illuminam Inc.) i blod DNA fra 257 PCA patienter med lav risiko (PSA 10 ng /ml, biopsi Gleason score (GS) ≤6 og klinisk fase ≤T2a), som gennemgik radikal prostatektomi. Genetiske data blev analyseret ved hjælp af en ubetinget logistisk regression til at beregne en odds ratio som et skøn over relativ risiko for PGU, som defineret patologiske GS over 7. Blandt dem, valgte vi vedholdende SNPs efter flere test vha FDR metode, og vi sammenlignet nøjagtigheder fra multivariat logistisk model indarbejde kliniske faktorer mellem inkluderet og ekskluderet valgt SNP oplysninger.

Resultater

Efter analyse af exome genotypning, 15 SNPs var væsentligt at forudsige PGU i lav risiko PCA patienter. Blandt dem, en SNP – rs33999879 forblev signifikant efter flere test. Når en multivariat model indarbejde faktorer i Epstein definition – PSA tæthed, biopsi GS, positivt kerne nummer, tumor pr core-forholdet og alder blev udtænkt til forudsigelse af PGU, den prædiktive nøjagtighed multivariate model var 78,4% (95% CI: 0,726 -0,834). Ved tilsætning faktoren rs33999879 i førnævnte multivariat model, den prædiktive nøjagtighed var 82,9%, som i væsentlig grad blev øget (p = 0,0196).

Konklusion

rs33999879 SNP er en prædiktor for PGU. Tilføjelsen af ​​genetisk information fra exome sekventering reelt forbedret den prædiktive nøjagtighed den multivariate model til at etablere passende aktive kriterier overvågning

Henvisning:. Oh JJ, Park S, Lee SE, Hong SK, Lee S, Choe G et al. (2014) Brug af Exome Genotypning at forudsige Patologisk Gleason Score Opgrader efter radikal prostatektomi i lav risiko prostatakræft patienter. PLoS ONE 9 (8): e104146. doi: 10,1371 /journal.pone.0104146

Redaktør: Kin Mang Lau, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Marts 26, 2014 Accepteret: 10. juli 2014 Udgivet: August 5, 2014

Copyright: © 2014 Oh et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud nr. 12-2013-015 fra SNUBH (Seoul National Bundang Hospital University) Research Fund og delvist understøttet af National Research Foundation Korea (NRF) tilskud finansieret af Sydkorea regering (Ministeriet for Videnskab, IKT og fremtidig planlægning) (nr 2011 til 0.009.963). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Aktiv overvågning (AS) af prostatakræft (PCA) med forsinket indgreb udgør en attraktiv ledelse mulighed, da det forsinker og muligvis undgår sygelighed og potentielle dødelighed forbundet med radikal prostatektomi (RP) eller forskellige strålebehandling alternativer [1 ] – [2]. På trods af de lovende resultater af flere store overvågning kohorter, og dens 10-års sygdomsspecifikke overlevelse af 97-100% [3], estimeringen af, om patienterne skal aktivt behandlet for lav risiko PCa stadig kontroversielt, som flere undersøgelser har rapporteret, at en betydelig andel af mænd er berettiget til AS har aggressive tumor egenskaber på tidspunktet for RP [4] – [5]. Derfor er en veletableret udvælgelseskriterium blandt PCA patienter er vigtig. Epstein et al. [6] udviklet et sæt kriterier for forudsigelse af klinisk ubetydelig PCa (CIPC) før endelig behandling. Som med Epstein kriterier, National Comprehensive Cancer Network, (NCCN), defineret meget lav risiko PCa som med prostata-specifikt antigen (PSA) 10 ng /ml, PSA tæthed ≤0.15 ng /ml /cm

