PLoS ONE: En miRNA underskrift kemoterapi Mesenchymale Fænotype Identificerer Novel molekylære mål associeret med Advanced kræft i bugspytkirtlen

Abstrakt

I denne undersøgelse en microRNA (miRNA) undertegnelse blev identificeret i en gemcitabin resistent pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) cellelinie model (BxPC3-GZR), og denne signatur blev undersøgt yderligere i avancerede PDAC tumor prøver fra The Cancer Genome Atlas (TCGA) database. BxPC3-GZR viste en mesenchymal fænotype, udtrykte høje niveauer af CD44 og viste en meget signifikant deregulering af 17 miRNA. Baseret på relevans for kræft, en syv-miRNA signatur (MIR-100, MIR-125b, MIR-155, MIR-21, MIR-205, MIR-27b og MIR-455-3p) blev udvalgt til yderligere undersøgelser. En stærk korrelation blev observeret for seks af de syv miRNA i 43 avancerede tumorprøver sammenlignet med normale pancreas væv. For at vurdere den funktionelle relevans vi i første omgang fokuseret på miRNA-125b, som er overudtrykt i både BxPC3-GZR model og avancerede PDAC tumorprøver. Knockdown af miRNA-125b i BxPC3-GZR og Panc-1 celler forårsagede en delvis tilbageførsel af mesenkymale fænotype og forbedret respons på gemcitabin. Desuden RNA-seq data fra hver af 40 avancerede PDAC tumor prøver fra TCGA databasen indikerer en negativ korrelation mellem ekspressionen af ​​miRNA-125b og fem af seks mulige målgener (

BAP1

,

BBC3

,

NEU1

,

BCL2

,

STARD13

). Hidtil to af disse målgener,

BBC3

NEU1

, der er tumorsuppressorgener, men endnu ikke undersøgt i PDAC, synes at være funktionelle mål for MIR-125b siden knockdown af miR125b forårsagede deres opregulering. Disse miRNA og deres molekylære mål kan tjene som mål for at øge følsomheden over for kemoterapi og reducere metastatisk spredning

Henvisning:. Bera A, VenkataSubbaRao K, Manoharan MS, Hill P, Freeman JW (2014) En miRNA underskrift kemoterapi mesenchymale Fænotype Identificerer Novel molekylære mål associeret med Advanced kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 9 (9): e106343. doi: 10,1371 /journal.pone.0106343

Redaktør: Shrikant Anant, University of Kansas School of Medicine, USA

Modtaget: April 28, 2014 Accepteret: 6 jul 2014; Udgivet: 3 September, 2014

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Forfatterne bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Vi brugte data til vores analyse danner offentlige repository – The Cancer Genome Atlas (TCGA) Data Portal https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/. Det giver en platform for forskere at søge, downloade og analysere datasæt genereret af TCGA. Den indeholder kliniske oplysninger, genomiske karakterisering af data, og højt niveau sekvens analyse af tumor genomer

Finansiering:. Finansiering fra National Institutes of Health-RO1CA069122 til JWF, Merit Veterans Affairs Award 1I01BX000927 til JWF og William og Eula Owens Medical Research Foundation til JWF. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

PDAC fortsat har den værste prognose af et fast tumor. I 2013 anslås det, at mere end 45.000 nye tilfælde vil blive diagnosticeret i USA med dødelighed incidens forholdet næsten lig med en [1]. Gemcitabin er det mest almindeligt anvendte kemoterapi for kræft i bugspytkirtlen, men signifikant metaboliseres i plasma og kræver derfor høje doser kan føre til toksicitet [2]. Mange PDAC er oprindeligt resistente over for gemcitabin og lydhør dem generelt udvikle resistens under behandling [3].

Det er endnu ikke afgjort, om den kemoterapi fænotype induceres som et resultat af behandlingen, eller om der er en delpopulation af cancerceller i tumoren, som er medfødt mere resistente over for behandling. De seneste oplysninger tyder på, at de fleste solide tumorer, herunder PDAC besidder en særskilt subpopulation af kræft stamceller (CSCS). Noget tyder også, at CSCS er i sagens natur mere modstandsdygtige over for kemoterapi og udnytte deres selvfornyelse potentiale til at regenerere ny tumorvækst [4]. En tidligere undersøgelse forbinder CSCS med epitelial til mesenkymale overgang (EMT) [5].

