PLoS ONE: Overekspression og lille molekyle-udløst nedregulering af CIP2A i Lung Cancer

Abstrakt

Baggrund

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræftdødsfald i verden, med en fem-årig samlet overlevelse på kun 15%. Kræft hæmmer af PP2A (CIP2A) er et humant oncoprotein hæmme PP2A i mange humane maligniteter. Men om CIP2A kan være et nyt lægemiddel mål for lungekræft er stort set uklar.

Metode /vigtigste resultater

normale og maligne lungevæv blev afledt fra 60 lungekræftpatienter fra det sydlige Kina. RT-PCR, Western blotting og immunohistokemi blev anvendt til at evaluere ekspressionen af ​​CIP2A. Vi fandt, at blandt de 60 patienter, CIP2A var målbart eller meget lav i paratumor normale væv, men blev dramatisk forhøjet i tumorprøver i 38 (63,3%) patienter. CIP2A overekspression var forbundet med cigaretrygning. Silencing CIP2A af siRNA hæmmede spredning og klonogen aktivitet lunge kræftceller. Interessant nok fandt vi en naturlig forbindelse, rabdocoetsin B som er udvundet af en traditionel kinesisk lægeurt Rabdosia coetsa, kunne fremkalde nedregulering af CIP2A og inaktivering af Akt vej, og hæmme proliferation og inducere apoptose i en række lunge kræftceller.

konklusioner /betydning

Vores resultater indikerer stærkt, at CIP2A kunne være en effektiv mål for udvikling lungekræft stof, og de terapeutiske potentialer CIP2A-målretning agenter berettiger yderligere undersøgelser.

Henvisning: Ma L, Wen ZS, Liu Z, Hu Z, Ma J, Chen XQ, et al. (2011) Overekspression og Small Molecule-udløst nedregulering af CIP2A i lungekræft. PLoS ONE 6 (5): e20159. doi: 10,1371 /journal.pone.0020159

Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center på Dallas, USA

Modtaget: 31 Januar 2011; Accepteret: April 12, 2011; Udgivet: 31. maj 2011

Copyright: © 2011 Ma et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af National Key Program for Basic Research (973, 2010CB529201), Key Project of Knowledge Innovation Program af det kinesiske Academy of Sciences (KSCX1-YW-R-26 og KSCX2-YW-R-235), den National Natural Science Foundation of China (81071930, 30871110), National store videnskabelige og teknologiske Program for Drug Discovery (2009ZX09103-101) og Videnskab og Teknologi Planlægning Projekt Guangzhou (2009Y-C011-2). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Næsten 1,5 millioner mennesker blev diagnosticeret med lungekræft og 1,4 millioner mennesker blev anslået til at dø af det i 2007 [1]. De to store former for lungekræft er ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og småcellet lungecancer (SCLC). Ca. 85% af lungekræfttilfælde NSCLC, som kan opdeles i tre store histologiske undertyper: pladecellekarcinom, adenocarcinom, og store celle karcinom. SCLC udgør ca. 15% af lungecancere [2]. Rygning forårsager alle typer af lungekræft, men er stærkest forbundet med SCLC og pladecellekræft; adenocarcinom er den mest almindelige type hos patienter, der aldrig har røget [2]. Nuværende behandling er bestemt af den histologiske type af lungekræft og stadium ved diagnose, herunder kirurgi, platin dublet terapi, strålebehandling og målrettet terapi. Desværre, prognosen for lungekræft er dårlig med en kun 15% af fem år samlet overlevelse sats for alle faser tilsammen [1]. Derfor er der et presserende behov for at identificere mere effektive molekylære mål og nye målrettede behandlinger for lungekræft.

