PLoS ONE: Mitostatin nedreguleres i Human prostatakræft og Undertrykker invasiv Fænotype af prostatakræft celler

Abstrakt

MITOSTATIN

, en roman formodet tumorsuppressorgen induceret ved decorin overekspression, er udtrykt i de fleste normale humane væv, men er markant nedreguleret i fremskredne stadier af mamma og blære karcinomer . Mitostatin påvirker negativt cellevækst, inducerer celledød og regulerer udtrykket og aktivering niveauer af Hsp27. I denne undersøgelse har vi påvist, at ektopisk ekspression af Mitostatin i PC3, ikke DU145, og LNCaP-prostatacancerceller kun inducerede en signifikant reduktion i cellevækst, men også inhiberede migration og invasion. Desuden Mitostatin inhiberede kolonidannelse i blød-agar af PC3 og LNCaP-celler samt tumorgenicitet af LNCaP-celler i nøgne mus. Omvendt målretning endogen Mitostatin af siRNA og anti-sense strategier i PC3 og DU145 prostatacancerceller forbedret den maligne fænotype i begge cellelinier. Efter aftale af disse anti-onkogene roller, opdagede vi, at Mitostatin var fraværende i ~35% (

n

= 124) af prostata tumor prøver og dens samlede reduktion var forbundet med fremskreden kræft stadier. Kollektivt, vores resultater viser, at

MITOSTATIN

kan fungerer som et tumorsuppressorgen i prostatakræft og tilvejebringe et nyt cellulær og molekylær mekanisme, der skal udnyttes yderligere og afkodet i vores forståelse af prostatakræft progression.

Henvisning: Fassan M, D’Arca D, Letko J, Vecchione A, Gardiman MP, McCue P, et al. (2011) Mitostatin nedreguleres i Human prostatakræft og Undertrykker invasiv Fænotype af prostatacancerceller. PLoS ONE 6 (5): e19771. doi: 10,1371 /journal.pone.0019771

Redaktør: Hava Karsenty Avraham, Beth Israel Deaconess Medical Center, USA

Modtaget: 31 Januar 2011; Accepteret: April 4, 2011; Udgivet: 6. maj 2011

Copyright: © 2011 Fassan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af Sidney Kimmel Foundation for Cancer Research, Benjamin Perkins blærekræft Fund og Martin Greitzer Fund (til RB), National Institutes of Health giver RO1 CA39481, RO1 CA47282 og RO1 CA120975 (til RVI), RO1 DK068419 (til AM). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer er den vigtigste årsag til kræft dødsfald hos mænd i de fleste udviklede lande, og den mest almindelige malignitet i amerikanske mænd. I USA, vil man over otte mænd udvikler prostatakræft løbet af sit liv og over 27.360 mænd forventes at dø af sygdommen i år [1].

Molekylær genetik undersøgelser af prostatakræft har identificeret mutationer, sletninger eller tab af tumorsuppressorgener ekspression i undergrupper af patienter med prostatacancer [2]. Men på grund af heterogenitet prostatakræft selv og omdrejningspunktet natur onkogen /tumorsuppressorgen ændringer, rolle af disse gener i prostatakræft debut og den diagnostiske og /eller prognostisk værdi af sådanne gener ændringer fortsat usikkert, [2].

Tab af heterozygositet (LOH) påpeger tilstedeværelsen af ​​suppressor gener ved specifikke kromosomale regioner i tumorer. Flere allelotyping studier rapporterede telomeriske del af kromosom 12, der skal slettes i en række solide tumorer [3] -. [11], herunder prostatakræft [12]

MITOSTATIN

er en roman formodet tumorsuppressorgen lokaliseret ved 12q24.1 [13] – [15] for nylig karakteriseret i vores laboratorium [13]. Vi har tidligere vist, at denne decorin-induceret 62-kDa protein udtrykkes i de fleste humane væv; den påvirker prostatakræft cellevækst og celledød ved at regulere niveauet og aktivering af Hsp27 [13]. Vi har også analyseret ved immunhistokemi ekspressionen af ​​Mitostatin i en serie af primære blære og brysttumorer, og observerede en reduktion af Mitostatin proteinniveauer i fremskredne tumor stadier. Desuden har Kim og kolleger for nylig identificeret en rammeskift mutation af

MITOSTATIN

gen i en gastrisk carcinom med mikrosatellit ustabilitet [14].