EMT betegner en trans-differentiering program, der er påkrævet for vævsmorfogenese under forskellige cellulære udviklingsmæssige progression [6]. EMT-processen kan reguleres ved en bred vifte af cytokiner og vækstfaktorer, såsom TGF-β, hvis aktiviteter dereguleret under tumorprogression [7]. EMT induktion i cancer celler resulterer i køb af invasive og metastatiske egenskaber. Undersøgelser viser også, at EMT bidrager også til kemoresistens og at disse celler besidder CSC markører [8]. Udviklingen af ​​kemoresistens i kræftceller til lægemidler mod cancer, herunder gemcitabin kan reguleres eller medvirket til af mikro-RNA (miRNA). miRNA er små ikke-kodende RNA-molekyler (22 nucleotider), som spiller afgørende roller i transkriptionel regulering af genekspression. Udviklingen af ​​kemoresistens gennem en stigning i antallet af CSCS er blevet tilskrevet ændringer i niveauet miRNA i bugspytkirtlen og andre solide tumorer [9].

De seneste resultater viser en sammenhæng mellem miRNA, EMT fænotype, CSCS og kemoresistens [10], [11]. Undersøgelser tyder også, at miRNA spiller en rolle i reguleringen af ​​EMT-processen [3], [11]. For eksempel har miRNA blevet vist at drive EMT ved at regulere cadherin 1 og yderligere EMT relaterede molekyler [12]. MIR-200a, miR-200b og miR-200c blev nedreguleret i gemcitabin resistente bugspytkirtelkræftceller [13]. Undersøgelser viser også, at re-ekspressionen af ​​miR-200-familien af ​​miRNA op reguleret cadherin 1 og nedreguleres ZEB1 og vimentin [14]. Derudover kræftceller med en EMT fænotype, og at var resistente over for gemcitabin viste nedregulering af lad-7 medlemmer [5], [15], [16]. In vitro studier af PDAC indikerer en binding mellem EMT, invasionsevne og modstandsdygtighed over for kemoterapi og andre undersøgelser understøtter den opfattelse, at miRNA spiller en rolle i disse processer ved regulering af genekspression [3], [11].

I denne undersøgelse søgte vi at identificere en miRNA signatur for PDAC celler, der besidder kemoresistent og en mesenchymal fænotype (CRMP). Fordi patienter med fremskreden PDAC tendens til at vise en minimal reaktion på kemoterapi vi yderligere afgøres, om denne miRNA signatur kan afspejles i deres tumorvæv. Disse undersøgelser viser, at gemcitabin behandling inducerer en population af celler med CRMP in vitro, og at en miRNA signatur udvalgt til denne CRMP deles med tumorer prøver fra avancerede PDAC. Desuden denne undersøgelse var i stand til at begynde at etablere en funktionel relevans af en over udtrykte miRNA (miR-125b) fra denne signatur og potentielle tumor suppressor målgener. Denne undersøgelse danner grundlag for yderligere dissekere roller miRNA i CRMP. Disse miRNA og deres molekylære mål kan tilvejebringe nye terapeutiske strategier til at eliminere en tumor celle befolkning, der er generelt resistente over for gemcitabin og eventuelt andre kemoterapi.

Materialer og metoder

Materialer

gemcitabin købt fra LKT Laboratories, Inc (St. Paul, MN) blev opløst i steril PBS-opløsning. Revers transkription reagenser og TaqMan real-time PCR Master-blanding blev købt fra Applied Biosystems /Life Technologies (Foster City, CA). Alle andre kemikalier blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Cellelinjer

Den humane pancreas adenocarcinom cellelinie BxPC3, Capan-2, AsPC-1 og Panc-1 blev erhvervet fra ATCC og dyrket dem i DMEM medier (undtagen BxPC3) med 1% penicillin /streptomycin og 10% føtalt bovint serum (FBS) i en befugtet inkubator indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C. BxPC3 blev dyrket i RPMI-medier med 1% penicillin /streptomycin og 10% FBS. Denne PDAC cellelinje BxPC3 var forbigående udsat i fire timer hver syv dage med stigende koncentrationer (50 ng til 1,5 pg /ml) af gemcitabin i løbet af en periode på seks uger. Den resulterende gemcitabin resistent cellelinje benævnt BxPC3-GZR. Til vedligeholdelse, blev BxPC3-GZR celler udvidet i dyrkningsmedium og frosset i portioner. Til forsøg blev BxPC3-GZR celler optøet og tillades at ekspandere i kultur i to dage og derefter behandlet med gemcitabin (1,5 ug /ml) i fire timer. Gemcitabin blev fjernet og BxPC3-GZR celler blev høstet den følgende dag for forsøg, herunder kvalitetskontrol Westerns blots at vise, at den erhvervede EMT fænotype blev opretholdt.