3, i klinisk udvikling ≤T1c, Gleason score (GS) ≤6, antal positive kerner ≤2, og kræft involvering per kerne ≤50% [7] – [8]. Disse kriterier af meget lav risiko PCa øjeblikket meget udbredt i udvælgelsen af ​​patienter til AS [9]. Men selv disse kriterier er ikke ideel, da 20% af patienterne, som opfyldte disse kriterier havde ugunstige patologiske PCA egenskaber (patologiske GS ≥ 7 eller patologisk stadium ≥T3) ved RP [10]. Andre undersøgelser har vist 24-48,6% patologisk Gleason score opgradering (PGU), som blev defineret patologisk GS 7 eller højere, eller upstaging efter RP, blandt mænd, der opfyldte kriterierne for CIPC [10] – [11]. Derfor har mange undersøgelser understreget betydningen af ​​nye molekylære biomarkører til at forudsige ugunstige patologiske resultater blandt mænd med klinisk ikke-aggressiv PCa. Sådan en biomarkør kan være fungere som en passende kriterier for AS udvælgelseskriterier. Derfor intensiv genomisk forskning er i øjeblikket i gang for at identificere molekylære markører, der kan forudsige resultatet af PCa [12].

I den foreliggende undersøgelse, analyserede vi de genetiske varianter, som i væsentlig grad var forbundet med PGU i lav- risiko PCA patienter, med brug af exome sekventering, og vi anvendt denne genetiske information til en klinisk model til at forudsige PGU, der inkorporerer forskellige faktorer, herunder Epstein kriterier. Vores mål i denne undersøgelse var at identificere en biomarkør, der har ekstra forudsigelig nøjagtighed at vælge passende patienter til AS.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Undersøgelsen blev godkendt af vores institutionelle review board, Seoul National University Bundang Hospital Institutional review board (IRB nummer: B-1312 /232-302), og følger reglerne atated i Helsinki-erklæringen. Alle deltagere gav skriftligt informeret samtykke og blev refunderet for deres deltagelse.

studiepopulation

Efter at have opnået institutionel Review Board godkendelse, blev 1002 PCA patienter i dette studie fra November 2003 til juli 2013. Blood prøver blev indsamlet prospektivt fra alle patienter. Vi ekskluderede patienter, som gennemgik neoadjuverende hormon eller strålebehandling, gennemgik prostata biopsi ved en anden institution, og gennemgik prostata biopsi med 12 kerner taget. For at finde faktorer, der påvirker PGU PCA patienter med lav risiko, (PSA 10 ng /ml, biopsi GS 6 og klinisk fase ≤T2a), som gennemgik RP, blev inkluderet i denne analyse. Følgelig blev 257 patienter inkluderet, med komplette registreringer af serum PSA, klinisk fase, biopsi GS, antallet af positive kerner, kumulative længde af kerner i alle prostata biopsi kerner og patologiske resultater til rådighed. De 257 patienter blev stratificeret i to grupper efter tilstedeværelsen af ​​PGU.

Patologisk Evaluering

Transrektal ultralyd (TRUS) -Guidede multi-core (≥ 12) biopsier blev taget fra alle mænd bruger en automatisk affyringsmekanisme. Prostata blev biopsi nær bunden, midten kirtel, og apex, bilateralt med mindst seks biopsier per side. Således blev 12 baseline biopsi kerner taget i alle mennesker, og yderligere biopsier blev taget til omfatte mistænkelige vises læsioner, hvis nødvendigt. Alle RP prøver blev bearbejdet i overensstemmelse med Stanford protokollen [13]. Alle biopsi og RP prøver undergik patologisk analyse af en enkelt genitourinær patolog (G.C.). PGU blev defineret ved patologiske GS af 7 eller højere.

Genotypning og kvalitetskontrol

Undersøgelse prøver blev behandlet på HumanExome BeadChip 12v1-1 (Illumina, Inc., San Diego, CA), som omfatter 242,901 markører fokuseret på protein-ændring varianter. Detaljer om enkelt (SNP) indhold og udvælgelse strategier kan findes på exome array design webside (https://genome.sph.umich.edu/wiki/Exome_Chip_Design).

