PLoS ONE: Identifikation af Cancer cellelinie Origins under anvendelse af fluorescens billedbaserede Phenomic Screening

Abstrakt

Universal fænotypebestemmelse teknikker, der kan skelne mellem forskellige stater i biologiske systemer har et stort potentiale. Vi anvendte 557 fluorescerende bibliotek forbindelser til NCI 60 humane cancer cellelinjer (NCI-60) til at generere en systematisk fluorescens fænotypisk profilering af data. Ved den kinetiske fluorescensintensitet analyse, vi med succes diskrimineret organet oprindelsen til alle de 60 cellelinier

Henvisning:. Lee J-S, Kim YK, Kim HJ, Hajar S, Tan YL, Kang N-Y, et al. (2012) Identifikation af Cancer cellelinie Origins under anvendelse af fluorescens Image-Based Phenomic Screening. PLoS ONE 7 (2): e32096. doi: 10,1371 /journal.pone.0032096

Redaktør: Nikos K. KARAMANOS, University of Patras, Grækenland

Modtaget: Oktober 5, 2011; Accepteret: 19 januar 2012; Publiceret: 23 feb 2012

Copyright: © 2012 Lee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en intramuralt finansiering fra agenturet for Videnskab, Teknologi og Forskning (A * STAR), Singapore Biomedical Research Council og A * STAR SSCC Grant (SSCC10 /024). Dette arbejde blev også støttet af de konvergerende Research Center Program gennem Ministeriet for undervisning, videnskab og teknologi (2010K001410). JSL er en modtager af T. J. Park Science Fellowship. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

en væsentlig udfordring for funktionel genomforskning er at identificere genotyper, der er forbundet med en bestemt fænotype. Nylige fremskridt i genekspression profilering og næste-generations sekventering (NGS) teknologi har kørt betydelige forbedringer i high-throughput genotypning. [1], [2] Til forskel fra de veletablerede genotypebestemmelse platforme, er der ingen standard kvantitative metoder til fænotypebestemmelse endnu. [3] fænotyper kan defineres på mange forskellige niveauer; fx biokemiske eller fysiologiske egenskaber, der kan måles på celleniveau, eller adfærd eller kliniske historie på en organisme niveau. [4] Hver fænotypiske måling har været brugt til yderligere undersøgelse fra sag til sag. For eksempel, adfærd og hjernescanning mønster er ofte blevet brugt til Phenomic karakter i neurovidenskab, [5] – [8] og CD (klynge af betegnelse) -marker baserede biokemiske fænotyper er flittigt brugt til at skelne mellem celletyper på forskellige områder. [9], [10] Der er dog endnu ikke universelt Phenomic parameter, der kan anvendes på forskellige screening formater. [11]

Vi forestillede at en fluorescerende probe bibliotek ville have et stort potentiale til at identificere et sæt af universelle Phenomic parametre på grund af deres ensartede fænotypiske udlæsning (fluorescens signal), kontroller nemt dosis, høj følsomhed til mikro-miljøer, og strukturel diversitet på det molekylære niveau. Vores gruppe har for nylig udviklet fluorescerende biblioteker og rapporterede en række billeddiagnostiske sonder i glucagon secernerende celler, [12] differentierede myotube celler, [13] og pluripotente stamceller. [14] Selv i tilfælde de intracellulære mål ikke er klart defineret, den fænotypiske signatur kan anvendes til en lang række applikationer. [15] Endnu vigtigere er, afhængigt af egenskaberne af den fluorescerende probe, højt indhold information kunne udvindes fra en enkelt fluorescens billede. [16], [17] I overensstemmelse hermed fluorescerende fænotype profilering ved hjælp af syntetiske sonder kan afsløre subtile forskelle i biokemiske egenskaber. I dette papir, rapporterer vi det første fluorescensintensitet-baserede cellulære Phenomic profilering undersøgelse med en mangfoldighed orienteret fluorescens bibliotek (DOFL) og NCI-60 cancer cellelinjer.

