PLoS ONE: Direkte in vivo evidens for Tumor Formering af glioblastoma kræft Stamceller

abstrakt

High-Grade gliomer (WHO grad III anaplastisk astrocytoma og grad IV glioblastoma multiforme), den mest udbredte primære maligne hjernetumorer, vise en cellulær hierarki med selvfornyende, tumorigen cancer stamceller (CSCS) i spidsen. Mens CSC hypotese har været en attraktiv model til at beskrive mange aspekter af tumor adfærd, er det stadig kontroversielt på grund af uløste problemer, herunder anvendelse af

ex vivo

analyser med differential vækstbetingelser. En CSC befolkning er blevet bekræftet i maligne gliomer ved præferentiel tumordannelse fra celler direkte isoleret fra patientens biopsi prøver. Men direkte sammenligning af flere tumor celle populationer med analyse af de resulterende fænotyper af hver population inden for et repræsentativt tumor miljø er ikke klart beskrevet. Til direkte teste den relative tumorigene potentiale CSCS og ikke-stamceller tumorceller i samme mikromiljø, vi afhørt matchede med tumorer i oprenset fra en primær human tumor transplanteret ind i en xenotransplantat musemodel og overvåges konkurrencedygtig

in vivo

tumorvækst undersøgelser med anvendelse af seriel

in vivo

intravital mikroskopi. Mens CSCS var et lille mindretal af den oprindelige transplanterede kræftcelle befolkning, CSCS, ikke de ikke-stamceller tumorceller, kørte tumordannelse og gav tumorer, der udviser en cellulær hierarki. I de resulterende tumorer, en del af de oprindelige transplanterede CSCS opretholdes ekspression af stamcelle og proliferationsmarkører, der signifikant højere sammenlignet med den ikke-stamceller tumorcellepopulation og påvistes at CSCS genereret cellulære heterogenitet i tumoren. Disse head-to-head sammenligninger mellem matchede CSCS og ikke-stamceller tumorceller giver den første funktionelle beviser ved hjælp af direkte billedvisning, at i den samme mikromiljø, CSCS mere end ikke-stamceller tumorceller er ansvarlige for tumor formering, hvilket bekræfter den funktionelle definition af en CSC

Henvisning:. lathia JD, Gallagher J, Myers JT, Li M, Vasanji A, McLendon RE, et al. (2011) Direkte

In vivo

Beviser for Tumor Formering af glioblastoma cancerstamceller. PLoS ONE 6 (9): e24807. doi: 10,1371 /journal.pone.0024807

Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA

Modtaget: Juni 17, 2011; Accepteret: August 22, 2011; Udgivet: 22 september, 2011