Kræft Inhibitor of PP2A (CIP2A) er et humant oncoprotein der stabiliserer c-myc ved at hæmme protein fosfatase 2A (PP2A ) -medieret dephosphorylering af MYC i serin 62 [3]. Ud over at inhibere nedbrydningen af ​​c-Myc, synes CIP2A at blive reguleret i en positiv feedback loop med c-Myc ved at fremme hinandens udtryk [4]. CIP2A er overudtrykt i humane hals og hoved carcinomer, colon, bryst, og gastrisk cancer, og er omvendt korreleret med resultatet sygdom i gastrisk cancer [3] – [7]. Men om CIP2A kunne være et nyt lægemiddel mål for kræft er ikke fuldt undersøgt, og den anti-tumor aktivitet CIP2A-målretning agenter er stort set ukendt. Vi studerede ekspressionen af ​​CIP2A i lungekræft og screenes for blyforbindelser, der kunne målrette CIP2A [8]. Her viser vi, at CIP2A markant er opreguleret i lungekræft tumorer i forhold til patient-matchede tilstødende normale lungevæv, og rapporterer, at en naturlig forbindelse, som udløser nedregulering af CIP2A udviser signifikant antitumoraktivitet i NSCLC-cellelinjer.

Resultater

CIP2A er overudtrykt i lungekræft og er forbundet med cigaretrygning

Vi testede ekspressionen af ​​CIP2A på proteinniveau i ikke-maligne og maligne celler, og fandt, at CIP2A blev højt udtrykt i lungekræft cellelinjer (A549, H1975, 95D og L78) sammenlignet med normale humane embryonale lungefibroblaster (HLF og MRC5) og normale humane bronchieepithelceller (HBEpiC) (figur 1A). Vi analyserede derefter CIP2A i 60 lungekræft prøver fra patienter kom fra det sydlige Kina, hvis baseline karakteristika blev opregnet i tabel 1. Vi viste, at CIP2A var overudtrykt i 38 (63,3%) tumorprøver analyseret ved Western blotting (figur 1B). Men i de 60 patient-matchet tilstødende normale lungevæv, CIP2A var, ikke påvises i 57 (95%) prøver, og blev svagt udtrykt i 3 (5%) prøver, hvor dets ekspression var meget lavere end i tumorprøver fra de samme patienter . I prøver fra 2 patienter med inflammatorisk pseudotumor, blev CIP2A ikke påvist i både pseudotumor og tilstødende lungevæv (figur 1C). Immunhistokemi assay bekræftede, at CIP2A dramatisk blev ophøjet med en højere immunoreaktivitet score i tumorprøver i 26 ud af 39 patienter (66,7%) testet (Figur 1D). På mRNA-niveau,

CIP2A

var også over-udtrykkes i lunge tumorvæv sammenlignet med normale lungevæv i 39 af 58 (67,2%) testede patienter (figur 1E). Tilsammen er CIP2A dramatisk forhøjet i lungekræft tumor prøver sammenlignet med parrede normale lungevæv

(A):. Western blot analyse af CIP2A i humane lunge kræftceller (A549, H1975, 95D og L78), embryonale lunge fibroblastceller (HLF og MRC-5), og normale humane bronchiale epithelceller (HBEpiC). (B): Western blot-analyser af CIP2A protein i primære lungetumorer (T) og tilstødende normale lungevæv (N). β-Actin anvendes som lastning kontrol. Repræsentative resultater er vist og numre omtales enkelte patienter. (C): Western blot-analyser af CIP2A protein i inflammatoriske pseudotumor (P) og tilstødende normale lungevæv (N). β-Actin anvendes som lastning kontrol. (D): Repræsentative billeder (venstre panel) og score (højre panel) af immunhistokemisk farvning for CIP2A udtryk i primære lungetumorer (T) og tilstødende normale lungevæv (N). (E): RT-PCR-analyser af

CIP2A

mRNA i primære lungetumorer (T) og tilstødende normale lungevæv (N).

GAPDH

er ansat som lastning kontrol. Repræsentative resultater er vist og tal henvises til de enkelte patienter.

CIP2A overekspression er forbundet med cigaretrygning

Vi analyserede sammenhængen mellem CIP2A overekspression og nogle clinicopathologic variabler. Dataene viste, at CIP2A overekspression i lungekræft var signifikant korreleret med histologiske type af pladecellecarcinom (p = 0,003) og hankøn (p = 0,008) (tabel 1), der blev vist til kraftigt linke med cigaretrygning [2], [ ,,,0],9]. Desuden vores data viste klart, at høj ekspression af CIP2A var forbundet med smoker patienter (p = 0,004). Ingen signifikant forskel i CIP2A status blev observeret efter den patologiske stadium (p = 0,639) og alder (0,082) (tabel 1). I et forsøg på at klarlægge de væsentligste faktorer i forbindelse med CIP2A overekspression blev de multivariate analyser udført, og multivariat logistisk regressionsanalyse (tabel 2) viste, at cigaretrygning var den eneste signifikante variable i forbindelse med CIP2A overekspression i lungekræft (p = 0,008 ).