For at demonstrere Phenomic omfanget af fluorescens billedbaseret screening metode blev 60 menneskelige kræftceller (NCI-60) af National cancer Institute Developmental Therapeutics Program valgt. Disse celler blev udvalgt baseret på følgende to grunde. (I) det er den største standard samling af brede kræft celletyper. NCI-60 Sættet består kræft i 9 forskellige oprindelser, herunder leukæmi, melanomer, nyre-, bryst-, tyktarms-, lunge-, CNS, prostata, og ovariecarcinomer. (Ii) rige biokemisk baggrundsoplysninger om samlingen er tilgængelig for offentligheden. Egenskaberne ved NCI-60 sæt er blevet profileret på genomiske, [18], [19] proteomiske, [20] og narkotika effekt niveau, [21] – [23], og disse data kan let anvendes til yderligere “omics “undersøgelser. Mens forskellige profilering tilgange er ofte blevet udforsket at karakterisere NCI-60 celle-linjer, har en systematisk fluorescerende probe-baseret profilering ikke forfulgt endnu.

Resultater og Diskussion

Fluorescerende prober og fluorescens fænotypebestemmelse

Kombination af rosamine (RS) og BODIPY (BD) fluoroforen biblioteker (240 rosamine [24] og 317 BODIPY [12] forbindelser, 557 forbindelser i alt) blev anvendt til frembringelse fluorescens fænotypebestemmelse data. Som tidligere rapporteret, viste disse forbindelser god celle permeabilitet, og bred absorbans (λ

abs = 480~616 nm) og fluorescensemission (λ

em = 530~656 nm) varierer med en bred strukturel diversitet. For at maksimere oplysninger fra celle assays, vi udnyttet en hel celle fluorescens billede-baserede screening platform, hvilket vil give integrerede cellulære egenskaber, såkaldte high-indhold screening. Storskala profilering blev udført under anvendelse af et automatiseret fluorescens mikroskop systemet (ImageXpress Micro, Molecular Devices, Inc.). NCI-60-celler blev udpladet i tynd-bottom 384-brønds plader ved 70% konfluens, og 557 fluorescerende forbindelser blev tilsat til forskellige brønde ved to slutkoncentrationer på 250 nM og 500 nM. Fluorescens-billeder blev opnået både ved FITC og TRITC kanaler til at dække det brede udvalg af spektre af proberne. Fluorescerende billeder blev taget fra to uafhængige steder på hver brønd for 3 tidspunkter (1 time, 24 timer og 48 timer), og alle eksperimenter blev duplikeret. Alt sammen blev 1,604,160 billeder (557 sonder × 60 cancerceller × 2 koncentrationer × 2 kanaler × 2 sites × 3 gang points × 2 dubletter) indsamlet. Et repræsentativt fluorescens billeddata BD-46 er præsenteret i figur 1, og detaljerne i pladen design er beskrevet i figur S1. Ud fra disse fluorescens billeder, kunne mange forskellige slags funktioner, såsom morfologi, tekstur, eller intensitet ekstraheres og anvendes som en fænotypisk signatur. [25] Navnlig de farvning intensiteter og mønsteret af lokaliseringer varierede i individuelle cellelinjer, selv om alle celler blev farvet med en identisk mængde af BD-46.

Kvantitative fluorescensintensitet profilering af NCI -60 cellelinier

Blandt forskellige mulige parametre, fokuserede vi på fluorescensintensiteten af ​​cellerne, da billedet forarbejdningsmetode var ligetil og de behandlede data var mindre afhængig analysen algoritme end andre. For yderligere at undertrykke artefakt fra batch-til-batch variationer (dette er især vigtigt i denne undersøgelse på grund af den lange datafangst tid end 2 år), besluttede vi at bruge fluorescensintensitet gange ændring over tid (intensitet kinetiske profil), snarere end den absolutte værdi af intensiteten. Først målte vi middelværdierne for fluorescensintensiteten af ​​cellerne, og intensiteten mønster for forskellige cellelinier blev analyseret ved deres intensitet kinetiske profil (fold ændring af intensitetsværdierne ved 48 timer i løbet af 1 time; databehandlingen protokoller beskrevet i de eksperimentelle metoder). Derefter analyserede vi den overordnede mønster ændring af NIC-60 sæt cellelinier fluorescensintensitet ved Heatmap analyse og hierarkisk clustering (fig. 2). Generelt, lunge, colon og ovariecancerceller var godt klassificeret af den simple klyngedannelse. På den anden side, ud fra et perspektiv af kemisk struktur, fluorescerende forbindelser, som deler samme klasser af xanthone derivat struktur (f.eks RS-A, RS-E og RS-K) udviste lignende respons mønster i cellelinjer til samme cancer oprindelse (fig. S2).

Fluorescensintensitet fold ændringer blev grupperet for de 557 fluorescerende prober (x-akse) på tværs af de 60 cancercellelinier (y-akse). Fold = (fluorescensintensiteten ved 48 h inkubation) /(fluorescensintensitet ved 1 h inkubation).