Copyright: © 2011 lathia, et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejde i Rich lab er støttet af Damon Runyon Cancer Research Foundation, National Brain Tumor Society, Goldhirsh Foundation, James S. McDonnell Foundation, og NIH tilskud CA112958 (JNR), CA116659 (JNR), CA154130 (JNR), CA151522 (ABH), 5P50-NS-20.023-26 (REM) og en National Research service Award CA142159 (JDL). REM er støttet af Pediatric Brain Tumor Foundation. JNR er en Damon Runyon-Lilly Clinical Investigator støttet af Damon Runyon Cancer Research Foundation. ABH er støttet af National Brain Tumor Society. AYH understøttes af St. Baldrick Fond, Dana Foundation, Cancer Research Institute, og Gabrielles Angel Foundation. JDL understøttes af en amerikansk Brain Tumor Association Fellowship (sponsoreret af Joelle Syverson Fund). AYH og JDL anerkender pilot tilskudsmidler fra Case Comprehensive Cancer Center (RES50-5509). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Humane tumorer normalt vise en heterogenitet i deres neoplastisk rum, der kan stamme fra en kombination af stokastiske genetisk kopi nummer ombygninger og et epigenetisk hierarki, at samtidig udvikle sig over tid [1]. Integration konceptet, at tumorer kan indeholde en stamcelle-lignende population ansvarlig for deres opretholdelse og formering kan være informativt for både kræft og stamceller felter [2]. CSC hypotese kan give indsigt i terapeutisk modstand og tumor tilbagefald og understrege kompleksiteten af ​​kræft. Spændingen omkring CSC hypotese hærdet af kontroverser med hensyn til passende eksperimentelle modelsystemer til funktionelt definere CSCS, CSC frekvens og universelt informative immunfænotyper [3]. Normale og neoplastiske stamceller er i øjeblikket defineret af funktionelle assays for selv-fornyelse og differentiering, med den mest præcise analyse til dato for CSCS bliver tumor formering. Xenotransplantation modeller har bekræftet den forbedrede tumordannelse kapacitet i CSC-berigede fraktioner i en række humane tumorer og er blevet anvendt til at estimere frekvensen af ​​tumor formerings celler [4], som er temmelig høje for visse maligniteter [3]. Som den niche, hvor både normale og neoplastiske stamceller bor instruerer selv-fornyelse og vedligeholdelse, levende dyr in vivo imaging teknikker er blevet anvendt på nogle stamceller populationer – især bloddannende og leukæmiske stamceller – at bestemme vækstmønstre i native mikromiljø [ ,,,0],5], [6], [7], men ansøgningen til solide væv har været begrænset. Solide tumorer CSCS er blevet karakteriseret i ex vivo assays eller som adskilte populationer, som har været oplysende i fastlæggelsen differentielt regulerede pathways men har forhindret direkte analyse af tumor formering potentiale mellem forskellige tumor cellefraktioner. At evaluere potentialet af CSCS i direkte sammenligning med ikke-stamceller tumorceller i en repræsentativ mikromiljø, vi differentielt mærket GBM cellefraktioner afledt fra en human tumor og overvåget tumor adfærd på en xenotransplantation model over tid ved hjælp intravital mikroskopi. Trods et lille antal CSCS på transplantation, blev tumor formering drevet af CSCS og deres efterkommere, viser evnen til CSCS, men ikke ikke-stamceller tumorceller, til at drive tumor dannelse og udbrede cellulær heterogenitet.

Materialer og metoder

Transplantation af gliom celler

Humane gliom celler blev afledt med skriftligt informeret samtykke og under godkendte IRB protokoller fra Cleveland Clinic (protokol 2559) og Duke University (protokol 7409). Gliom celler blev forbigående passage som xenografter i nøgne mus under godkendte Cleveland Clinic IACUC protokol ARC 8699 og in vivo imaging blev udført under Case Western Reserve University protokol 2009-0109). For første CSC tumordannelse undersøgelser, tumor prøven anvendte (T4302) var en nyligt diagnosticeret grad III anaplastisk astrocytoma i en 40-årig mand, som kirurgisk blev fjernet ved Duke University. På tidspunktet for fjernelsen, blev prøven karakteriseret til at have EGFR polysomy (EGFRvIII negativ), MGMT negativ, intakt PTEN, og polysomy af kromosomer 7 og 10. For celle blande undersøgelser (dvs. konkurrence assay), tumor prøven anvendte (T4121) var et tilbagevendende glioblastoma multiforme (GBM) diagnosticeret i en 26 år gammel mand, som kirurgisk blev fjernet ved Duke University. På tidspunktet for fjernelsen, blev prøven karakteriseret at have forstærket EGFR (men EGFRvIII negativ), MGMT positiv, PTEN, tabt kromosom 9p21, og polysomy af kromosomer 1p36, 1p32 og 19q13. I eksperimentelle undersøgelser, blev tumorceller fjernet fra xenotransplantater og CSCS blev beriget baseret på CD133 ekspression ved flowcytometri (under anvendelse af en CD133 /2-APC-antistof, Miltenyi) derefter funktionelt analyseret for selvfornyelse, multi-slægt differentiering, stamcellefaktor markør ekspression og tumor formering som beskrevet tidligere [8]. Formodede CSCS fra GBM specimen T4302 blev transduceret med et lentivirus at udtrykke grønt fluorescerende protein (GFP). For tumor model T4121, blev putative CSCS mærket med gult fluorescerende protein (YFP) eller ikke-stamceller tumorceller blev mærket med en cyan fluorescerende protein (CFP, tumor model T4121) ved lentivirus (Sigma). Mærkede CSCS og ikke-stamceller tumorceller (afledt fra T4121) blev blandet ved en 10%: 90% [eller 1:09] (CSC: ikke-stamceller tumorcelle) forhold og transplanteres ind i cortex af en nøgen mus i en dybde på 1,5 – 2 mm. Kraniale windows blev installeret som tidligere beskrevet [9]. Imaging undersøgelser udnyttet 25.000 transplanterede celler. Alle kirurgiske procedurer blev udført under en godkendt Cleveland Clinic IACUC protokol.