Genotype kald blev udført hjælp Illumina s GenTrain version 2.0 clustering algoritme med GenomeStudio software (V2011.1). Cluster grænser blev bestemt ved hjælp af Illumina standard klynge-fil. Efter yderligere visuel inspektion af SNPs med et opkald på 0,99, og SNPs med mindre allel frekvens af 0,002, 242.186 af 242,901 (99,71%), forsøgte markører lykkedes genotype, med en opfordring på 95% (gennemsnit takst 99,98%). I alt blev 1008 af 1009 (99,9%) individer med succes genotype (kald sats 98%). For de 242,186 SNPs der passerede kvalitetskontrol, genotype konkordans blandt de 104 blind dublerede prøvepar var 99,998%. Et individ pr par af seks kendte tvillingepar og seks uforklarlige tilsyneladende dubletter blev udelukket. Vi gennemførte principal komponenter analyse (PCA) to gange, en gang eksklusive HapMap prøver at identificere befolkningens outliers, og derefter herunder HapMap prøver at hjælpe med at fortolke outliers. For at undgå artefakt resultater på grund af familie slægtskab, vi beregnede vigtigste komponenter ved hjælp af SNP belastninger anslået fra en delmængde af 7.304 ikke-close-slægtninge. Vi definerede nære slægtninge som dem, for hvem den anslåede genom-dækkende identiske-by-afstamning (IBD) andel af alleler delte var 0,10. Vi skønnede IBD deling ved hjælp Plink s “-genome” option38, og udført PCA hjælp SMARTPCA37 på en kobling-uligevægt-beskæres sæt af 22,464 autosomale SNPs. Disse blev opnået ved at fjerne store high-LD regioner, SNPs med en MAF 0,01, eller SNP’er med HWE P-værdi 10-6, og udfører LD beskæring ved hjælp af Plink indstillingen: “-indep-parvis 50 5 0.2 “. Inspektion de første 10 pc’er, vi identificeret 12 befolkningsundersøgelser outliers, 9 af dem var selvrapporterede ikke-finsk afstamning; vi udelukkede disse 12 personer fra efterfølgende analyse.

SNP analyse af exome sekventering

SNP genotypefrekvenser blev undersøgt for Hardy-Weinberg ligevægt (HWE) ved hjælp af χ

2 statistik, og alle viste sig at være konsekvent, (P 0,05), med HWE blandt koreanske kontroller. Data blev analyseret ved anvendelse af en ubetinget logistisk regression til at beregne en odds-ratio (OR) som et estimat af den relative risiko for PGU forbundet med SNP genotyper. For at bestemme sammenhængen mellem genotype og haplotype distributioner, blev udført en logistisk analyse kontrollerer for alder (kontinuerlig værdi) som kovariat at fjerne eller mindske eventuelle forstyrrende faktorer, der kan påvirke resultaterne. Lewontin s D ‘(| D’ |) og LD koefficient r

2 blev undersøgt for at måle bindingsuligevægt mellem alle par af biallel loci [14]. De haplotyper blev udledes af de succesfuldt genotypede SNPs hjælp PHASE algoritme ver. 2.0 [15], under anvendelse af SAS-version 9.1 (SAS Inc., Cary, NC, USA). Det faktiske antal uafhængige markør-loci blev beregnet til at korrigere for multipel testning, ved hjælp af softwaren SNPSpD (https://www.genepi.qimr.edu.au/general/daleN/SNPSpD/), som er baseret på den spektrale nedbrydning ( SPD) af matricer af parvise LD’er mellem SNP’er [16]. Den resulterende antal uafhængige markør loci (23,1), blev anvendt til at korrigere for multiple test. Alle p-værdier fra resultaterne blev korrigeret for flere test ved at kontrollere for falske opdagelse sats (FDR) [17].