Interessant en bemærkelsesværdig signaturen blev observeret for RS-K række forbindelser. Disse forbindelser oprindeligt viste lav fluorescensintensitet, men efter 24 timer blev deres fluorescens dramatisk forøget kun specifikt sæt af cellelinier (HCT-116, HT29, Colo205, HCC-2998, EKVX, HOP-62, NCI-H460, NCI -H322M, og NCI-H23). Desuden blev fluorescens respons profiler højt korreleret med sonden struktur og cancer celletype (fig. S2). For eksempel en serie af RS-K-forbindelser (K1, K3, K4, K14, K15, K16, og K17) udviste fluorescens turn-on effekter i lunge- og colon-cancerceller (fig. S3), og RS-E-forbindelser ( E1, E3, E7, og E29) viste turn-on responser i lungekræft celler (fig. S4). Selv fluorescens respons RS-K og RS-E serien steg for disse specifikke kræftceller, viste hver forbindelser subtil, men distinkt signatur. Især viste RS-K-forbindelser turn-on effekter over brede intervaller af lungecancer celle, men de adskiller reaktionsmønster afhængigt af 9-phenylringen struktur rosamine (fig. S3). Det er også bemærkelsesværdigt at pege på nogle af disse prober skelne specifikke cellelinier fra identisk kræft oprindelse. RS-E1, RS-E3 og RS-E7 forbindelser selektivt aktiveret kun i ACHN celler blandt nyrecancerceller (Fig. S5). Desuden har de udviste specifik respons på SW60-celler, men ikke i resten af ​​6 colon cancerceller.

En anden cellelinie specifik profil blev observeret med RS-C3 forbindelse. RS-C3 inducerede en stærk fluorescens turn-on virkning kun i KM12 celler, en human coloncancer cellelinie, blandt 60 cellelinjer (Fig. 3). Sammenlignet med gennemsnitlige fluorescensintensiteter i andre NCI-60-celler, RS-C3 udviste en usædvanlig 5,64 gange højere intensitet i KM12 celler. For at udforske den funktionelle egenskab ved de km122 celler, der inducerer selektiv fluorescens fænotype, analyserede vi mRNA-ekspression data for NCI-60 cellelinjer. Baseret på mRNA udtryk data fra GSE5846, differentielt udtrykte gener (degs) at opreguleret i KM12 celler (Log

2 (Fold) 1,5) blev udvalgt, og deres gen anmærkning oplysninger blev analyseret. Kegg pathway og gen ontologi analyser identificeret fem veje, der udviser signifikant forskel (

P

værdi 0,001) mellem KM12 celler og alle de andre NCI60 celler, såsom celle kommunikation, hæmatopoietisk celle afstamning, urinstof cyklus og metabolisme af aminogrupper og p53-signalvejen (tabel S3, S4). Med disse kombinationer af DEGS-ekspression, er det muligt at skelne KM12 celler ud af andre NCI60 cellelinier og opreguleret profil af disse gener er unikke funktionelle underskrift KM12 celler. Da fluorescens fænotype af RS-C3 viser kollektive oplysninger af sådanne DEGS profil inden for en enkelt fluorescens image som intensitetsændringer, denne probe har potentiale til at føle en tilsvarende funktionel underskrift andre cellelinjer. Mens det ikke var klart for øjeblikket, hvilke former for endogen biomolekyle er direkte interagere med denne probe, kan det anvendes til visuelt at identificere en coloncancercellelinie (KM12) blandt 60 cancercellelinier efter 24 h præinkubation.

(a) søjlediagram af kinetisk fold ændring (b) fluorescens billeder af 60 cancer cellelinjer.

diskrimination af kræft celle oprindelse

for kvantitativ mønster analyse, intensiteten kinetiske profiler blev yderligere undersøgt ved hjælp af lineær diskriminant analyse (LDA) at klassificere kræft celletyper. LDA er et almindeligt anvendt klassifikation metode specielt til høje dimensionelle data for reduktion af dimensionalitet. Ved at anvende LDA til kinetiske profiler, var det muligt at vurdere gange ændring responser af hvert kemikalie probe for optimal identifikation cancercelle, og generere score funktion til at forudsige identiteten af ​​celler selv hver probe viser ikke specifik respons på enkelt cellelinje. Den mindste fluorescerende probe sæt, der kunne skelne 9 kræft celletyper blev valgt af en fremadrettet trinvis variabel algoritme udvælgelse, og 37 forskelligt reagerer fluorescerende prober blev udvalgt (fig. S6). Overraskende blev alle 60 kræftceller held grupperet på en LDA score plot (fig. 4), og 98% var korrekt tildelt hver af de oprindelige grupper med