Selvom den biologiske funktion af Mitostatin i prostatacancere er ikke endnu karakteriseret, at dets forhold decorin og Hsp27 foreslår en rolle for Mitostatin i udviklingen af ​​kræft. For at undersøge tumorsuppressorfunktion af Mitostatin i prostatacancer, vi overeksprimeres og depleteret endogent Mitostatin protein ved antisense og siRNA strategier i prostata cancer-afledte cellelinjer.

I denne undersøgelse, giver vi de første beviser for en rolle Mitostatin til inhibering af cellemigration, invasion og tumorgenicitet af prostatacancerceller. Desuden vores data viser, at Mitostatin nedreguleres i fremskredent stadium menneskelig prostatakræft. Således kunne Mitostatin fungere som en klassisk tumorsuppressorgen og analyse af dens udtryk kan vise sig et nyttigt klinisk markør for diagnose og prognose i denne fælles human cancer.

Resultater

Mitostatin overekspression i prostatacancerceller Hæmmer Colony Formation

Som en indledende tilgang til at etablere Mitostatin udtryk i prostata vi udnyttet celleekstrakter fra fjorten forskellige prostata-afledte celler, herunder både normale og maligne prostata celler. Brug immunoblotting med en Mitostatin-specifikt antistof [13], opdagede vi, at alle cellelinjer analyseret, men en (

dvs.

:. 1542CP

3TX), udtrykt Mitostatin protein på forskellige niveauer (figur 1A). Især LNCaP-celler udviste den højeste ekspression og 1532CP

2TX viste en knapt-påviselige niveauer af endogen Mitostatin (figur 1A). Notatet 1542NPTX celler, som udtrykker Mitostatin, er de “normale” modstykker i Mitostatin-negative maligne 1542CP

3TX celler

A:. Western blot-analyse: Mitostatin udtrykkes differentielt i human prostatacancer celle linjer. Protein loading blev bekræftet ved Fornyet probing membranen med antistof til p-actin. B: Western blots viser ekspressionen af ​​Mitostatin i PC3, DU145 og LNCaP cellelinjer brugt i dette studie

Næste, vi fokuseret på at undersøge den biologiske funktion af Mitostatin i prostata kræftceller ved stabilt transfektion PC3. og LNCaP-celler med en V5-tagged Mitostatin cDNA ekspressionskonstrukt og PC3 og DU145 celler med et anti-sense cDNA konstrukt. Vi placerede også Mitostatin kodende sekvens i en selvstændig inaktivere retroviral vektor under kontrol af en inducerbar Drosophila HPS70 promotor at inficere DU145 celler. Vi opnåede fem kloner stabilt overudtrykker Mitostatin (PC3 B2, DU145 Mitostatin, LNCaP B1A, LNCaP B3A og LNCaP A3A) og to kloner, som viste nedsatte niveauer af endogent Mitostatin protein (PC3 M2 og DU145 M2) (figur 1B). I tre uafhængige kolonidannelse assays udviste alle Mitostatin-overekspression cellelinier et fald i antallet og størrelsen af ​​kolonier efter 15 dage (figur 2 A-C) sammenlignet med enten den parentale eller V5-transficerede celler. DU145 Mitostatin, som også klonen med den højeste ekspression af Mitostatin sammenlignet med parental celle ekspression (4,2 gange stigning, CFR figur 1 B), viste den højeste inhibering af kolonidannelse (fig 2 B). Af interesse, celler, der udtrykker en Mitostatin antisense-konstruktion udviste enten en tilsvarende (DU145 M2, figur 2 B) eller højere (PC3 M2, figur 2A) antal kolonier i sammenligning med de parentale eller mock-transficerede celler.