multifoton imaging

Intravital mikroskopi blev udført ved hjælp multifoton billeddannelse som beskrevet tidligere [10] ved hjælp af et Leica SP5 imaging system med en 16W femto -Anden laser tunet til 840-860 nm og fokuseret gennem en 20X nedsænkning i vand linse (numerisk blænde på 1,0). Før billeddannelse blev mus bedøvet og intravenøst ​​injiceret med høj molekylvægt fluorescerende dextran ( 150 kD) for at fremhæve vaskulatur. Billeder blev erhvervet over en 200 um i 2 um z-stakke. Maksimal fremskrivninger, der repræsenterer 200 um i dybden, blev ensartet justeret i Photoshop (Adobe) før vist. For tre-dimensionelle rekonstruktioner, blev data importeres til Imaris software (BitPlane) for overfladevand rendering og volumen blev kvantificeret for hver celle population.

Immunfarvning og statistisk analyse

Frosne sektioner blev skåret ved hjælp af en kryostat (Leica) og immunfarvning blev udført som beskrevet tidligere [11] med antistoffer mod Tra1-85 (R 400.000 celler. Immunfænotypebestemmelse af de transplanterede cellepopulationer blev bekræftet ved flowcytometri under anvendelse CD133 ekspression (CD133 /2-APC-antistof, Miltenyi) af hver cellepopulation som beskrevet tidligere [8]. Immunfarvning på hver cellepopulation in vitro blev udført ved anvendelse af antistoffer beskrevet ovenfor og kvantificeret baseret på et minimum af 150 celler fra 10 felter. Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af en-vejs ANOVA.

Automatiseret billedanalyse

Stor field-of-view (FOV) billeder af tumor tværsnit blev erhvervet ved hjælp af en Leica DM4000, en 40X objektiv , en Q-Imaging CCD, en Prior 8-slide motoriseret scene, Image-Pro 6.2, og YFP, FFP, Cy5 (DRAQ5 mærkede kerner), og Texas Red (Sox2, Tra-1-85, eller PH3) filter kuber. Store FOV billeder (~500 MB /kanal) blev importeret til Image-Pro til analyse ved hjælp af tilpassede makroer. For hvert tværsnit blev DRAQ5 kanal importeret og spektralt forbedret at udligne udseendet af hver kerne. Kerner blev derefter segmenteret, morfologisk “forstørrede” til at udvide deres grænser i cytoplasmaet, og “skelsættende” filtreres for celle separation. En region af interesse (ROI) blev trukket rundt bulk tumor og den fælles fiskeripolitik, YFP, og Texas Red kanaler blev lagt i rækkefølge. Hver kanal blev spektralt filtreret og “multipliceret” af cellen masken ovenfor beskrevet. Segmentering via morfometriske og intensitet profiler specifik for hver markør /plet efterfulgt af billedet logiske operationer forudsat YFP, den fælles fiskeripolitik, og antistof positive celletal. For immunfænotypebestemmelse af det transplanterede population, den resulterende binære kernemaske var “multipliceret” med den tilsvarende PH3 /Sox2 kanal. Positivitet automatisk blev tildelt på grundlag af gennemsnitlige nukleare intensitet PH3 eller Sox2 over en foruddefineret tærskel.