nitrosamin 4- (methylnitro-samino) -1- (3-pyridyl) -1-butanon, eller nikotin-afledte nitrosamin keton (NNK), er en vigtig ingrediens i tobaksrøg kræftfremkaldende som systemisk inducerer tumorer i lungen i rotter, mus, og hamstere og også spiller en stor rolle i lunge carcinogenese [10], [11]. Vi undersøgte derefter, om NNK direkte kunne fremkalde opregulering af CIP2A eller ej. For at gøre dette, blev HBEpiC (figur 2A) og BEAS-2B (figur 2B) bronkiale epitelceller eksponeret for NNK ved angivne koncentration for angivne tidspunkter, lyseret, og western blot blev udført for at analysere ekspressionen af ​​CIP2A. Resultaterne viste, at behandling med NNK ved 0,1 til 10 uM i op til 18 dage kunne ikke forstyrrer CIP2A ekspression (figur 2, A og B). I denne undersøgelse har vi ikke teste den langsigtede effekt af NNK på CIP2A udtryk

in vitro

eller

in vivo

(A):. HBEpiC celler blev behandlet med NNK ved forskellige koncentrationer for angivne tidspunkter, og western blot blev udført for at analysere CIP2A ekspression. (B): BEAS-2B-celler blev behandlet med NNK ved angivne koncentrationer for angivne tidspunkter, og western blot blev udført for at analysere CIP2A ekspression. 0,05% og 0,1% DMSO blev anvendt som opløsningsmiddel kontrol svarende til 5 μΜ og 10 μΜ NNK henholdsvis.

CIP2A er nødvendig for vækst lunge- kræftceller og transformation

CIP2A specifikt siRNA blev anvendt til at evaluere sine roller i lungekræft patogenese, og resultaterne viste, at sammenlignet med negativ kontrol (NC), CIP2A silencing (figur 3A) førte til inhibering af klonogen aktivitet af A549-celler, påvises ved foci-dannelse ( Figur 3, B og C) og blød agar-kolonidannelse (figur 3, D og E) assays [3]. Disse fænomener blev bekræftet af resultaterne af CIP2A dæmpende i L78 celler (Figur S1, A til E). Derefter blev A549-celler transficeret med NC eller CIP2A-specifik siRNA (figur 3F), og injiceret subkutant i højre og venstre flanker af 8 nøgne mus henholdsvis og tumorvolumener blev anslået hver to dage [12]. Interessant CIP2A-specifikke siRNA signifikant inhiberede tumorvækst i sammenligning med NC-siRNA (figur 3, G gennem I). Tilsammen indikerer disse data, at CIP2A er afgørende for lungekræft spredning og tumorigenese, og kunne være et effektivt terapeutisk mål

(A):. Western blot-analyse af CIP2A proteinekspression i A549-celler 72 timer efter transfektion med negativ kontrol (NC) eller CIP2A-specifik siRNA. (B og C): Flad plade klon formation assay til klonogene aktivitet af A549-celler 72 timer efter transfektion med NC eller CIP2A-specifik siRNA. (B): repræsentativ lette miscroscopy billeder. (C): Kvantificering af foci tælling. Vist er middelværdi + SD af fire uafhængige forsøg. (D og E): Soft-kolonidannelse assay for A549-celler transficeret med NC eller CIP2A-specifik siRNA. (D): repræsentativ lette miscroscopy billeder. (E): Kvantificering af foci tælling. (F): Western blot-analyse af CIP2A protein i A549-celler transficeret med NC eller CIP2A-specifik siRNA i 72 timer. (G): Nøgne mus injiceret subkutant med A549-celler transficeret med NC eller CIP2A-specifik siRNA. (H): Tumor vækstkurve for eksperimentet vist i (G). Vist er middelværdi + SD af de gennemsnitlige tumor mængder. (I) Billede af xenotransplantattumorer opnået fra mus, der er vist i (G). * P 0,01, Students t-test