Mitostatin overekspression i prostata cancer afledt cellelinjer [PC3, A; DU145, B; og LNCaP, C] nedsat evnen til at danne kolonier efter 15 dage, mens celler med depletion af endogent Mitostatin protein viste en lignende (DU145 M2) eller højere (PC3 M2) antal kolonier sammenlignet med parentale celler. Kolonner, gennemsnit pr fad fra tredobbeltforsøg;

barer

, SEM. *

P

0,05; **

P

. 0,01

Mitostatin Over-udtryk Hæmmer Migration af prostatacancerceller

Det er velkendt, at decorin og Hsp27 er involveret i celle migration. Førstnævnte har vist sig at udøve en antimigrationsvirkning virkning i forskellige cellelinjer involverer forskellige signalveje [16] – [19], mens sidstnævnte er involveret i actin reorganisering når celler danner lamellipodia [20]. Da vi tidligere har opdaget Mitostatin i decorin-over-udtrykkende celler og viste, at Mitostatin inhiberer ekspression og phosphorylering af Hsp27 i prostata cancercellelinier [13], søgte vi at bestemme, om Mitostatin kan regulere cellemigrering i prostatacancerceller. Derfor gennemførte vi

in vitro

migration assays ved anvendelse af de forskellige Mitostatin-overekspression eller Mitostatin-udtømte prostatacancerceller. I alle testede cellelinje, Mitostatin overekspression inhiberede cellers evne til at migrere (figur 3A) indikerer, at Mitostatin negativt regulerer migration af prostatacancerceller. I Mitostatin-over-udtrykkende LNCaP-kloner den inhibitoriske virkning af Mitostatin om migration var direkte korreleret med mængden af ​​protein (

dvs.

:. LNCaP A3A klon med den højeste Mitostatin ekspression var den langsomste i migration assay). Omvendt prostatacancerceller hvor endogene Mitostatin blev nedreguleret ved enten antisense strategi (PC3 M2 og DU145 M2) eller Mitostatin siRNA (PC3 celler) viste øget celle motilitet (figur 3A).

En

B: Mitostatin over-udtrykkende kloner viste nedsat vandrende egenskaber i forhold til forældrenes celler. Migration blev vurderet gennem migration (A) og de sårheling analyser (B). Celler med nedregulering af den endogene Mitostatin protein (PC3 M2, PC3 Mitostatin shRNA, og DU145 M2) viste en øget ondartet adfærd. Data er udtrykt som procent af migration

versus

stamcellerne.

Kolonner

, repræsentative billeder af tre eksemplarer fra tre uafhængige forsøg;

barer

, SEM. *

P

0,05; **

P

. 0,01

Næste, vi bestemt evne Mitostatin at hæmme migration af prostatacancerceller ved hjælp af en

in vitro

“Sår healing “motilitet assay [21]. I modsætning til parentale celler og PC3 V5 kontrolceller (data ikke vist), PC3 B2 celler overudtrykker Mitostatin viste et væsentligt fald i migration til det blottede område, både på 4 og 8 timer efter sårdannelse (figur 3B). Vi udførte det samme eksperiment på LNCaP og DU145 celler og bemærkede, at i alle cellelinjer. Væsentlige, Mitostatin overekspression inducerede et fald i celle motilitet i forhold til forældrenes eller mocktransfekterede celler (data ikke vist).

Mitostatin Over-udtryk Hæmmer invasion og Cell Adhæsion

Købet af cancerceller af en invasiv fænotype er et kritisk trin for tumorudvikling. Matrigelcoatede filtre er almindeligt anvendt til at undersøge invasiv migration gennem en tredimensional ekstracellulære matrix [21]. Derfor udførte vi

in vitro

invasion assays evaluere evnen hos prostatacancerceller at invadere gennem matrigel i 5% serumholdigt medium. Mitostatin overekspression inhiberede cellulær invasion i alle testede (figur 4A) cellelinier. I LNCaP over-udtrykkende kloner den inhibitoriske virkning af proteinet om migration var direkte korreleret med mængden af ​​protein (LNCaP A3A havde den laveste kapacitet til at invadere). Desuden observerede vi en øget i celle invasion i PC3 M2 og DU145 M2 antisense-kloner, og PC3 Mitostatin siRNA celler

A:. Mitostatin hæmmer invasive egenskaber af prostata kræftceller. Celler med nedregulering af den endogene Mitostatin protein (PC3 M2, PC3 Mitostatin shRNA, og DU145 M2) viste en øget ondartet adfærd. B: Mitostatin overekspression påvirker celle evne til at knytte til laminin. Data er udtrykt som procent af migration

versus

stamcellerne.