Resultater

Ondartede gliomer er solide cancerformer for hvilke cellulære hierarkier er reproducerbart definerede tillader afhøring af celler der kan prospektivt beriget med CSC kendetegn, herunder selvfornyelse, differentiering potentiale, stamcellefaktor markør ekspression og in vivo tumor formering. For at løse differential in vivo tumor formering potentiale, vi udnyttet modeller, hvor vi tidligere havde udvist evnen til funktionelt berige eller nedbryder for CSC karakteristika i ex vivo assays under anvendelse fluorescerende celleoverflademarkør mærkning [8], [11]. Mens der er polemik omkring CD133 som CSC markør, mange foreslåede gliom CSC markører (herunder L1CAM [12], A2B5 [13], og integrin alpha 6 [11]) overlapning med CD133. Vi finder, at CD133 beriger for CSCS i GBM prøver, der anvendes til undersøgelse og segregerer for tumorsphere dannelse effektivitet sammenlignet med integrin alpha 6 (data ikke vist). Derudover CD133 fraktioner effektivt udbrede sekundære tumorer og CD133 berigelse af CSCS fra disse tumorer er for nylig blevet anvendt til at validere en CSC-specifikke ikke-receptortyrosinkinase og nitrogenoxid syntase isoform [14], [15]. CD133 ekspressionen blev bedømt efter mærkning ved flowcytometri med 11% af YFP-celler (CSC afledt) og 1% af FFP-celler (ikke-stamceller afledt) er CD133 positive (data ikke vist). Proceduren virale mærkning ændrede ikke vækst egenskaber (data ikke vist).

In vivo

observation af kræft stamceller vækst i en tumor

Til dato, væksten af solide tumorer CSCS er ikke vurderet på enkelt celle opløsning over en tidsmæssig tidsforløb in vivo. At observere potentialet for tumor formering af CSCS alene, brugte vi intravital mikroskopi i en ortotopisk xenotransplantation musemodel til at identificere og spore vækst i små antal CSCS i en tumor over tid (fig. 1A). Tidligt i observationsperioden, hvor begrænsede mængder af CSCS var til stede (T4302, dag 3 til 13), CSCS var forbundet med blodkar i perivaskulær niche (fig. 1B, C) som beskrevet af Gilbertson og medarbejdere [16], og voksede i nærhed med blodkar (fig. 1D, E). Over tid (fra dag 13 til 20), en tumor knude hurtigt dannet, og tumorceller blev observeret at infiltrere de perifere regioner (blå pile), en fælles histologisk kendetegnende for maligne gliomer. Resultaterne giver den første tumorvækst tidsmæssige tidsforløb for CSCS ved direkte billedvisning og bekræft tumorigene potentiale af de transplanterede CSCS.

tumordannelse i en xenotransplantation model blev observeret fra GFP-mærkede CSCS over tid som vist i eksperimentel designe skematisk (A). Projektion mikrografer (BD) demonstrere tumordannelse over tid og tredimensionelle rekonstruktioner afbildet i mikrografier (E, E ‘) afslørede tumorceller blev tæt forbundet med blodkar (E’, vist med hvide pile i D, E) og i perifere områder (D, E, der er vist i blå pile). Fluorescerende dextran (vist med rødt) blev injiceret i kredsløbet til at belyse blodkar før billeddannelse. Scale søjle repræsenterer 50 um.

Kræft stamceller vokse ikke-stamceller tumorceller

in vivo

Talrige undersøgelser har vist, forskellen tumor kapacitet dannelse mellem CSCS og ikke -stem tumorceller [8], [15], [17], [18], men en head-to-head sammenligning mellem de to populationer i høj opløsning eller i en tidsafhængig måde er ikke blevet udført. Denne evaluering er kritisk som et malignt gliom består af multiple cellepopulationer, der er krydstale mellem befolkningerne, og hvordan de cellepopulationer interagerer sandsynligvis vil være informativ med hensyn til tumorigene processer. At evaluere adfærd CSCS og ikke-stamceller tumorceller i en identisk mikromiljø, transplanterede vi differentielt mærkede humane CSCS og ikke-stamceller tumorceller afledt fra den samme parentale tumor i den samme modtager mus og overvåget in vivo opførsel over tid ved hjælp intravital mikroskopi (fig. 2A). Sekventiel in vivo vurdering af den samme vært, der bærer en første blanding af CSC (10%, YFP-mærket) og ikke-stamceller tumorceller (90%, CFP-mærket) viste, at CSCS voksede ikke-stamceller tumorceller, med en 51,9 gange stigning volumen for CSCS og en 0,92 gange stigning for de ikke-stamceller tumorceller (fig. 2B), og der var begrænset blandet vækst blandt populationer (fig. 2C, D). Brug af flere cellepopulationer fra samme tumor, disse billeddiagnostiske resultater giver de første beviser for differentieret tumor kapacitet dannelse mellem CSCS og ikke-stamceller tumorceller in vivo ved hjælp af høj opløsning sekventiel billeddannelse.