jackknifed

krydsvalidering (tabel S1). LDA scoringer er vilkårlige enhedsværdier, der repræsenterer maksimal identitet forudsigelse, og vores resultat viste den første og anden højeste LDA scoringer var nok til at diskriminere 60 cellelinjer i form af kræft oprindelse (tabel S2). Det er værd at bemærke, at klassificering ved hjælp af en kombination af både BD og RS sonder blev langt mere vellykket, som bestemt ved krydsvalidering end hvilken som helst kombination af enten RS eller BD sonder alene (tabel 1). Dette resultat indebærer, at kemiske diversitet fluorescerende prober anvendt til at generere intensitetsprofilen væsentligt påvirket resultaterne af klassificeringen kræft typen. Et andet interessant aspekt af udvalgte 37 prober sæt er, at ingen af ​​disse prober er selektive for enkelt celle eller cancertyper. De viste unikke respons mønstre for multiple cellelinier, og målcellen var ikke altid begrænset inden identiske typer cancer. Vi tror sådanne selektive reaktioner stammer af specifik biokemisk signatur eller integreret intakte miljøer i mål celletyper.

x- og y-aksen repræsenterer den højeste og 2

nd højeste LDA point ved celle scoring funktion (tabel S2). De 60 cancer cellelinjer blev mærket i henhold til oprindelsen af ​​kræft type CNS: rød, kolon: lilla, leukæmi: orange, lunge: grøn, melanom: pink, bryst: mørkegrøn, prostata: lyserød, æggestokkene: grå, og renal:. Oliven

Konklusion

kort sagt, rapporterer vi det første fluorescensintensitet-baserede fænotype profilering af 60 humane cancer cellelinjer (NIC-60) ved hjælp af syntetiske fluorescerende prober. Strukturel diversitet af de fluorescerende prober synes at være en kritisk faktor for frembringelsen af ​​forskellige fænotyper, og vores resultater viste, at 60 cancer cellelinier alle held diskrimineres i forhold til 9 cancercellelinier oprindelse. har været fokuseret mest vægt i kræftforskning på patogenese og metastase, og metastase forskning er blevet stagneret på grund af manglende pålidelig sporing teknik, der kunne visualisere en bestemt oprindelse af kræftceller. Fluorescens forbindelser, sonde specifikke oprindelse kræftcelle kunne ikke kun give et nyt vindue for metastaser forskning, men også anvendes til kræft diagnose og progression overvågning. Selv om denne undersøgelse har begrænsninger i at vi udførte identifikation af cancerceller oprindelse kun bruger

in vitro Salg cancercellelinier, vores resultater tilvejebragt en anelse, at kombinationer af fluorescerende prober kunne skelne komplekse og subtile forskelle af cancerceller. Baseret på svar mønster blev bedre identifikation opnåede resultat, når flere fluoroforen stilladser blev brugt, og profilerne fluorescens intensitet var stærkt korreleret med den kemiske struktur af de fluorescerende prober og kræftformer. Disse resultater viser den praktiske anvendelighed af mangfoldigheden-orienteret fluorescens bibliotek tilgang i universel celle fænotype.

Metoder

Mangfoldighed-orienteret fluorescens bibliotek forberedelse

rosamine og BODIPY bibliotek forbindelser blev fremstillet ifølge tidligere beskrevne protokoller, og forbindelsen strukturer og karakterisering data er blevet rapporteret. [12], [24], [26] Alle forbindelser blev opbevaret ved -20 ° C i microtilter plader i fast form, og stamopløsninger blev fremstillet ved at opløse forbindelserne i DMSO før screening.

NCI 60 kræft cellekultur

de NCI-60 cellelinjer blev opnået fra National cancer Institute. Alle NCI-60 cellelinjer blev dyrket som beskrevet i distributørens manual. Kort fortalt blev celler dyrket i en høj-glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% FBS og 1% antibiotika.