Kolonner

, repræsentative billeder af tre eksemplarer fra tre uafhængige forsøg;

barer

, SEM. *

P

0,05; **

P

. 0,01

Overholdelse af ekstracellulær matrix er en iboende egenskab ved en invasiv og metastatisk fænotype og migrerende celler danner forbigående vedhæftede filer til den ekstracellulære matrix. Navnlig laminin-1 er hovedkomponenten af ​​Matrigel. Derfor udførte vi adhæsionsassays og udpladet de forskellige Mitostatin-overudtrykkende eller Mitostatin-depleterede prostatacancerceller på laminin-overtrukne plader. Cellerne fik lov at klæbe til laminin i 2 timer, og antallet af vedhæftede celler blev derefter beregnet. Antallet af celler, som adhærerede til laminin signifikant lavere i celler over-udtrykkende Mitostatin sammenlignet med parentale celler i DU145 og PC3-cellelinjer (figur 4B), hvilket indikerer, at Mitostatin inhiberer celleadhæsion til laminin. Efter aftale med denne konklusion, viste Mitostatin-udtømte PC3 celler en øget evne til at holde sig til laminin (figur 4B). På den anden side kunne de manglende væsentlige forskelle i celleadhæsion til laminin observeret i LNCaP celler delvis forklares ved deres dokumenterede lave klæbende evne

in vitro

[22], [23].

Kollektivt tyder vore resultater, at Mitostatin ikke kun hæmmer migreringsevnen af ​​prostata cancerceller, men også evnen til at invadere en kompleks tredimensionel matrix, såsom Matrigel, og at holde sig til laminin substrater.

Mitostatin Over-udtryk Hæmmer Anchorage-uafhængig vækst og tumorigenicitet

for yderligere at undersøge den hypotese, at Mitostatin kan spille en direkte rolle i prostata carcinogenese, vi udførte forankringsuafhængige vækst analyser og en

in vivo

tumorigenicitet analyser i nøgne mus. PC3 B2 celler med høj Mitostatin ekspression dannede ikke kolonier, hvorimod PC3 M2 med lavt Mitostatin niveau viste øget antal kolonier (figur 5A). Endvidere størstedelen af ​​kolonier i PC-3-M2-celler var større end i kontrolceller (data ikke vist). I LNCaP celler (figur 5A-B), reduktion i antallet og dimensionen af ​​kolonierne direkte korreleret med Mitostatin ekspressionsniveauerne

A:. Data fra tredobbelte kulturer af forældrenes PC3 og LNCaP, og kloner PC3 V5, PC3 B2, PC3 M2, LNCaP V5, LNCaP B1A, LNCaP B3A, og LNCaP A3A udpladet i blød agar genererer kolonier større end 0,2 mm i diameter. Kloner over-udtrykkende Mitostatin viste en nedsat evne til at danne kolonier, mens Mitostatin nedreguleret klon, PC3 M2, viste en højere antal kolonier sammenlignet med parentale celler. Kolonier blev talt efter 21 dage. *

P

0,05; **

P

0,01 B:. Repræsentative kolonier af LNCaP parentale celler (til venstre), LNCaP B1A (midten), og LNCaP A3A (til højre) er vist efter 21 dage (forstørrelse × 200)

In vivo

forsøg viste, at xenografter afledt Mitostatin-over-udtrykkende LNCaP celler var signifikant mindre end dem induceret af LNCaP forældrenes celler og LNCaP V5 kontrol celler (figur 6A-B). Tumorer afledt fra LNCaP B1A og LNCaP B3A nåede et gennemsnit volumen 50% og 25% mindre end tumorerne afledt af parentale celler. Immunohistokemisk analyse af paraffinindlejrede tumorer og immunoblot analyser af frosne tumorxenotransplantater (figur 6C-D) viste høj Mitostatin ekspression i LNCaP B1A og LNCaP B3a xenotransplantater sammenlignet med basalt Mitostatin ekspression vist i parentale celler. Mitostatin udtryk i transfekterede celler blev yderligere bekræftet ved immunhistokemisk analyse ved hjælp af anti-V5 tag antistof (figur 6C)