Fraktionerede CSCS og ikke-stamceller tumor celler blev mærket med forskellige fluorescerende proteiner og transplanteres i mus ved et 10% cancer stamceller (YFP) til 90% ikke-stamceller tumorcelle (CFP) -forhold, som vist i eksperimentelle design skematisk (a). CSCS voksede ikke-CSCS in vivo som vist i oversigtsgrafen (B), som blev beregnet baseret på tredimensionale rekonstruktioner af projection mikrografier (B, C). Derudover har tumorer i ikke blande sig in vivo (ikke-stammen tumor befolkning angivet med gul oval). Fluorescerende dextran (vist i lilla) blev injiceret i kredsløbet til at belyse blodkar før billeddannelse. Scale søjle repræsenterer 100 um.

Resulterende tumorer indeholdt cancer stamceller og deres efterkommere

De sekundære tumorer dannet af transplanterede CSCS indeholde flere cellepopulationer, men tidligere undersøgelser har i høj grad fokuseret på histologi af sekundære tumorer eller ekspression af tumormarkører men der har været begrænset information med hensyn til graden af ​​heterogenitet samt bidraget fra flere celletyper til udviklingen af ​​heterogenitet. Efter mus udviklede neurologiske tegn (varierende fra 37 til 42 dage efter transplantation), anvendte vi histologisk undersøgelse for at bekræfte fænotypen af ​​de transplanterede celler i de resulterende tumorer. For at afgrænse grænserne for tumorer, blev væv farvet for et menneske specifikt antigen, Tra-1-85. Vi fandt, at mens både YFP positive (CSC afledt) og den fælles fiskeripolitik positive (non-stamme afledt) var påviselige, blev det overvældende flertal af tumorceller stammer fra CSCS; 94,5 procent af Tra-1-85 positive celler i tumoren var YFP positive (CSC afledt) versus 0,2 procent som var CFP positive (non-stamceller afledt, fig. 3A, B).

Tumorer fra cellen blanding eksperimenter (n = 3) blev vurderet for at bestemme deres sammensætning. Efterfølgende evaluering af resulterende tumorer viser, at størstedelen af ​​cellerne i tumormassen var af human oprindelse og er afledt af CSC som bekræftet af Tra-1-85-farvning og YFP-ekspression, er vist i repræsentative mikrofotografier (A) og søjlediagram (B) . Perifere transplanterede tumorceller (YFP positive CSCS og deres efterkommere) blev observeret at have en forening med blodkar. Micrograph fra multifoton billeddannelse og tredimensional rekonstruktion (C) viser tæt tilknytning af tumorceller (grøn) med tilstødende blodkar (lilla, oplyst af fluorescerende dextran injektion i omløb før billeddannelse). Histologisk undersøgelse af resulterende tumorer bekræfter tætte associering i perifere tumorceller til vaskulaturen hjælp CD31 immunfarvning (D; CD31 i rød, tumorceller i grøn, kerner i lilla). Scale bar repræsenterer 50 um. Data, vises som middelværdier +/- S.E.M. ***, P 0,001 som vurderet af envejs variansanalyse (ANOVA)