Statistisk analyse

I alt 257 PCA patienter med lav risiko var stratificeret i to grupper efter PGU. Ved sammenligning patienter med og uden PGU, vurderede vi forskellen i klinisk-patologiske profiler af patienter, som brugte chi i anden-test, Fishers eksakte test, og Mann-Whitney-test. Multivariat logistisk regression med justering Epstein kliniske faktorer, såsom PSA tæthed, klinisk fase, antal positive biopsi kerne, procentdel af tumor i en kerne, og alder, blev udført for at identificere en uafhængig prædiktor for PGU. Predictive nøjagtighed for den førnævnte multivariat logistisk regressionsmodel blev vurderet med Receiver Operating egenskaber afledt areal under kurven (AUC) analyse. En anden multivariat logistisk regressionsmodel blev bygget med tilsætning af genetisk information afledt af exome sekventering blev prædiktive nøjagtighed vurderet ved samme metode. De to AUC’er blev sammenlignet via en Mantel-Haenszel-test. Den SPSS softwarepakken udgave 15.0 (Statistisk Package for Social Sciences, Chicago, IL, USA) og Medicalc software version 11 (Mariakerke, Belgien) blev anvendt til statistisk analyse. En 2-tailed P 0,05 blev betragtet som signifikant for alle analyser

Resultater

Blandt de 257 lavrisiko-PCA patienter, 203 patienter (78,9%) viste PGU.. Patientens karakteristika i overensstemmelse med PGU er beskrevet i tabel 1. De 257 patienter i PGU gruppe havde højere PSA tæthed, mindre prostata volumen, højere positiv kerne procentdel, og højere tumor procentdel i kerner, end de 54 patienter i nogen PGU gruppen.

De genotypefrekvenser i både PGU og ingen PGU blev analyseret ved hjælp af en logistisk regressionsmodel (fig. 1). Resultater fra genotype 242,186 SNPs på en brugerdefineret HumanExome BeadChip 12v1-1 (Illumina Inc.) i blod DNA, viste, at 15 SNP’er (rs3795832, rs606149, rs4927635, rs3770657, rs61740794, rs3770655, rs12469465, rs33999879, rs1823068, rs117692893, rs3857984, rs12895416 , rs4805162, rs641738 og rs1801164) var signifikant associeret med PGU hos mænd med lav risiko PCa (tabel 2). De øverste fem foreninger fundet for PGU var ikke-synonyme SNP’er: rs33999879 (SMC4, Asn356Ser, OR = 0,07, P = 5,4 × 10

-7), rs117692893 (KIAA0319, Ser255Thr, OR = 0,16, P = 9,7 × 10

-6), rs641738 (TMC4, Gly17Glu, OR = 0,39, P = 8,1 × 10

-5), og rs4805162 (ZNF565, Thr188Ile, OR = 0,43, P = 9,6 × 10

-5 ) var negativt korreleret med PGU. Den rs4927635 (SNTG2, Thr495Met, OR = 2,69, P = 3,1 × 10

-5) var positivt korreleret med PGU efter logistisk analyse. En anden væsentlig SNPs – rs61740794 (OR: 2,14), rs12469465 (OR: 2,16), og rs12895416 (OR: 2,21) var positivt korreleret med PGU, men alle de andre var negativt korreleret med PGU. Blandt disse top SNPs, rs33999879 bibeholdt betydning efter mindre strenge korrektion for multiple test, estimere en FDR af 50% for P. 0,01, (se justeret p-værdien i tabel 2)

Den blå linje repræsenterer p = 1 × 10

-5.

de Multivariate modeller med variablerne alder, PSA tæthed, klinisk fase, antallet af positive kerner, og tumor procent i kerner, der medtages eller udelukkes rs33999879, er vist i tabel 3. PSA tæthed, antal positive kerner, og tumor procent i kerner, var væsentlige prædiktorer for PGU i lavrisiko-PCA patienter, som gennemgik RP. De prædiktive nøjagtigheder for den flerdimensionale model, som omfattede og udelukkede rs33999879, var 82,9% og 78,3%, henholdsvis blandt PCA patienter med lav risiko. Herunder rs33999879 i den model, som består af Epstein kriterier, signifikant øget den prædiktive nøjagtighed (95% CI: ,0000737-,0893, p = 0,0196) (Figur 2).