A:. Xenografter fastsat af sub kutan injektion af LNCaP, LNCaP V5, LNCaP B1A og LNCaP B3a celler i atymiske (BALB /c

nu /nu

) blev dyrket i 65 dage. B: Tumorvolumen i dyr injiceret med celler overudtrykker Mitostatin blev markant nedsat sammenlignet med tumorer i dyr injiceret med kontrolceller. Grafen viser fordelingen i tumor størrelser dannet i BALB /c

nu /nu

mus gennem 65 dage. *:

P

0,05. C, D: immunhistokemisk og immunoblotanalyse af Mitostatin udtryk i LNCaP og afledte tumorxenoplantater. Immunhistokemi blev udført under anvendelse af både anti-V5 (øvre paneler) og anti-Mitostatin (lavere paneler) antistoffer. Målestok:. 50 um

Kollektivt, disse resultater viser, at Mitostatin er direkte involveret i en dosisafhængig måde at styre en af ​​de mest magtfulde

in vitro

egenskaber maligne celler , såsom forankringsuafhængig vækst, samt

in vivo

tumorigenicitet. Således Mitostatin er en vigtig negativ regulator af den transformerede fænotype i prostatacancer.

Mitostatin Ekspression Nedsat i Advanced prostatacarcinomer

Vi har for nylig vist, at Mitostatin ubikvitært udtrykkes i normale humane væv, men dens niveauer er markant svækket i fremskredne stadier af bryst og blære kræft [13]. For at undersøge Mitostatin udtryk i prostatakræft, vi evalueret af QRT-PCR-analyse 10 matchede normal-cancer prøver og ved immunhistokemi (IHC) tre væv microarrays består af 293 enheder, heriblandt 124 prostatakræft og 43 normale modstykker. Mitostatin mRNA niveauer var signifikant nedreguleret i kræft modstykke (Figur 7A;

P

= 0,029). Disse data blev yderligere bekræftet af IHC. Mitostatin blev hovedsageligt udtrykt i cytoplasmaet af basal cellelag af den normale prostata epitel (figur 7B) og en stærk positivitet blev observeret i den såkaldte prostata kirtel atrofi (Figur 7C). Alle præneoplastiske læsioner (

dvs

: PIN) viste en mild til moderat Mitostatin immunfarvning (figur 7D), mens det meste af adenocarcinom viste enten fokal farvning (figur 7E, F) eller ingen farvning overhovedet ( Figur 7G). Som forventet, muskelceller og blodkar ‘endotel viste en Mitostatin moderat positivitet. Af interesse, fem neoplastiske tilfælde havde udelukkende nukleare positivitet. I alt 44 af de 124 tumorprøver var fuldstændig negativ (~35%), 65 viste en mild til medium positivitet (52,4%), og kun 15 prøver viste stærk Mitostatin positivitet (12,1%). I univariat analyse, en nedsat Mitostatin immunhistokemisk score korreleret med tumor stadier (

P

= 0,046), pT stigning (

P

= 0,040), og tumor volumen (

P =

0,045). Ingen klinisk-patologiske parametre resulterede uafhængigt statistisk signifikant associeret til Mitostatin udtryk i den multivariate analyse. . Disse resultater yderligere bestyrker den opfattelse, at tabet af Mitostatin gennem mutationer eller protein nedbrydning kunne bidrage til prostatakræft progression så vidt som prostatakræft prøver vurderet ovenfor stammer fra fremskreden prostatacancer patienter

A: Relativ fold af Mitostatin mRNA-niveauer i normale prostata vævsprøver (N, sort), og Gleason 7 prostatakræft prøver (K, lys grå). Mitostatin viste en konsekvent nedregulering i kræft væv (