associering mellem blodkar og cancer stamceller og deres efterkommere

Muligheden for tumor. celler til at vokse langs blodkarrene er en fænotype, der ofte identificeret i human gliom kirurgiske prøver. At vurdere, om denne fænotype blev sammenfattet i tumorer fra medforbrænding transplantation af CSCS og matchede ikke-stamceller tumorceller, vurderede vi tumorvaskulatur ved anvendelse multifoton mikroskopi og histologisk undersøgelse af resulterende tumorer (fig. 3C, D). På dag 38 (vist i fig. 2B), var vi i stand til at identificere en gruppe af tumorceller ved periferien af ​​tumoren og tredimensionale analyse viste, at de CSCS og deres efterkommere (YFP-celler) var tæt på vaskulaturen (fig. 3C). Histologisk undersøgelse af resulterende tumor under anvendelse af et antistof mod CD31 for at markere blodkar bekræftede også, at CSCS og deres efterkommere (YFP + celler) var faktisk tæt på vaskulaturen i regioner adskilt fra hovedparten tumormasse, et fænomen også observeres i GBM patienter (fig. 3D).

Kræft stamceller udbrede heterogenitet

in vivo

for at afgøre, om de transplanterede tumorceller indeholdt stamceller-lignende celler, vi evaluerede udtryk for CSC markør, Sox2 [19], og fandt, at 25,9 procent af transplanterede CSCS og deres efterkommere (YFP celler) var Sox2 positive i forhold til 0,1 procent af ikke-stamceller tumorceller og deres efterkommere (FFP celler, fig. 4A, B). Vi vurderede også spredning ved hjælp af M-fase markør phosphoryleret-histon H3 (PH3) og fandt, at 1,7 procent af CSCS og deres efterkommere (YFP celler) var aktivt i M-fasen i forhold til mindre end 0,01 procent af ikke-stamceller tumorceller og deres efterkommere (FFP celler, fig. 4C, D). Disse forskelle i proliferation set i vores model support kliniske rapporter, der tyder prolifererende CSCS (baseret på CD133-positive status) karakteriserer en aggressiv klasse af GBM tumorer [20].

Histologisk undersøgelse blev udført fra resulterende tumorer i cellen blanding eksperimenter (n = 3) for at bestemme den del af stamceller-lignende celler som bedømt ved Sox2 ekspression og tilstedeværelsen af ​​prolifererende celler som bekræftet af M-fase-markør phosphoryleret histon 3 (PH3). Repræsentative mikrografer (A) og søjlediagram (B) demonstrere Sox2 udtryk (rød) er forbundet med cancer stamceller og deres efterkommere (grøn), men ikke med ikke-stamceller tumorceller og deres efterkommere (blå). Repræsentative mikrografer (C) og søjlediagram (D) demonstrerer PH3 udtryk (rød) er forbundet med cancer stamceller og deres efterkommere (grøn), men ikke med ikke-stamceller tumorceller og deres efterkommere (blå). Scale bar repræsenterer 50 um. Data, vises som middelværdier +/- S.E.M. ***, P. 0,001 som vurderet af envejs variansanalyse (ANOVA), kerner modfarvet med DRAQ5 (lilla)

For at få en forståelse for graden af ​​heterogenitet fastlagt af det transplanterede CSCS (YFP-positive celler), evaluerede vi fænotypen af ​​cellerne inden transplantation. CSC-kulturer indeholdt 74,8 procent Sox2 positive celler (dvs. in vitro) sammenlignet med 24,9 procent af Sox2 positive YFP-celler (CSC afledt) i tumoren (dvs. in vivo, fig. 5A-C). Disse resultater antyder, at in vivo-miljø giver instruktive signaler til at genskabe en ligevægt af differentiering status og dermed cellulær heterogenitet. En tilsvarende reduktion blev set i Sox2 positive ikke-stamceller tumorceller (FFP-celler) fra en oprindelig population af 7,1 procent i kultur til 0,1 procent i tumoren (fig. 5A-C). Forskelle i vækst blev også observeret mellem populationer i kulturen sammenlignet med i tumoren. Brug af M-fase-markør PH3 som erstatning af proliferation, vi observerede 2,1 procent YFP positive celler (CSC afledt) og 0,2 procent CFP positive celler (ikke-stamceller afledt) i kulturen sammenlignet med 1,7 procent YFP positive celler og mindre end 0,01 procent CFP-positive celler i tumorer (fig 5A-C). Disse resultater viser, at selvom ikke-stamceller tumorceller fremherskende på tidlige tidspunkter på grund af forholdene på tidspunktet for transplantation, voksende tumorer havde begrænset antal celler afledt af ikke-stamceller tumorceller, hvoraf kun få udtrykte stamcellemarkører eller var aktivt prolifererende. De resulterende tumorer blev sammensat af CSCS og deres efterkommere, en brøkdel af, som stadig indeholdt stamcelle markør udtryk og var aktivt prolifererende.