Diskussioner

Den foreliggende undersøgelse blev udført for at undersøge de potentielle genetiske biomarkører for PGU i lavrisiko-PCA patienter. Logistisk regressionsanalyse foreslået, at man SNP, (rs33999879), var signifikant omvendt forbundet med en risiko for PGU i prostatakræft, sammenlignet med dem, der ikke oplever PGU. Desuden har vi anvendt denne information fra genetiske undersøgelser til en reel klinisk model baseret på tidligere etablerede faktorer, og vi fandt en ekstra prædiktiv gevinst i at opdage CIPC.

AS er en lovende mulighed for PCa, at reducere aktiv behandling relateret komplikationer og for at opretholde livskvaliteten, men har der været bekymring forsinke behandling [10], [11]. Derfor er den præcise udvælgelse af kandidater til AS er meget vigtig, og mange kriterier er blevet indført og valideret [18]. Blandt dem, Epstein kriterium til forudsigelse CIPC er nok den mest anvendelige i den aktuelle kliniske omgivelser. Øjeblikket, Epstein kriterium, som bruges af NCCN, måske nok være det bedste værktøj til forudsigelse af CIPC. Men tidligere rapporterede valideringsstudier af Epstein kriterier viste noget skuffende resultater. Bastian et al. [19] viste, at Epstein kriterier var unøjagtige forudsige ubetydelig tumor i 16% af tilfældene. Jeldes et al. [20] viste også, at 24% af mændene inkluderet i Epstein kriterier havde oplevet patologiske GS opgradering efter RP i europæiske kohorter. I koreanerne, samme etnicitet som i denne undersøgelse, Lee et al. [21] viste 30,5% patologisk GS opgradering efter RP, hos mænd, der opfyldte kriterierne i Epstein. For nylig Sundi et al. [11] viste 27,3% af afrikansk-amerikanske mænd med meget lav risiko for PCa udstillet patologiske GS opgradering.

For at overvinde denne uoverensstemmelse mellem de kliniske kriterier og reelle kliniske resultater, undersøgelser nye biomarkører til at forbedre evnen til at kategorisere PCa er væsentlige [18]. På grund af fremskridt i forståelsen af ​​den molekylære biologi af prostata carcinogenese, flere følsomhed gener, og mange ekstra mekanismer involveret i carcinogenese og kræft progression er blevet opdaget [22]. Men ingen enkelt biomarkør er i stand til at forbedre på de fælles kliniske parametre, der indgår i de for tiden anvendte prognosemodeller. Undersøgelsen fra Haese et al. [23], undersøgt anvendelsen af ​​PCA3 (prostatacancer antigen 3) test i en rebiopsy indstilling af patienter med en negativ prostata biopsi. I deres arbejde, evnen til at opdage PCa risiko øges med stigende PCA3 scoringer, og dermed PCA3 test kan være gældende for overvågning uden aktiv behandling. Men Deras et al. [24] viste, at PCA3 var uafhængig af tumor volumen, hvilket er grunden til den sande værdi af PCA3 øjeblikket fortsat uklart.

Seneste genom-dækkende forening undersøgelser (GWAS) af PCa har identificeret mange regioner i genomet huser modtagelighed alleler, der bibringer risiko for PSA. Eeles et al. [12] identificeret 23 nye PCa modtagelighed loci i en velorganiseret, store kohorte, undersøgelse. Schumacher et al. [25] viste, at 2q37.3 (rs2292884) var en ny modtagelighed locus forbindelse med den samlede PSA. Men disse undersøgelser stammede fra case-control undersøgelser, hvor kontrolgruppen var fra en normal sund befolkning. Vores undersøgelse er den første til formål at identificere genetiske markører til at forbedre den prædiktive nøjagtighed PGU blandt homogene mænd, der gennemgik RP.