Western blots analyser og immunfluorescensfarvning

Western blot analyse blev udført som tidligere [17] beskrevne. Primære antistoffer var som følger: E-cadherin og Neu1 fra Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA); CD44, beta-actin og PUMA (

BBC3

) blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA), vimentin fra Life Technologies (Carlsbad, CA). Peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer blev indkøbt fra Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). For immunofluorescens (IF) farvning, celler dyrket på runde dækglas i en 24-brønds plade. Fastsættelse og immunofarvning efterfulgt af opfange billeder blev udført som tidligere beskrevet [18].

Matrigel celleinvasion Assays Salg

invasive opførsel af celler blev analyseret ved Matrigel invasion assays som tidligere beskrevet [17], [18].

udtrykket profilering af miRNA

Total RNA herunder små ikke-kodende miRNA blev isoleret fra BxPC3 og BxPC3-GZR hjælp mirNeasy (Qiagen) ifølge producentens procedurer. Expression analyse af miRNA i både kontrol- BxPC3 og BxPC3-GZR celler blev udført af LC Sciences (Houston, TX) ved hjælp af en proprietær μParaflo mikrofluid biochip teknologi. Væsentlige ændringer i miRNA-ekspression blev analyseret ved t-test, som leveres af LC Sciences (Houston, TX). Kun de mest højsignifikante ændringer i både over og under udtrykte miRNA blev overvejet til yderligere analyse (tabel 1).

Reverse transskription og TaqMan kvantitativ PCR

TaqMan-gen-ekspression assays ( Life Technologies, Carlsbad, CA) blev anvendt til at kvantificere ekspressionsniveauerne af både mRNA og modne miRNA. Totalt RNA ekstraheres ved Mirvana (Life Technologies, Carlsbad, CA) RNA-isolering kit og efterfulgt af revers transkriberet i en reaktionsblanding indeholdende tilfældige hexamere primere (for mRNA RT-PCR) og MIR-specifikke hårnåle-RT-primere (for miRNA RT- PCR). Kvantitativ PCR blev udført tre gange med reaktioner indeholdende amplificerede cDNA og TaqMan-primere i Universal Master Mix uden AmpErase UNG (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) ved at følge fabrikantens protokol. Alle mRNA-data og miRNA data er udtrykt i forhold til 18S og U6 henholdsvis TaqMan PCR udført på de samme prøver, medmindre andet er angivet. Fold udtryk blev beregnet ud fra tre eksemplarer af C

T-værdier efter 2

-ΔΔC

metode T.

Stabil cellelinje generation for miR-125b knockdown

Gemcitabin resistente BxPC3-GZR og Panc-1-celler blev anvendt i mIR-125b knock down undersøgelse. System Bioscience s (SBI, Mountain View, CA) miRZipTM anti-sense miRNA stabilt udtrykt RNAi hårnåle, der hæmmer miRNA aktivitet. Den miRZip shRNAs producerer korte, enkeltstrengede anti-miRNA, der kompetitivt binder deres endogene miRNA mål og hæmmer dens funktion. De miRZip korte hairpin RNA’er klones ind SBI s pGreenPuroTM shRNA ekspressionsvektor, en forbedret tredje generation HIV-baserede ekspression Lenti-vektor. Den lentivirale vektor indeholder de genetiske elementer, der er ansvarlige for emballage, transduktion, og stabil integration af det virale konstruktionen i genomisk DNA, inducere ekspression af det anti-miRNA effektor-sekvens. Til produktion af en høj titer af viruspartikler, brugte vi ViraPowerTM Lentiviral Support Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) beskæftiger LipofectamineTM 2000 (Invitrogen) til transfektion de miRzip vektorer i HEK-293T-celler. Fordi inficerede celler, der stabilt udtrykker GFP og puromycin, samt anti-miRNA klonet i miRZipTM vektoren, anvendte vi puromycin at selektere for de inficerede celler, der huser den miRzip. Efter screening isoleret vi BxPC3-GZRΔmiR-125b eller Panc-1ΔmiR-125b celler. På lignende måde frembragte vi også Zip styring af begge cellelinier med miRZipTM vektor. Til bestemmelse lægemiddelfølsomhed blev celler behandlet med angivne koncentrationer af gemcitabin i 96 timer og MTT-assays blev udført som tidligere beskrevet [19].