Repræsentative mikrografer (A) og søjlediagram (B) af ekspanderede celler før transplantation demonstrerer Sox2 og PH3 ekspression (rød) er højere i CSC fraktionen af ​​celler sammenlignet med de ikke-stamceller tumorceller. Sammendrag illustration viser markør ekspression fra in vivo og in vitro analyser (C). Scale bar repræsenterer 50 um. Data, vises som middelværdier +/- S.E.M. ***, P 0,001 og N.S. repræsenterer ikke signifikant (p 0,05). vurderet ved envejs variansanalyse (ANOVA), kerner modfarvet med Hoechst 33342 (blå)

Diskussion

Tumoren mikromiljø er en kritisk regulator af tumor dannelse og vedligeholdelse med bidrag til terapeutisk respons og fiasko. Dog har mange CSC og hjerne tumor undersøgelser ikke korrekt modelleret mikromiljø. Ofte CSC og ikke-stamceller tumorceller dyrkes under forskellige forhold, der omfatter forskellige medier og CSCS dyrkes som kugler og ikke-stamceller tumorceller dyrket adhærent. Da disse betingelser aktivere forskellige celle signalveje, kan nogle CSC resultater skyldes kultur artefakt snarere end iboende cellulære forskelle. Mange undersøgelser er udført med befolkningerne i isolation, som ikke tillader signalering mellem celler, der er afgørende for cellevækst eller evalueringen af ​​hver celletype bidrag til tumordannelse in vivo. Desuden niche interaktioner med komponenter såsom karrene eller stroma kan ikke vurderes fuldt ud, medmindre studier udføres in vivo. For bedre at modellere tumormikromiljøet, vi differentielt mærkede CSCS og ikke-stamceller tumorceller og indført cellerne i den samme in vivo betingelser. Vores vurdering af vækst giver den første direkte bevis for tumor formering af en fast tumor CSC subpopulation in vivo under anvendelse direkte billedvisning og viser, at en lille fraktion af tumorceller kan udbrede en heterogen tumor. Vores undersøgelser tilbyde betydelige fordele i forhold til ex vivo eller matchede befolkningsundersøgelser på grund af vores evne til mere hensigtsmæssig model in vivo miljø og vurdere adfærd flere populationer i realtid ved hjælp af høj opløsning mikroskopi.

Der er mange aspekter af xenotransplantation modeller, der giver potentielle fordele, men der er stadig begrænsninger. Begrebsmæssigt disse transplanterede analyser tilbyde en bedre in vivo miljø på bekostning af en påskønnelse af tumorigene processer i realtid, som kun kan udledes efter tumordannelse. Dog kan denne sorte boks tilgang behandles med brug af levende billeddannelse som beskrevet i denne rapport. Ved hjælp af levende billedbehandling, kan snørklede af xenotransplantation modellen blive belyst og informative forudsigelser kan gøres for tumor udvikling, vedligeholdelse og respons på behandling. Omhyggelig brug af xenotransplantation modeller vil give mulighed for en større forståelse af interaktionen mellem CSCS og ikke-stamceller tumorceller, såvel som cellulær kommunikation med blodkar, en CSC niche i flere hjernetumorer [16]. Derudover kan disse tilgange afklare den nyligt identificerede fænomenet GBM CSC differentiering i vaskulære celler og afklare rolle denne plasticitet i tumorigene processer [21], [22], [23], [24]. Notatet vi ikke observere integration af mærkede celler i karvæggen (data ikke vist). Disse vaskulære interaktioner er vidtrækkende terapeutiske implikationer især i forbindelse med angiogenese, hvor mange behandlinger er under efterforskning. Endvidere kan en større forståelse af samspillet mellem mikromiljø og transplanterede tumorceller hjælpe med at forklare den forsinkede tumorvækst i transplantationsmodeller. Dette understreges af vores observationer, der er vist i figur 1, hvor CSC vækst mellem dag 35 til dag 38 er ganske bemærkelsesværdigt, men kongruent med dynamikken i tumorvækst inden for en transplantation model [25], [26]. Disse forskelle vil sandsynligvis være en afspejling af en flertrinsproces, der indbefatter tumorcelleoverlevelse, tilpasning til værtsmiljøet, efterfulgt af eksponentiel vækst, som kan ekstrapoleres til at forstå tilbagefald hos patienter.