Rabdocoetsin B er en CIP2A målretning naturligt stof

Vores centrale mål var at identificere nye lægemiddelkandidater og give blyforbindelser for lægemiddeludvikling.. Vi screenet for CIP2A målretning små molekyler ved at analysere deres virkninger på CIP2A udtryk, og identificeret en naturligt stof udvundet fra en kinesisk medicinsk urte Rabdosia coetsa, rabdocoetsin B [13], [14] (figur 4A), kunne nedregulere CIP2A på proteinniveau ved 5 til 20 uM i A549-celler (figur 4B). I H1975 celler, Rabdocoetsin B udløste også nedregulering af CIP2A på 5 til 10 pM (figur 4C). Vi analyserede mekanismen for CIP2A nedregulering forårsaget af Rabdocoetsin B, og fandt, at rabdocoetsin B signifikant inhiberede transkription af CIP2A på en dosis-afhængig måde (figur 4D) vurderet ved real-time RT-PCR.

(A): Strukturen af ​​rabdocoetsin B. (B): A549-celler blev behandlet med rabdocoetsin B (RdB) ved forskellige koncentrationer i 48 timer. Western blots blev anvendt til at detektere ekspressionen af ​​CIP2A protein (øvre felt) og CIP2A proteinekspression blev kvantificeret og normaliseret mod β-actin-ekspression (nedre panel) (C): H1975-celler blev behandlet med rabdocoetsin B i forskellige koncentrationer i 24 timer. Western blots blev anvendt til at detektere ekspressionen af ​​CIP2A protein (øvre felt) og CIP2A proteinekspression blev kvantificeret og normaliseret mod β-actin-ekspression (nedre panel) (D): A549-celler blev behandlet med rabdocoetsin B i forskellige koncentrationer i 48 timer, og mRNA ekspressionen af ​​

CIP2A

blev analyseret ved hjælp af real-time RT-PCR.

Rabdocoetsin B hæmmer CIP2A-moduleret phosphoryleret Akt

i levercellecancer celler, CIP2A opregulerer phospho-Akt (Pakt) og nedsætter Akt-relateret PP2A aktivitet, hvorimod silencing CIP2A re-aktiverer PP2A [15]. Da Akt er konstitutivt aktiv i lunge kræftceller og fremmer cellulær overlevelse og modstandsdygtighed over for kemoterapi og stråling [16], [17] undersøgte vi effekten af ​​CIP2A på Pakt i lungekræft. Vi viste, at CIP2A silencing ved specifik siRNA resulterede i nedregulering af Pakt men ikke Perk, PCNA, β-catenin, EGFR eller Src (figur 5A). Vi undersøgte dernæst, om rabdocoetsin B kunne modulere ekspressionen af ​​Pakt, og fandt, at behandling med rabdocoetsin B ved 5 til 10 pM også nedreguleret Pakt i A549 (figur 5B) og H1975 (figur 5C) celler. Vi yderligere viste, at i H1975 celler efter rabdocoetsin B ved 10 uM blev CIP2A markant nedreguleret i 6 til 12 timer og blev upåviselig i 48 timer (figur 5D), mens Pakt blev reduceret i 18 timer (figur 5D). Disse resultater blev bekræftet i A549-celler behandlet med rabdocoetsin B (figur 5E), hvilket indikerer, at denne forbindelse kan inhibere CIP2A-Akt pathway i lungekræft

(A):. A549-celler blev transficeret med NC eller CIP2A- specifikke siRNA i 72 timer, og ekspressionen af ​​angivne proteiner blev påvist under anvendelse af Western blots. (B og C): A549 (B) og H1975-celler (C) blev behandlet med rabdocoetsin B (RdB) ved angivne koncentrationer i 48 og 24 timer henholdsvis og Western blots blev udført for at analysere ekspression af proteiner angivet. (D og E): H1975 (D) og A549 (E) celler blev behandlet med rabdocoetsin B (RdB) for angivne tidspunkter, og Western blot-analyse blev udført med antistoffer specifikke for de angivne proteiner. β-actin anvendes som lastning kontrol.