miRNA og transkriptom profilering af tumor data fra The Cancer Genome Atlas (TCGA)

miRNA:

Level 3.1.1.0 miRNA sekvensdata fra TCGA data portalen blev hentet for 43 tumor prøver med en normal væv. En data matrix blev fremstillet ved at kombinere de rå læste tællinger af 1046 miRNA fra 44 [43 tumor og en normal] prøver. Baseret på den antagelse, at miRNA sekvens data følger en negativ binomialfordeling [20], [21] de læste tæller var størrelse-faktor normaliseret ved hjælp DESeq-version 1.10.1 [22] pakke i F-version 2.15.3. Normaliseret læse tæller data blev brugt til at beregne log2 gange ændring mellem tumor og normale prøver

Transkriptomet:.

Level 3.1.1.0 RNA-sekvens data fra TCGA data portalen blev hentet i 40 tumorprøver med én normalt væv som kontrol. Vi brugte RSEM software til bestemmelse mængde af udskrifter fra RNA-Seq data. RSEM øvre kvartil normaliserede læse tæller data fra 41 (40 tumorer og 1 normal) vævsprøver blev brugt til at beregne log2 gange ændring mellem tumor og normale prøver.

Statistisk analyse

Students uparrede t- test blev anvendt til at sammenligne de enkelte gruppemedlemmer midler. En p-værdi på 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle værdier i de tal og tekst blev udtrykt som middelværdi ± SD

Resultater

Generering af en bugspytkirtelkræft CRMP cellelinje model

PDAC cellelinje BxPC3 blev forbigående udsat til stigende koncentrationer af gemcitabin i løbet af en periode på seks uger. De resulterende gemcitabin resistente BxPC3-GZR celler blev sammenlignet med de parentale BxPC3 celler for forskelle i morfologi, respons på gemcitabin, ekspression af mesenchymale, epitelceller markører og CD44. Sammenligninger for morfologi viser, at de parentale BxPC3 celler voksede i tætpakkede områder og viste en flad og afrundet udseende, karakteristisk for en epitelial morfologi; henviser til, at BxPC3-GZR celler voksede som løst tilknyttede celler med en spindel-lignende morfologi karakteristisk for en mesenkymale fænotype (Fig. 1A). Følsomheden over for behandling med gemcitabin blev sammenlignet mellem BxPC3-GZR og forældrenes BxPC3 celler. BxPC3-GZR celler viste større end en dobbelt nedgang i afhængighed af gemcitabin forhold til sine parentale celler BxPC3 (fig. 1C). For at bestemme om BxPC3-GZR celler også er krydse resistente over for en anden kemoterapeutisk forbindelse, blev celler behandlet med paclitaxel og MTT-assays blev udført. Mens BxPC3-GZR celler viste mere end en dobbelt nedgang i følsomhed over for gemcitabin, viste disse celler kun et beskedent fald i følsomhed over for paclitaxel (fig. S1). Disse observationer antyder, at forskellige signalveje kan være ansvarlige for resistens mod forskellige lægemidler. En nylig undersøgelse med side population af PDAC celler med egenskaber af cancer stamceller og der blev udvalgt for resistens over for gemcitabin ikke var resistente over for 5-FU [23]. Western blot analyse af celler indsamlet ved hver uge i løbet af de seks uger med stigende gemcitabin viste, at niveauet af epitel markør E-cadherin faldt gradvist med samtidig forøgelse i niveauerne af mesenchymal markør vimentin og stamcellemarkør CD44 (fig. 1B) .