P

= 0,029). Kolonner, repræsentative billeder af tre eksemplarer; barer, SD. B-G: Immunhistokemisk påvisning af Mitostatin i human prostata. Mitostatin protein er lokaliseret i cytoplasmaet i normal (B) og atrofisk (C) prostata kirtler. Højere niveauer af Mitostatin protein blev observeret i PIN-læsioner (D) og i nogle tumorer (E). F: Foruden en svag farvning, Mitostatin blev også påvist i kerner i få tilfælde af adenocarcinom. G: Mitostatin ekspression er til stede i en atrofisk kirtel (sort pil) i modsætning til de omgivende negative neoplastiske kirtler. Målestok: 50 pm

Diskussion

Selvom prostatakræft er en af ​​de mest almindelige maligne sygdomme, meget lidt er kendt om de molekylære mekanismer, der bestemmer malign transformation af prostata epitel.. Under prostatakræft progression, tumorceller bliver mere motile og erhverve invasiv kapacitet. De fleste dødsfald fra prostatacancer ikke skyldes den primære tumor, men snarere til sekundære metastaser til fjerne organer. Af denne grund er det af afgørende betydning at undersøge de mekanismer, der driver prostatakræft invasion og metastaser. Det kromosomale region 12q har vist sig at blive slettet i en lang række solide avancerede tumorer [3] – [12], dermed antyder tilstedeværelsen, i denne region, af et eller flere tumor-suppressor gener involveret i processen med cancer progression.

Vi har tidligere identificeret Mitostatin genet, lokaliseret ved 12q24.1, ved fremgangsmåden til screening for vækststandsede gener induceret af leucin-rige proteoglycan decorin [13]. Decorin er medlem af den lille leucin-rige proteoglycan gen familie, der er for nylig blevet et fokus i flere områder af kræftforskningen [20]. Denne opløselige protein er involveret i en række cellulære processer, herunder matrixsamling, fibrillogenese, og kontrollen med celleproliferation [18], [24] – [33]. Decorin er blevet vist at inhibere migration [16] – [19], [34], invasion [18], og tumorgenicitet [19], [29], [33], [35], [36] af en bred vifte af transformerede celler. Endvidere decorin inducerer apoptose gennem aktivering af caspase-3 [36], [37]. Derfor er det plausibelt, at decorin-inducerede proteiner kunne være effektorer af tumor undertrykkende virkning af denne proteoglycan.

Vi har tidligere vist, at Mitostatin ubikvitært udtrykkes i normale humane væv. Men dens protein niveauer markant svækket i fremskredne stadier af primær brystkirtler og urothelial neoplasmer [13]. Vi endvidere vist, at Mitostatin overekspression negativt påvirker cellevækst og inducerer celledød i blære kræft cellelinjer [13], hvilket tyder på, at Mitostatin kunne opføre sig som en klassisk tumorsuppressorgen i andre former for malignitet. I den foreliggende undersøgelse anvendte vi tre udbredte prostatacarcinom-cellelinier, nemlig PC3 og DU145 kastrationsresistent celler, og LNCaP androgenafhængige celler, og anvendt transgene og immunologisk strategi til at lokalisere den funktion Mitostatin i disse celler. Vores resultater bekræftede vores forudsigelse af Mitostatin tilhører tumorsuppressorgenet familie omfang overekspression af Mitostatin inhiberede kolonidannelse, hvorimod suppression af endogen Mitostatin forårsagede de modsatte virkninger.

Cell migration og invasion er grundlæggende elementer i tumorceller metastaser . Øget cellemigration og invasion er kendetegnende for den metastatiske fænotype, og således et mål for aggressivitet, den nuværende undersøgelse giver resultater, der implicerer Mitostatin som et vigtigt protein til bestemmelse af en aggressiv cellulær fænotype. Faktisk Mitostatin overudtrykker kloner udviste et signifikant fald i motilitet og

omvendt

efter nedregulere endogen Mitostatin med enten antisense- eller siRNA strategier vi udløste det modsatte resultat. En direkte rolle Mitostatin at fremme cellulære migration er også tydeligt fra vores sårhelende undersøgelser, bekræftet i alle cellelinjer analyseret.