rs33999879 SNP er placeret på 3q26.1 inden den strukturelle vedligeholdelse af kromosom 4 (SMC4) , hvilket er kritisk for mitotisk kromosomkondensering og DNA-reparation. En tidligere undersøgelse om SMC4 i leverkræft og lymfom viste, at SMC4 var forbundet med tumorstørrelse og fremskredne stadier af kræft [26], men der er ingen undersøgelser der undersøger SMC4 og PCa. Ved bio-molekylære undersøgelse om SMC4 i prostatakræft, bør vi bekræfte mekanismen i SMC4 i PSA. Styrkerne i vores undersøgelse var, at vi anvendte oplysninger fra genetik til en reel klinisk indstilling, justering tidligere etablerede faktorer-såsom PSA tæthed, klinisk fase, og biopsi tumor volumen, som er faktorer i Epstein kriterier. Efter herunder den genetiske information, blev forudsigelseskraft om PGU væsentligt forøget, derfor denne genetiske information kan være en passende genetisk markør for at vælge patienter til AS.

Den foreliggende undersøgelse havde flere begrænsninger. Lille stikprøvestørrelse og afvigelse på hver gruppe repræsenterer en af ​​dem, men for alle de mænd der indgår i denne undersøgelse, var fra en homogen race befolkning. PCA diagnosticeret i asiatiske, amerikanske og europæiske mænd kan have medfødte forskelle forbundet med racemæssige og /eller miljømæssige faktorer. Som PCa er hormon-afhængige har forskellige forskere foreslået, at racemæssige forskelle i serum niveauer af testosteron, sammen med dets derivater, kan bidrage til forskelle i PCa risici og prognoser, blandt forskellige racer [27], [28]. Nogle har foreslået, at sådanne forskelle i hormonale miljø, foruden en mangel på PSA-screening, kan også spille en rolle i den generelt mere aggressive profil PCa diagnosticeret i moderne koreanske mænd, sammenlignet med deres vestlige modstykker [29]. Disse virkninger af race forskel kan have deres oprindelse i genetiske forskelle; Derfor kan vores data fra en asiatisk befolkning adskiller sig fra fra studiet af vestlige befolkning. En anden begrænsning var høje antal PGU i lavrisiko-PCA patienter. Det indre patolog, der har en specialitet for uro-onkologi gennemgået alle de prøver, der indgår i denne undersøgelse gennem International Society of Urologiske Patologi (ISUP) anbefaling af modificeret Gleason score som annonceret i 2005 efter håndtering af meget tynde snit. Uanset omfanget af tumor, blev enhver Gleason mønster 4 fundet i en sektion ved radikal prostatektomi prøven med 99% Gleason mønster 3, derfor Gleason score var 3 + 4. I vores resultater, blev 174 patienter (85,7%) patologisk opgraderet til Gleason score 3 + 4 og kun 29 patienter (14,3%) til Gleason score 4 + 3 blandt 203 patienter havde oplevet PGU efter RP. Tidligere vores hospital data viste 30,5% PGU blandt klinisk ubetydelig prostatacancer [21], men nyligt revideret Gleason pointsystemet havde trend en højere PGU efter RP. På trods af disse begrænsninger, bør potentialet prædiktiv markør blive bedømt på sin evne til at forbedre den allerede eksisterende optimeret prædiktiv model i stedet for blot på sin status som en uafhængig variabel [30]. Vores konklusion er nyttigt for patienter og klinikere, der beskæftiger sig med komplekse behandling beslutninger, og vi kan have identificeret en roman, klinisk anvendelig, biomarkør, som naturligvis vil have skal valideres i stor skala, multiracial undersøgelse.

konklusioner

Vi viste, at rs33999879 var en signifikant prædiktor for PGU, og at tilføjelsen af ​​genetisk information fra exome sekventering reelt forbedret den prædiktive nøjagtighed flerdimensionale model, som indarbejdet forskellige faktorer, herunder kriterier for AS. Disse resultater bør valideres i en fremtidig undersøgelse, og dette kunne føre til en præcis model, der gør det muligt for egnede CIPC patienter til at blive udvalgt til AS.