A. Morfologiske forskelle mellem forældrenes BxPC3 og kemoresistens mesenkymale BxPC3-GZR celler. B. Western blot viser, at BxPC3-GZR celler besidder en EMT fænotype, hvilket påvises ved forøget ekspression af vimentin og et fald på E-cadherin og udtrykke stamcelle markør CD44. C. MTT assay sammenligne væksten i forældrenes BxPC3 og BxPC3-GZR på 96 timer efter behandling med forskellige koncentrationer af gemcitabin. D. Western blot sammenligning af ekspressionen af ​​CD44, E-cadherin, Zeb-1 og vimentin efter fire passager af BxPC3 og BxPC3-GZR. E og F. Immunofluorescens konfokal mikroskopi billeder viser forskellen udtryk for CD44 og vimentin i BxPC3 og BxPC3-GZR celler.

Endnu vigtigere er, har vi også overvåges og sammenlignede ekspressionsniveauerne af samme proteiner af BxPC3 og BxPC3-GZR celler, hvor udvidet og bestået for efterfølgende generationer i kultur. Stabiliteten af ​​BxPC3-GZR fænotypen blev bekræftet i kortvarige kulturer med BxPC3-GZR celler, der viser en lavere E-cadherin, opregulering af vimentin ekspression og forhøjet ekspression af stamcellemarkører CD44 (Fig. 1D). Efter aftale med de Western blot data, immunfluorescens analyse viste en meget stærkere farvning af både CD44 og vimentin i BxPC3-GZR celler i forhold til forældrenes BxPC3 modstykke (fig. 1 E, F).

Identifikation af en miRNA signatur forbundet med CRMP i PDAC

Undersøgelser viser, at forskellige miRNA som miR-100, miR-21, lad-7, miR- 34a og miR – 200c spiller afgørende rolle i reguleringen af ​​tumorigenese og kemoresistens i forskellige kræftformer, herunder pancreas cancer [24] – [26]. Undersøgelser viste også en rolle for miRNA i udvikling af lægemiddelresistens i en række forskellige maligniteter [11]. Udtrykket niveau af miRNA blev sammenlignet i BxPC3 og BxPC3-GZR celler ved μParaflo mikrofluid chip miRNA profilering. Efter beregning og fjerne ikke-signifikante miRNA (i form af udtryk), blev en meget vigtig miRNA profil fastslået, at fornemme BxPC3-GZR celler fra forældrenes BxPC3 celler (fig. 2,

Tabel 1

). Denne profil viste mest betydningsfulde ni miRNA, der var op reguleret i BxPC3-GZR celler sammenlignet med BxPC3 (miR-125b, miR-155, miR-100, miR-4324, miR-21, miR-15b, miR-25, miR- 424 *, miR-99b), og otte, der blev nedreguleret (miR-1246, miR-205, miR-4443, miR-30d, miR-27b, miR-4485, miR-378 *, miR-455-3p).

A. Heat kortdata analyse af miRNA microarray-analyser, der sammenligner BxPC3 forældrenes celler og lægemiddelresistente BxPC3-GZR celler. Kun miRNA blev valgt som væsentligt over eller under udtrykt i forhold til forældrenes celler (høj fold ændringer baseret på log2 værdier og meget lave p-værdier) havde taget til yderligere validering. De statistiske værdier er repræsenteret i

Tabel 1

. B. Validering af miRNA microarray data blev gjort i otte differentielt udtrykte miRNA bruger TaqMan qPCR assay. I hver cellelinje, blev ekspressionsniveauet af indikeret miRNA sammenlignet mellem parentale BxPC3 celler og BxPC3-GZR celler. RNU43 eller U6 blev anvendt som en intern miRNA kontrol. C. TCGA dataanalyse viser, at 6 af de 7 miRNA valideret til at blive dereguleret i BxPC3-GZR celler viste også forskellen udtryk i tumor prøver fra patienter med fremskreden PDAC. Tumor prøver fra 43 patienter med fremskreden PDAC blev analyseret for miRNA-ekspression i forhold til normalt bugspytkirtlen væv.