Virkninger af Rabdocoetsin B på lungecancerceller

Vi evaluerede virkningerne af rabdocoetsin B på lungecancerceller udtrykker wide-type (WT ) eller mutant EGFR. Vi viste, at rabdocoetsin B udviste signifikante cytotoksiske virkninger på A549, NCI-H1975, HCC827, SPC-A-1, GLC-82, L78 og 95D lung cancer cellelinjer (figur 6, A og B). Rabdocoetsin B induceret apoptose af A549-celler (figur 6C) med aktivering af Casp-8 og casp-9 og spaltning af PARP (Fig 6D). Rabdocoetsin B forårsagede også aktivering af Casp-8 og Casp-9 og spaltning af PARP i NCI-H1975 celler (Figur 6E). Disse resultater indikerer, at rabdocoetsin B inhiberer proliferation og inducerer apoptose af lungecancerceller via aktivering af endogene og exogene apoptoseveje

(A):. Lungecancer-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af Rabdocoetsin B (RdB) (fra 1 pM til 10 uM) og cellelevedygtighed blev målt 48 timer ved MTT-assayet. (B): IC50 for celler behandlet med rabdocoetsin B. (C): Rabdocoetsin B inducerer apoptose af A549-celler, analyseret ved flowcytometri. (D og E): Western blots blev udført for at påvise ekspressionen af ​​apoptose regulatorer i A549 (D) og H1975 celler (E)

Diskussion

CIP2A er en automatisk. antigen [7], der er overudtrykt i humane neoplasmer [3] – [7], [18] – [21]. Peng [22] viste, at i amerikansk-baserede patienter, er CIP2A steget i 61 af de 72 (84,7%) lungekræft vævsprøver, hvilket er betydeligt højere end hos normale lungevæv (14,3%, 9/63). For nylig, Dong et al [23] rapporterede, at i 29 patienter fra det nordlige Kina,

CIP2A

er overudtrykt på mRNA niveau i 24 tilfælde (82,7%) i tumor prøver sammenlignet med deres tilsvarende normale væv; CIP2A protein (detekteret ved immunohistokemi) viser sig at være overudtrykt i 72,2% af 90 lungekræft prøver og korreleres med ringe overlevelse. Vi tester CIP2A ekspression i 60 patienter fra det sydlige Kina [8], og rapporterer, at CIP2A drastisk forøges i 63,3% (detekteret ved western blotting) eller 67,2% (ved mRNA-niveau) i tumorprøver forhold til tilstødende normale væv (figur 1) .

Vi viser for første gang, at CIP2A overekspression er forbundet med cigaretrygning. I 60 lungekræftpatienter undersøgt i denne undersøgelse, 28 af 36 (77,8%) smoker patienter viser øget ekspression af CIP2A i tumorprøverne i forhold til deres hosliggende normale prøver, hvorimod 10 af 24 (41,7%) røgfrie tilfælde udviser opreguleret CIP2A på proteinniveau (p = 0,004) (tabel 1). I øjeblikket rygning fortsætter med at være mere udbredt blandt mænd (63%) end kvinder (3,8%) [24]. Vi rapporterer her, at CIP2A er overudtrykt i 30/40 (75%) og 8/20 (40%) hos mænd og kvinder patienter (p = 0,008) (tabel 1), henholdsvis. Vi finder også, at CIP2A er forhøjet i 17/19 (89,5%) patienter med planocellulært karcinom, mens 17/35 (48,6%) patienter med adenocarcinom har overudtrykt CIP2A (p = 0,003) (Tabel 1). Den multivariat logistisk regressionsanalyse viser tydeligt, at rygning er den eneste væsentlige variabel er forbundet med CIP2A overekspression i lungekræft i vores indstilling (p = 0,008) (Tabel 2). Mens den samlede rygning sats i det nordlige og nordøstlige sektorer er højere end i den sydlige og østlige del af Kina, forekomsten af ​​tobaksrøg eksponering blandt ikke-rygere i det nordlige Kina er betydeligt højere end hos ikke-rygere i det sydlige Kina [24], [ ,,,0],25]. Disse kan bidrage til forskellen i CIP2A udtryk mellem patienter i vores indstilling og Dong rapport [23]. Tobaksrøg som forårsager 5-6 millioner dødsfald om året, og 31% og 6% af alle lungekræft dødsfald i midaldrende mænd og kvinder henholdsvis [26], kan fremkalde genetiske og epigenetiske ændringer og reducere DNA-reparation kapacitet [2]. Zhao et al [27] for nylig viste, at i humane gastrisk cellelinjer,