Vores resultater viser, at Mitostatin regulerer både cellulære motilitet og evnen hos prostatacancerceller at invadere gennem et 3D matrix via en mekanisme mangler at blive klarlagt. Mitostatin ændrede celle adhæsionsegenskaber til laminin, hvilket er det første nødvendige skridt til at invadere Matrigel membran. Denne konstatering er i overensstemmelse med den rolle, decorin spiller som en negativ regulator af celleadhæsion til laminin [19]. Andre tumorsuppressorgener er blevet vist at påvirke flere cancerceller karakteristika (migration, invasion, vækst, prædisposition for apoptotiske stimuli) handling på vigtige cellulære proteinkomplekser [38] – [40]. Således vil vores fremtidige indsats være fokuseret på at identificere Mitostatin protein partnere og på at studere de mulige kaskade signaler impliceret i Mitostatin biologi.

For at undersøge en mulig direkte rolle for Mitostatin i transformation prostata celler, vi udførte forankringsuafhængig vækst assays og en

in vivo

tumorigenicitet i nøgne mus. Begge undersøgelser bekræftede rolle Mitostatin som en negativ regulator af transformation. I begge forsøg Mitostatin udtryk korrelerede godt med aggressivitet af kræftceller.

I denne undersøgelse observerede vi en reduktion i Mitostatin udtryk på to prostata cancer-afledte cellelinier (1542CP

3TX og 1532CP

2TX ; 16,7% af cancer-afledte cellelinjer) og i ~35% af en serie af 124 prostatakræft. Af interesse, i normale prøver, den øvre epithelial prostata lag var konsekvent negative for Mitostatin epitoper, hvorimod det nedre lag viste en stærk positivitet, hvilket antyder tilstedeværelsen af ​​en anden cellulær engagement i Mitostatin ekspression. En stærk positivitet blev altid observeret i den såkaldte prostata kirtel atrofi (en fælles proces typisk, men ikke udelukkende findes i ældre patienter), mens en moderat positivitet blev observeret i alle de præneoplastiske læsioner, med et fald i den mest fremskreden prostatacancer niveauer. I primære prostata tumorer, Mitostatin nedregulering blev statistisk forbundet med avancerede tumor stadier og øget størrelse (eller direkte udstrækning) af den primære tumor ved patologisk undersøgelse (

dvs

: pT), bekræfter vores tidligere observation i bryst- og blærecancer [13]. Disse resultater antyder, at nedregulering af Mitostatin i de senere stadier af prostata tumorigenese kunne fremme udviklingen af ​​kræft. Vi fandt ikke nogen sammenhæng mellem Mitostatin udtryk og andre kliniske parametre, der anvendes til at vurdere prostatakræft dårlig prognose, såsom Gleason kvalitet, selvom dette punkt mangler at blive undersøgt i en større række sager.

Som konklusion denne undersøgelse giver den første bevis på, at Mitostatin kunne spille en væsentlig rolle som tumorsuppressor i prostata tumor udvikling og progression gennem sine hæmmende effekt på celle migration, invasion, forankringsuafhængig vækst, og

in vivo

tumorigenese. Desuden er Mitostatin niveau faldt i fremskredne stadier af primær prostatakræft. Tilsammen disse data understøtter endvidere den hypotese, at Mitostatin fungerer som en

bona fide

tumor suppressor og foreslå, at yderligere undersøgelser af Mitostatin som et nyttigt klinisk markør for diagnose og prognose i prostata tumorer berettiget.

Materialer og metoder

Cell Kultur og Generation af stabile kloner

Prostata cancer afledt cellelinjer 2220, 2221, 11609, 11610, 11611, TSUP, 1532CP

2TX, 1535CP

1TX, 1542CP

3TX, LNCaP, DU145 og PC3 og prostata immortaliserede normale afledte cellelinier 1535NPTX, og 1542NPTX blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og holdt som anbefalet. Celler blev transficeret som beskrevet tidligere [13], [41] (Data S1), og selekteret i medium suppleret med enten G418 (400 ug /ml) eller puromycin (0,75 ug /ml) i 3 uger.