Baseret på relevans for kræft og kemoresistens, syv af disse miRNA blev udvalgt til yderligere undersøgelse. Real Time-PCR ved hjælp TaqMan analyser blev gjort for at validere under eller over-udtrykte miRNA identificeret af miRNA arrays (Fig. 2B). Endelig identificerede vi fire af de over-udtrykte miRNA (MIR-125b, mir-155, mir-100, miR-21) og tre under udtrykte miRNA (miR-27b, mir-205, og miR-455-3p) ved miRNA mikroarrays blev valideret af Real-Time PCR (fig. 2B).

den miRNA signatur fra CRMP cellelinie model er også påvist i kliniske prøver fra patienter med fremskreden PDAC

at etablere potentialet relevansen af ​​validerede CRMP miRNA signatur med miRNA fundet i avanceret PDAC, hele transkriptom analyser (miRNA og mRNA-seq, ekspressionsniveauerne) blev udført med PDAC patientprøver data fra de TCGA datasæt. I TCGA database er der i alt 43 PDAC patienter prøver indeholdende ekspressionsniveau af miRNA med en normal pancreas væv. Fyrre af disse patienters tumor prøver havde data for både mRNA og miRNA ekspressionsniveauerne. En sammenligning af de over og under udtrykte miRNA i TCGA med dem i vores miRNA array er præsenteret i

Tabel 2

. Som vist i

tabel 2

, af de sytten miRNA omfattende miRNA afvigende dereguleret i BxPC3-GZR (9 overudtrykt og 8 under udtrykte) miRNA-data for 14 af disse var tilgængelige i TCGA analyser og for alle syv af de validerede miRNA. En yderligere sammenligning blev udført på den seks-miRNA signatur valideret fra array data, og som var der matchende data for avancerede PDAC prøver. En analyse af disse data er vist i figur 2C. Interessant var der en signifikant sammenhæng med almindelige ekspressionsniveauer af miRNA i avancerede PDAC tumor prøver med den validerede CRMP miRNA signatur til fem af de seks miRNA (Fig. 2C,

Tabel 2

). Det er vigtigt at bemærke, at MIR-125b data for tumorprøver er givet som både MIR-125b-1 og MIR-125b-2-isoformer, hvorimod vi i cellelinjer kun bestemmes MIR-125b-1 isoform (betegnet miR- 125b). Interessant nok blev forløberne for MIR-125b-1 og MIR-125b-2 isoformer vides at stamme uafhængigt fra forskellige kromosomale loci selv om deres modne sekvenser og mål er samme [27]. De mest bemærkelsesværdige miRNA løbet udtrykt i både BxPC3-GZR og kliniske prøver var miR-100, miR-21, miR-125b-1, miR-125b-2 mens miR-205, miR-27b og miR455 blev under-udtryk.

miR-125b spiller en rolle i reguleringen af ​​CRMP i PDAC

Indledende undersøgelser blev foretaget for at fastslå, om de er identificeret i BxPC3-GZR celler miRNA, og at var fælles for kliniske prøver spillet en rolle i CRMP. MIR-125b, der var almindeligt overudtrykt i både avancerede PDAC kliniske prøver og i BxPC3-GZR celler (Fig. 2) blev valgt til disse analyser. For yderligere undersøgelser, blev tre PDAC cellelinier (ASPC-1, Capan-2, Panc-1) i tillæg til BxPC3 screenet for ekspressionsniveauer af EMT markører sammen med miR-125b og miR-30d (fig. 3 A, B) . MIR-30d blev anvendt til sammenligning af differentieret udtryk af miRNA, da det viste lige udtryk niveau i både forældrenes (BxPC3) og resistente celler ved qPCR-analyse. I disse cellelinjer epitel markør E-cadherin er omvendt relateret til ekspressionen af ​​MIR-125b; henviser til, at blev den mesenkymale markør vimentin og stamcelle markør CD44 proportionalt relateret til ekspression af miR-125b (fig. 3A, B). Disse data antyder endvidere, at EMT fænotype kan reguleres delvist af den konstitutive ekspression af MIR-125b i Capan-2 og BxPC3 celler en epitelial lignende fænotype og udtrykker lave niveauer af MIR-125b; dog AsPC-1 og Panc-1-celler er mesenkymale lignende og viser højere niveauer af MIR-125b (fig. 3 A, B). Ud over at vi også har overvåget udtryk for miR-125b i BxPC3 celler ved behandling med gemcitabin. Dataene angiver, at 72 timers behandling med gemcitabin inducerede ekspressionen af ​​MIR-125b i BxPC3 celler på en dosisafhængig måde (fig. 3C). Derfor er disse resultater viser, at både kemoresistens og mesenkymale fænotyper er reguleret af den differentielle ekspression af miR-125b.