Vores data også påvise, at en sådan fremgangsmåde kan bruges til bedre at definere kræft cellulære heterogenitet, som vil være afgørende for både den grundlæggende forståelse af tumorigenese og en model til mere passende teste lovende prækliniske behandlingsformer. I vores undersøgelser, de resulterende tumorer, der dannede indeholdt en heterogen population, som vurderet af Sox2 udtryk, trods den betydelige repræsentation af YFP celler (CSC afledt). Denne type af in vivo-afstamning sporing er blevet begrænset i GBM undersøgelser og vores resultater bekræfter, at CSCS udtrykker et stamcellemarkør kan generere celler, som ikke udtrykker stamcellen markering, hvilket viser overgangen mellem stamcelle stater in vivo. Prækliniske undersøgelser stole på tumorstørrelse som en vurdering af effekten. Vores demonstration, at en lille brøkdel af kræftceller formerer en tumor in vivo repræsenterer en komplementær tilgang til at evaluere effekten af ​​en given behandling af afstamning sporing. Taget i en klinisk sammenhæng er en terapi, der dræber de fleste celler og efterlader en lille population af ildfaste celler (som kan være beriget i CSCS) fremkommer effektiv, hvis tumorstørrelse er den målte resultat. Men de resterende celler, hvoraf nogle er CSCS, vil kunne bidrage til tumor tilbagefald, som ofte ses i patienter efter behandlinger er effektive til at reducere tumorstørrelse [27]. Derfor evaluere cellulære slægter i en tumor efter terapi i kombination med tumor størrelse vurderinger og histologiske analyse vil sandsynligvis give et mere præcist billede af effekten af ​​behandlingen. Evnen til at vurdere tumorcelle adfærd sig i en relevant klinisk model er værdifuldt. Vores data (denne rapport og [11], [28]), og dem fra andre grupper [16] viser, at tumorceller har et intimt forhold til vaskulaturen; Men FDA godkendte vaskulær endotel-vækstfaktor (VEGF) neutraliserende antistof bevacizumab (Avastin) har haft blandet succes klinisk trods succes i prækliniske modeller [29]. Modstand mod anti-VEGF terapier postuleres at forekomme gennem svig eller ligegyldighed og inddrage moduleret angiogenese, vaskulogenese, vaskulær normalisering [30], [31]. Men den dominerende form for resistens er endnu ikke fastlagt, og vores tilgang ved hjælp af flere tumor cellepopulationer og høj opløsning in vivo mikroskopi vil sandsynligvis give kritisk indsigt. For større effekt, kan disse fremgangsmåder kombineres med anvendelse af fluorescerende reportersystemer at evaluere den transkriptionelle aktivitet i realtid og i korrelation til terapeutisk respons. Et andet område, hvor disse billedteknik vil være nyttigt er evalueringen af ​​sonic hedgehog (Shh) hæmmere. Det er uklart, hvis virkemåde er direkte på tumorceller, tumor stroma, eller begge dele, og belysning af virkningsmekanismen er en umiddelbar prioritet, da flere Shh inhibitorer er i øjeblikket under efterforskning for en række tumorer, herunder GBM [32] , [33].