Kvantitativ fluorescensintensitet analyse

gennemsnitsværdier af fluorescensintensiteter var beregnes ved hjælp af Matlab 7.9.0 (R2009b). I vores datasæt, 4 billeder repræsenterede hver eksperimentel tilstand (2 duplikere × 2 billeder /godt). Vi kombinerede de 4 billeder ved hjælp af

cat

funktion i Matlab at optimere IO behandling. For at minimere baggrund effekt blev kun fluorescensintensiteten værdier for området, der var positive for Otsu tærskel anvendes til at beregne den gennemsnitlige værdi.

graythresh

og

im2bw

funktioner i Matlab billedbehandling modul blev anvendt til beregning Otsu tærskel og valg celleområdet. Alle kvantitative billedbehandling batchjob blev beregnet ved hjælp af en 16-node PC klynge i 3 dage.

diskriminantanalyse

Lineær diskriminant analyse (LDA) blev udført ved hjælp af fold ændre værdier af fluorescensintensiteter mellem 48 timer og 1 time inkubation point. Probe udvælgelse blev behandlet af fremadrettede trinvis variabel udvælgelse algorithum i SYSTAT (version 13).

NCI-60 genekspression og sti analyse

mRNA ekspressionsmønstre for NCI-60 sæt celle linjer blev hentet fra databasen NCBI genekspression omnibus (GEO). De GSE5846 blev analyseret ved hjælp GenePlex v3.0 DEG fund og Pathway analyse moduler (ISTECH, Inc.).

Støtte Information

figur S1.

Skema af NCI-60 assay-format. Vi anvendte brønds plade til high throughput fluorescerende billeddannelse 384. 60 celler blev opdelt i 13 undergrupper (hvert sæt indeholder mindre end 5 cellelinier), og 2 fluorescerende prober er testet med hver af delmængder i en individuel brønd plade. Siden dyrkningsmedier fordampe hurtigt i kant brønde, først og sidste to kolonner ikke blev anvendt til analysen

doi:. 10,1371 /journal.pone.0032096.s001

(TIF)

Figur S2.

SAR af fluorescerende prober i fænotype profil. Hierarkisk klynge af fluorescerende respons fænotype afslører strukturelle forhold fluorescerende probe. Fluorescensintensitet ændrer mønster af 557 fluorescerende prober (X-akse) over 60 cancerceller (y-akse) blev grupperet. Fold = (fluorescerende intensitet efter 48 timers inkubation) /(fluorescensintensitet efter 1 time inkubation)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0032096.s002

(TIF)

Figur S3.

Fluorescensintensitet profil RS-K-serien. (A) Fluorescence respons profil af RS-K15 i NCI60 celler og fluorescens billeder af lungekræft cellelinier. Første og anden række billeder blev taget efter 1 time og 24 timer efter sonde behandling hhv. Alle 4 billeder for hver eksperimentel betingelse er vist. (B) Fluorescensintensitet søjlediagram mønster af RS-K serien mod 60 cancer cellelinje

doi:. 10,1371 /journal.pone.0032096.s003

(TIF)

Figur S4.

Fluorescensintensitet profil RS-E-serien.

doi: 10,1371 /journal.pone.0032096.s004

(TIF)

Figur S5.

Cell line specifik reaktion RS-E serie forbindelser blandt nyre- og tyktarmskræft oprindelse. Fluorescensintensitet søjlediagram af RS-E1, RS-E3, og RS-E7 forbindelser til kræftceller fra (a) kolon og (b) nyrerelateret

doi:. 10,1371 /journal.pone.0032096.s005

(TIF)

Figur S6.

Strukturer af 37 udvalgte fluorescens sonder fra LDA. Sonder blev choosed baseret på trinvis fremad automatisk variabel udvælgelse algoritme med alfa-til-ind: 0.150 og alpha-til-remove:. 0.150 kriterier ved hjælp SYSTAT v13

doi: 10,1371 /journal.pone.0032096.s006

(TIF)

tabel S1.

jackknifed krydsvalidering

matrix for tre sæt af fluorescerende prober.

doi: 10,1371 /journal.pone.0032096.s007

(XLS)

tabel S2.

LDA score funktion og koefficienten af ​​udvalgte fluorescerende prober.

doi: 10,1371 /journal.pone.0032096.s008

(XLS)

tabel S3.

Udvalgte Kegg veje baseret på degs af KM12.

P

-værdier blev beregnet ved

Fishers eksakte test

doi:. 10,1371 /journal.pone.0032096.s009

(XLS)

Tabel S4.

Top 20 biologiske processer fra gen ontologi annotation af DEGS i KM12 celle

doi:. 10,1371 /journal.pone.0032096.s010

(XLS)

Tak

Vi vil gerne takke Sydkorea Institut for Videnskab og Teknologi til kvantitativ billedanalyse ved hjælp af PC klynge.