A. Western blot-analyser viser ekspressionsniveauerne af EMT markører i PDAC celler, i hvilke MIR-125b ekspression blev bestemt. B. TaqMan qPCR analyse, der viser den relative ekspression af miRNA (MIR-125b og MIR-30d) i forskellige PDAC celler. MIR-30d er anvendt som kontrol. C. Induktion af MIR-125b ekspression i BxPC3 ved behandling af gemcitabin. Kvantitativ PCR (TaqMan) blev udført efter 72 timers inkubation med lægemidlet for at overvåge ekspressionsniveauet af MIR-125b i BxPC3 celler. Dataene viser, at ekspressionen af ​​miR-125b øges ved behandling af gemcitabin i en dosisafhængig måde.

For at afgøre, om miR-125b udtryk er direkte relateret til CRMP, vi bankede ned udtrykket af miR-125b ved at bruge Zip-teknologi og stabile cellelinier genereret og analyseret for ekspression af miR-125b i både BxPC-GZR-Zip-Ctrl og i BxPC3-GZR-ΔmiR-125b celler (fig. 4A). Morfologien af ​​MIR-125b knockdown celler blev også vurderet og knockdown af MIR-125b genoprettede epitel morfologi (fig. 4A). TaqMan qPCR assay angivet en omtrentlig 80% knockdown af MIR-125b i BxPC3-GZR celler (Fig. 4B). Knockdown af anti-miR125b omvendt EMT markører som vist ved den forøgede ekspression af det epitel markør E-cadherin og reduceret ekspression af mesenchymale markør vimentin og faldt også CD44-ekspression (fig. 4C). Knockdown af miR-125b nedsat celle migration (fig. 4D, E) og delvist vendt gemcitabin modstand BxPC3-GZR celler (Fig. 4F).

A. Etablere de Lenti-virus baserede stabile celler, der udtrykker anti-miR-125b i BxPC3-GZR (Zip-kontrol og miR-125b knock-down). B. TaqMan qPCR assays viser knockdown af miR-125b i BxPC3-GZR-Zip ctrl celler i forhold til BxPC3-GZRΔmiR-125b celler. C. Ekspression af anti-miR-125b (Zip-teknologi, SBI) reducerer ekspressionen af ​​EMT og stemness markør overvåges af vestlige bolt assays. Paneler D og E viser dæmpningen af ​​celle migration ved at vælte miR-125b udtryk. Billeder blev taget efter krystalviolet farvning af migrerede celler og dataene blev plottet som en graf (Bar = 50 um). F. Knockdown af MIR-125b øger respons på gemcitabin. BxPC3-GZR-zip-Ctrl og BxPC3-GZRΔmiR-125b-celler blev behandlet med gemcitabin ved forskellige koncentrationer, og MTT-assays blev udført efter 96 timers behandling. G. Knockdown af miR-125b i Panc-1 celler. Lenti-virusbaserede stabile celler blev genereret at inhibere MIR-125b ekspression (Zip teknologi,). TaqMan qPCR analyser blev udført for at måle ekspressionen af ​​miR-125b i Zip-kontrol Panc-1 celler og banke ned celler (Panc-1 ΔmiR-125b). H. Inhibiting MIR-125b aftager CD44 og vimentin ekspression mens op regulering af ekspressionen af ​​E-cadherin. I. Knockdown af MIR-125b øger respons Panc-1 til gemcitabin. MTT-assays blev udført efter 96 timers gemcitabin. Statistisk signifikans værdier * p 0,05 og ** p 0,01 blev beregnet ved hjælp af studerendes T-test

For at bekræfte, at denne effekt af miR-125b knockdown ikke var enestående til BxPC3-GZR celler. blev miR-125b også slået ned i Panc-1 celler. Svarende til den, der ses i miRNA-125b knockdowns for BxPC3-GZR celler, Western blot og MTT assay data viste, at knockdown af miR-125b udtryk i Panc-1 celle delvist vendt mesenkymale fænotype (Fig. 4G, H) og øget respons på gemcitabin (fig. 4I).