Helicobacter pylori

infektion kan fremkalde CIP2A udtryk via bakteriel oncoprotein CagA-forårsagede aktivering af Src og MEK /ERK signalveje. Selvom NNK (0,1 til 50 uM) undlader at opregulere CIP2A i HBEpiC og BEAS-2B celler i op til 18 dage i vores undersøgelse (figur 2), kan vi ikke udelukke, at NNK kan forstyrre udtryk for oncoproteinet i en længere eksponeringstid naturligvis og denne hypotese berettiger yderligere undersøgelse.

CIP2A er kritisk for lungekræft cellevækst, da CIP2A knockdown af specifikke siRNA resulterer i signifikant inhibering af celleproliferation og transformation in vitro og in vivo (figur 3 og Figur S1). Disse data indikerer, at CIP2A kunne være et attraktivt mål for nye anti-lunge cancer medicin. Interessant, vi identificere en naturlig forbindelse rabdocoetsin B, kan nedregulere CIP2A protein i lungecancerceller (Figur 4, A til C) ved at hæmme dets ekspression på mRNA-niveau (figur 4D). Undersøgelser viser, at CIP2A kan opregulere Pakt [15], og vores resultater bekræfter, at CIP2A lyddæmpning kan falde Pakt (figur 5A). Vi viser desuden, at rabdocoetsin B også hæmmer Pakt (figur 5, B til E). Rabdocoetsin B inhiberer væksten og inducerer apoptose af en række lunge- cancerceller (figur 6, A til E). Vores data giver således en ledende stof til CIP2A-targeting anti-tumor lægemidler.

Materialer og metoder

Patientprøver

Brug af prøverne blev godkendt af Institutional Review Board af Institut for Zoologi, Chinese Academy of Sciences og The Cancer Hospital, Sun Yat-Sen University. Alt tumor og tilstødende normale vævsprøver blev opnået med skriftligt informeret samtykke fra patienterne på Cancer Hospital, Sun Yat-Sen University. For RT-PCR-analyse blev vævsprøver formalet i flydende nitrogen-afkølet mørtel, RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol (Invitrogen), og RT-PCR-forsøg blev udført ved anvendelse PrimeScript® One Step RT-PCR Kit Ver.2 (Takara) ifølge til fabrikantens protokol. Sekvenserne af primere anvendt til

CIP2A

er som følger: fremadrettet 5′-CCATATGCTCACTCAGATGATGT-3 ‘, _ bagudrettet 5′-GTGTATCATCTCCACAGAGAGTT-3’ [5]

Til Western blot-assay, væv. prøver blev formalet i flydende nitrogen-afkølet mørtel, blev vævet pulver suspenderet i lysisbuffer (50 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 1 mM na

3VO

4, 1 mM NaF, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, komplet proteaseinhibitorcocktail) og klaret ved centrifugering. Lige store mængder prøver blev separeret ved SDS-PAGE, overført til nitrocellulose og immunblottet med anti-CIP2A eller anti-β-actin-antistof.

Immunhistokemisk analyse og scoring af immunreaktivitet blev udført som beskrevet [28]. Formalinfikserede, paraffinindlejrede lungekræft vævsprøver (5 um) blev afparaffiniseret og underkastes en varmeinduceret epitopgenfinding trin i 2 minutter. H

2O

2 (3%) blev anvendt til at blokere endogen peroxidaseaktivitet i 10 min. Snittene blev derefter vasket med PBS. Kanin polyklonalt anti-CIP2A antistof blev anvendt til objektglassene ved en fortynding på 1:500 ved 4 ° C natten over. Påvisning blev opnået med Immunhistokemi kit (pv-6001) (Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd, Beijing, Kina) ifølge fabrikantens protokol. Snit blev farvet med 3, 3′-diaminobenzidin (DAB) og modfarvet med hematoxylin, dehydreret, behandlet med xylen og monteret. CIP2A protein niveauer blev scoret som beskrevet [29].