Mitostatin Gene silencing

Gene silencing af human Mitostatin blev opnået ved siRNA strategier via validerede SureSilencing Mitostatin siRNA og kontrol plasmider (SuperArray Bioscience Corp, Frederick, MD). PC3-celler blev transficeret med vehikel (DEPC-behandlet vand), kontrol siRNA (krypteret), eller siRNA rettet mod Mitostatin (100 pmol /l) ved anvendelse Oligofectamine ™ reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ved at følge producentens protokoller. Fireogtyve timer efter transfektion blev PC3-celler sultet i serum-frit medium (SFM) i 12 timer og derefter blev forarbejdet og analyseret for migration og invasion som beskrevet nedenfor. Ekspressionen af ​​Mitostatin protein blev påvist ved immunoblotanalyse (figur S1).

kolonidannelse og Migration assays

Celler blev udpladet ved en densitet på 400 celler /100 mm skål. På dag 15 blev cellerne fikseret i 10% formalin [100% formaldehyd er 37%, således 3,7% er 10% formalin,

dvs.

: PBS-formaldehyd] og farvet med krystalviolet til kolonitælling [21] . Celler blev serum sultet i 24 timer. Celler (2,5 × 10

4 i 200 ul) blev derefter podet i Boyden kamre (øverste kammer) (BD BioCoat, Bedford, MA). Lavere kamre indeholdt 500 pi enten SFM eller 1% eller 5% serum. Efter 10 timer blev migrerede celler talt under mikroskop efter fiksering og farvning i Coomassie blå som beskrevet [42], [43].

Migration, Invasion og adhæsionsassays

Celler blev podet på 35-mm plader i serumholdigt medium, indtil sub-konfluens og overføres derefter til SFM. Efter 24 timer blev pladerne ridset med en tynd engangsspids at generere et sår i cellemonolaget [42]. Cellerne blev inkuberet i yderligere 72 timer i 1% eller 5% serumholdigt medium og analyseret og fotograferet med et Zeiss Axiovert 200 M celle levende mikroskop (Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY) under anvendelse af Metamorph Image Acquisition and Analysis software (Universal Imaging, Downingtown, PA) på Kimmel Cancer center konfokalmikroskopi Core Facility. Celleinvasion gennem en tredimensional ekstracellulær matrix blev bedømt ved en Matrigel invasion assay under anvendelse af BD Matrigel Invasion Chambers (BD BIOCOAT) med 8,0-um filter membraner som tidligere beskrevet [42], [43]. For adhæsionsassays, plader med 96 brønde belagt med muse laminin (BD BIOCOAT), blev inkuberet ved stuetemperatur i 1 time med 1% bovint serumalbumin (BSA) (Sigma, St. Louis, MO), for at blokere uspecifik binding. 100.000 celler /brønd blev podet tredobbelt og fik lov at adhærere i 2 timer ved 37 ° C og ikke-adhærente celler blev derefter fjernet med to vaske. Adhærerende celler blev farvet med CyQUANT NF celleproliferationsassay (Invitrogen), og absorbansen blev aflæst ved 490 nm. Baggrundsniveauer af celleadhæsion i brønde overtrukket med BSA alene blev trukket fra værdier opnået for laminin.

Anchorage-uafhængig vækst og tumorgenicitet Analyser

For blød agar assay blev celler suspenderet i 0,2% agarose i DMEM 10% FBS-medium, udplades ved en densitet på 10

3-celler i en 60 mm skål tidligere overtrukket med 0,4% agarose, og holdt ved 37C °. På dag 21, kolonier 0,2 mm i diameter, blev talt og analyseret [21]. Tumorgenicitet blev udført i det væsentlige som beskrevet [44], under protokoller godkendt af Thomas Jefferson Animal Care og brug Udvalg. Immundeficiente, blev atymiske, nøgne (BALB /c

nu /nu

) mus injiceret subkutant ind i posterior flanker med 2 x 10

6 celler i 200 pi Matrigel basalmembranmatrix (BD Biosciences). Tumorvækst blev overvåget dagligt i 65 dage.

Etik udsagn

Alle patienter, der er involveret i QRT-PCR undersøgelse gav deres skriftligt informeret samtykke.