Gene mål for miR-125b

Da miRNA virker ved enten undertrykkende eller kløve deres mål mRNA, vi udført genekspression analyse af flere kendte nedstrøms mål for miR -125b. Flere undersøgelser viste, at mRNA mål for miR-125b er

BBC3

(PUMA),

ITCH

,

BAK1

,

BCL2

,

NEU1

,

PPP1CA

,

PPP2CA

[28] [29];

STARD13

(DLC2) [30];

AP1M1

,

STK11IP

,

PSMD8

,

TBC1D1

,

TDG

,

MKNK2

,

DGAT1

, BAP1,

GAB2

,

SGPL1

[28]. Vi analyserede de kliniske tumor data for disse ovennævnte mRNA udtryk niveauer (Fig. 5). RNA-seq fra TCGA viste, at udtryk for nogle af disse gener (

BAP1

,

BBC3

eller PUMA,

BCL2

,

NEU1

,

STARD13

) er negativt korreleret med ekspressionen af ​​miR-125b. Vi analyserede både det samlede udtryk tendensen af ​​de målrettede gener i PDAC prøver fra TCGA database (fig. 5A), samt ekspressionsniveauet af målgenet i forhold til ekspressionen af ​​miRNA-125b inden for de samme tumorprøver (Fig . 5B). Dernæst har vi overvåget ekspressionsniveauet af p53 opreguleret modulator af apoptose (PUMA). PUMA også kendt som Bcl-2-bindende komponent 3 (BBC3) er et pro-apoptotisk protein og medlem af Bcl-2-protein familien [31], [32]. PUMA er involveret i både p53-afhængige og -uafhængige apoptose pathway induceret af en række forskellige signaler [33]. Nylige undersøgelser viser også, at

NEU1

produkt Neu1 salidase er vigtig i reguleringen af ​​integrin β4-medieret signalering, hvilket fører til undertrykkelse af kræft metastaser [34]. en separat undersøgelse viser dog, at Neu1 salidase forbedrer EGFR-signalering og dermed kunne være tumor fremme [35]. De nuværende resultater sammen med web-baseret miRNA target scan data tyder på, at miR-125b direkte rettet mod 3’UTRs af PUMA (BBC3) og Neu1 (fig. 6. F, G). Til støtte for denne, mRNA udtryk for

BBC3

(PUMA) og

NEU1

blev omvendt korreleret med ekspressionen af ​​miR-125b (fig. 6A) i BxPC3-GZR celler.

A. Target mRNA-ekspression profil analyser for miR-125b. Bestemt udtryk for kendte miR-125b mål (

BBC3

(PUMA),

BCL2

,

STARD13

,

BAK1

,

BAP1

,

ITCH

NEU1

). B. Et direkte samarbejde forhold af mål-mRNA og MIR-125b ekspressionsniveauet blev målt på samme tumor fra pancreas adenocarcinom [PDAC] patients prøve. Første panel forklarer de forskellige kvadranter, som omfatter opregulering (+ Ve tegn) eller nedreguleringen (- Ve tegn) af mRNA og miRNA ekspressionsniveauerne. Andre paneler repræsenterer ekspressionsniveauet af forskellige mRNA (

BBC3, Neu1 og BAK1

) sammenlignet med ekspressionen af ​​miR-125b i samme tumor.

A. PUMA (

BBC3

) og Neu1 er mest fremtrædende mRNA mål for miR-125b. TaqMan qPCR analyser blev udført for at validere kliniske data. De qPCR resultater angiver ekspressionsniveauet af forskellige mRNA (

BBC3, Neu1 og BAK1

), som er direkte mål for miR-125b sammenlignet mellem BxPC3 parentale celler og resistente GZR celler. B. Sammenligning af mRNA-ekspression niveau af

BBC3, Neu1 og BAK1

i BxPC3-GZR celler og stabile BxPC3-GZR celler, der udtrykker anti-miR-125b. C. Western blots analyse at overvåge ekspressionsniveauet af PUMA og Neu1 i BxPC3, BxPC3-GZR, og MIR-125b knockdown celler. D og E. Inhibiting MIR-125b genskaber BBC3 og Neu-1-ekspression i Panc-1-celler, qPCR (D) og Western blot (E). F, G. Arter bevaring og matchning af frøet sekvens i 3’UTR af

BBC3

NEU1

mRNA’er med miR-125b sekvens blev overvåget ved hjælp af Targetscan gratis web-baseret software.

Næste, vi sammenlignet udtryk for tre forskellige potentielle miR-125b målgener PUMA (

BBC3

) (de fleste under-udtrykte gen i patientprøver),

NEU1

og

BAK1

(up-reguleret gen) mRNA mellem BxPC3 forældre- og BxPC3-GZR celler (fig. 6B).