Agenter

Rabdocoetsin B blev ekstraheret fra Rabdosia coetsa af professor Han-Dong Sun. 3- (4, 5) -dimethylthiahiazo (-z-y1) -3, 5-di phenytetrazoliumromide (MTT) blev indkøbt fra Amresco, Inc. (Solon, OH). PE Annexin V-7AAD Apoptose Detektion Kit blev opnået fra BD Biosciences (San Jose, CA, USA)

Antistoffer Salg

Antistofferne anvendt i denne undersøgelse var som følger:. Anti-β-Actin (Sigma); anti-casp-9 (C9), anti-Casp-8 (1C12); anti-PARP, anti-phospho-p44 /42 MAPK, anti-EGFR, anti-Src og anti-β-catenin (cellesignalering), anti-CIP2A (2G10-3B5), anti-Pakt og ATK (Santa Cruz Biotechnology) ; anti-ERK2 (Abcam); anti-PCNA (Abmart); anti-kanin eller anti-muse HRP-konjugeret sekundært antistof (Pierce); Kanin polyklonalt anti-CIP2A (Novus Biologicals, Inc.). Detektion blev udført ved anvendelse af et kemiluminescerende Western detektion kit (Cell Signaling).

Cellekultur

lungekræft linjer NCI-H1975 og A549 og humane embryoniske nyre HEK-293-celler blev opnået fra amerikansk Tissue Culture Collection (ATCC) og humane embryonale lunge fibroblast MRC-5-celler blev købt fra Cell Resource center, Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing). Normale humane bronchieepithelceller (HBEpiC, Katalognummer: 3210) blev købt fra ScienCell (ScienCell Research Laboratories, San Diego, Californien). Menneskelig lunge pladecarcinom cellelinjer L78 og yderst metastatiske store celle lungekræft-cellelinjer 95D blev opnået fra cellen bank kinesiske videnskabsakademi (Shanghai), og humane embryonale lunge fibroblast HLF celler blev købt fra Kenqiang Instrument Co., Ltd ( Shanghai, Kina). BEAS-2B bronchiale epitelceller blev leveret af professor Hongbin Ji ved Shanghai Institute for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. A549, HLF og BEAS-2B-celler blev dyrket i Dulbecco modificeret Eagle medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; Gibco /BRL, Grand Island, NY), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin. HBEpiC celler blev dyrket i et serumfrit bronchieepithelceller Cell Medium (BECM, katalog nr. 3211, ScienCell Research Laboratories) indeholdende essentielle og ikke-essentielle aminosyrer, vitaminer, hormoner, vækstfaktorer og spormineraler. L78, 95D og NCI-H1975-celler blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Gibco /BRL, Grand Island, NY), 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin. MRC-5-celler blev dyrket i MEM /EBSS medium suppleret med ikke-essentielle aminosyrer, 10% føtalt bovint serum. (FBS; Gibco /BRL, Grand Island, NY), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin

Vurdering af celledeling og apoptose

Celler blev behandlet med Rabdocoetsin B for målte koncentration og tidspunkter. Celleproliferation blev bestemt under anvendelse MTT assay. Cellelevedygtighed blev beregnet ved trypanblåt-udelukkelse. Eksternalisering af phosphatidylserin blev testet under anvendelse af et PE Annexin V-7 AAD Apoptosis Detection kit (BD Biosciences, San Jose, CA) ifølge producentens instruktioner.

Kvantitativ realtids-PCR

Kvantitativ rea- time PCR blev udført i CFX

TM96 Real Time System (Bio-Rad) ved hjælp SYBR® Premix Ex Taq ™ (Perfect Real Time) (Takara Code: DRR041) i henhold til producentens anvisninger. Primere til CIP2A og Actin var som følger: CIP2A: fremad sekvens, 5′-TGCGGCACTTGGAGGTAATTTC-3 ‘, revers sekvens, 5′-AGCTCTACAAGGCAACTCAAGC-3′; Actin: forward sekvens, 5’-ATCGTCCACCGCAAATGCTTCTA-3 ‘, revers sekvens, 5′-AGCCATGCCAATCTCATCTTGTT-3’. Niveauer af CIP2A mRNA blev udtrykt som forholdet versus actin baseret på CT-værdier.

siRNA assays

Brug HiPerFect transfektionsreagens (Qiagen, Crawley, UK) ifølge producentens protokol, celler blev transficeret med 100 nm dobbeltstrengede siRNA oligonukleotider [3]. SiRNA-sekvenser var 5′-CUGUGGUUGUGUUUGCACUTT-3 ‘(CIP2A siRNA1), 5′-ACCAUUGAUAUCCUUAGAATT-3′ (CIP2A siRNA2) [3], og 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘(negativ kontrol (NC) siRNA).

Klonogen assay

For foci dannelse, A549 eller L78 celler transficeret med negativ kontrol eller CIP2A-specifikke siRNA blev podet i tre eksemplarer på 35 mm plader (300 celler per plade). Efter 14 dages dyrkning blev celler farvet med Giemsa og kloner indeholdende mere end 50 celler blev talt. For blød-agar-kolonidannelse assayet blev celler suspenderet i 1 ml DMEM (for A549-celler) eller RPMI 1640 (for L78 celler) indeholdende 0,3% lavt-smeltepunkt agarose (Amresco, Solon, OH) og 10% FBS og udpladet på et bundlag indeholdende 0,6% agarose i 35 mm plat (1.000 celler /plade) i tre eksemplarer. Efter 2-3 ugers dyrkning blev plader farvet med Giemsa og kolonier blev talt under anvendelse af et lysmikroskop.

murine modeller

Alle dyreforsøg blev udført i henhold til protokoller, der er godkendt af Det Dyreetiske Komité Institut for Zoologi, kinesiske videnskabsakademi, med godkendelse ID AEC2010070202. Alle anvendte mus i denne undersøgelse blev avlet og opretholdt i et specifikt patogen-frit miljø. Nøgne mus (n = 8) blev injiceret subkutant med A549-celler (4 × 10

6) transficeret med NC eller CIP2A-specifikke siRNA i højre og venstre flanker henholdsvis og tumor blev beregnet som beskrevet [12].

Statistisk analyse

Forskelle mellem datagrupper blev evalueret for signifikans ved hjælp af Student

t

-test af uparrede data, χ

2 test eller envejs variansanalyse og Bonferroni indlæg -prøve. Tumorvolumenet blev analyseret med en-vejs ANOVA og uafhængige prøve

t

test ved hjælp af softwaren SPSS 12.0 for Windows (Chicago, IL). Sammenhængen mellem CIP2A høj ekspression og klinisk-patologisk funktion blev vurderet ved hjælp af enten χ

2 test eller Fisher eksakt test, og en baglæns trinvis multivariat logistisk regressionsanalyse blev udført for at undersøge de væsentligste variabler i relation til CIP2A overekspression efter justering . P-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange, og dataene blev præsenteret som gennemsnit ± SD med mindre andet er angivet.

Støtte Information

Figur S1.

Virkningerne af CIP2A udtømning på vækst og trasnsformation de L78 cellernes. (A): Western blot-analyse af CIP2A proteinekspression i L78 celler 72 timer efter transfektion med NC eller CIP2A-specifik siRNA. (B og C): Flad plade klon formation assay for klonogenisk aktivitet af L78 celler 72 timer efter transfektion med NC eller CIP2A-specifik siRNA. (B): Repræsentative lysmikroskopi billeder. (C): Kvantificering af foci tælling. Vist er middelværdi + SD af tre uafhængige forsøg. (D og E): Soft-kolonidannelse assayet af L78 celler transficeret med NC eller CIP2A-specifik siRNA. (D): Repræsentative lysmikroskopi billeder. (E): Kvantificering af foci optælling

doi:. 10,1371 /journal.pone.0020159.s001

(TIF)

Tak

Vi takker professorerne Zhu Chen, Sai- Juan Chen og Zhen-Yi Wang ved Shanghai Institute of Hematology for deres langsigtede støtte. Forfatterne takker professor Jukka Westermarck ved University of Turku, Finland for at levere pcDNA3.1-CIP2A konstruktion, og professor Hongbin Ji ved Shanghai Institute for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences for at levere de BEAS-2B celler.