PLoS ONE: MicroRNA Seed Region Længde Indvirkning på Target Messenger RNA Expression og overlevelse i kolorektal cancer

Abstrakt

microRNA (miRNA) undertrykke messenger-RNA’er post-transkriptionelt gennem binding til 3’UTR af mRNA’et med miRNA frø region. Det er blevet påstået, at længere seed regioner har en større effekt på mRNA undertrykkelse. Vi testede denne hypotese ved at vurdere differentiel ekspression af miRNA involveret i regulering af immunresponset, en vigtig mekanisme i kolorektal cancer (CRC), ved frø længde kategori. Vi efterfølgende evalueret differentieret ekspression af disse miRNA ‘mål i colon væv og virkningen af ​​disse miRNA på CRC overlevelse. Vi bestemte sekvens komplementaritet mellem hver miRNA frø region og 3’UTR af hver eksperimentelt verificeret mRNA målgen. Vi klassificeret miRNA i grupper baseret på frø regioner matchende perfekt til et mRNA UTR med seks baser begynder ved position to, syv baser begynder ved position ét, syv baser begynder ved position to eller otte baser begynder ved position én. Vi analyserede disse grupper i form af miRNA forskellen udtryk mellem karcinom og normal kolorektal slimhinde, differential colon target mRNA-ekspression, og risikoen for at dø af CRC. Efter korrektion for multiple sammenligninger, hvor stor en del af de miRNA, der var forbundet med differentiale mRNA-ekspression var 0% for 6-mer, 13,64% for 7α-mer gruppe, 12,82% for 7β-mer gruppe, og 8,70% for 8-mer-gruppe. Andelen af ​​miRNA forbundet med overlevelse var 20% for 6-mer-gruppe, 27.27% for 7α-mer gruppe, 10,23% for 7β-mer gruppe, og 21,74% for 8-mer-gruppe. Vi kunne ikke se en lineær sammenhæng mellem frø længde og miRNA udtryk dysregulering, mRNA-ekspression, eller overlevelse. Vores resultater støtter ikke hypotesen frø regionen længde alene påvirkninger mRNA undertrykkelse

Henvisning:. Mullany LE, Herrick JS, Wolff RK, Slattery ML (2016) MicroRNA Seed Region Længde Indvirkning på Target Messenger RNA Expression og overlevelse i kolorektal cancer. PLoS ONE 11 (4): e0154177. doi: 10,1371 /journal.pone.0154177

Redaktør: Geraldo A. Passos, University of São Paulo, Brasilien

Modtaget: Februar 25, 2016 Accepteret: April 8, 2016; Udgivet: 28 April, 2016

Copyright: © 2016 Mullany et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. I overensstemmelse med de underskrevne samtykkeerklæringer og efter godkendelse af data sharing aftaler som fastsat af universitetet i Utah Institutional Review Board (https://irb.utah.edu/), kan data kun frigives ved undersøgelsens efterforskere, med henblik på ikke- kommercielle, coloncancer forskning, og skal være i de identificerede formular. Kontakt venligst [email protected] i forhold til datadeling

Finansiering:. Finansiering af denne undersøgelse blev leveret af National Cancer Institute, give numre CA163683 og CA48998. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er blevet mere og mere under efterforskning for den rolle, de spiller i biologiske processer, især som den vedrører udvikling og progression af kræft. Modne miRNA er små (~ 22-23 nukleotider lang), endogent udtrykt, ikke-protein-kodende RNA-molekyler, post-transkriptionelt regulerer messenger RNA’er (mRNA’er) [1-3]. De gør dette ved binding til den 3 ‘utranslaterede region (UTR) af mRNA’et og forårsager enten mRNA nedbrydning ved mere præcis binding eller inhibering af mRNA-translation, ved mindre præcis binding [4, 5]. MiRNA er i stand til at regulere mange mRNA individuelt [4], og mere end en miRNA kan målrette en individuel mRNA, hvilket skaber en kompleks dynamik kooperativ regulering [6].

I 2015 rapporterede den amerikanske Cancer Society, at kolorektal cancer (CRC) er den næststørste årsag til kræft-relaterede dødsfald i USA, da han og hunner betragtes sammen, og den tredje, når de betragtes hver for sig, dræbte 100.000 mennesker i USA hvert år [7]. CRC har vist sig at være en kompleks sygdom, der involverer mange biologiske processer [8], og som sådan miRNA er blevet postuleret som centrale regulatorer af CRC [9]. Et centralt proces i tumorigenese, der er blevet foreslået til at blive fremtrædende i udviklingen og progressionen af ​​CRC er kronisk inflammation [10], og mere bredt, inddragelse af immunresponset [8, 11]. Tumorer er kendt for at være immunogent, idet de fremkalder en immunreaktion [11]. Udover at regulere forskellige mRNA’er målrette gener, der er involveret i immunresponset, at miRNA været impliceret i differentieringen af ​​hæmatopoietiske afstamninger, spiller en vigtig rolle i både B- og T-celle responser [3].

Mens mange faktorer kan bidrage til miRNA-mRNA binding, fuldstændighed, med hvilken miRNA binder til mRNA, og den resulterende virkning miRNA har på mRNA-ekspression, er generelt menes at være bestemt af frøet sekvensen i miRNA [1, 12, 13 ]. Den præcise definition af frøet regionen er noget debatteret i litteraturen, men generelt den kanoniske, eller “kerne”, er frø region menes at omfatte en sammenhængende streng af mindst 6 nukleotider begynder ved position to [13]. Mere specifikt har de centrale frø blevet beskrevet som en 6-mer (baser 2-7), 7-mer ( “7-mer-A1” bliver baserne 1-7, og “7-mer-m8” bliver baser 2- 8), og 8-mer (baserne 1-8); i nogle anmeldelser de 7-mer-A1 og 8-mer frø skal have en adenin, ‘A’, som det første nukleotid [1, 13-16]. Ellwanger et al. fandt, at længere frø, dvs. frø af 7 eller 8 nukleotider i længden, var mere evolutionært bevaret end kortere dem [13].

I denne undersøgelse ser vi på frø sekvens lighed mellem miRNA og deres tilsvarende verificerede mRNA-mål at deltage i immunresponset, og vurdere længden af ​​frø kampe som den vedrører miRNA udtryk i normal kolorektal slimhinde, kolorektal carcinom væv, og differential udtryk samt miRNA indvirkning på overlevelse og colon mRNA differential udtryk. Ved at evaluere en delmængde af miRNA, der er rettet immunrespons, fokuserer vi vores undersøgelse på miRNA er involveret i fysiologiske reaktioner er vigtige for kræft, og begrænse antallet af interaktioner, vi vurderer, for en mere målrettet tilgang. Som længere seed regioner påstås at have en større virkning som den vedrører mRNA undertrykkelse [1], og mere præcise binding resulterer i mRNA-nedbrydning, vi hypotesen, at miRNA, der binder til målgener med en længere frø region vil blive mere signifikant associeret med CRC-specifik overlevelse og mRNA nedbrydning.

Materialer og Metoder

undersøgelse befolkning

data kommer fra deltagerne i befolkningen-baserede kost, aktivitet og Livsstil undersøgelse, der blev rekrutteret fra Utah eller Kaiser Permanente Medical Care Program for det nordlige Californien (KPMCP). Colon kræfttilfælde blev identificeret som havende en primær adenocarcinom diagnosticeret mellem 1. oktober 1991 til 30. september 1994 mens rektal cancer tilfælde blev diagnosticeret mellem maj 1997 og maj 2001. Alle kvalificerede tilfælde var mellem 30 og 79 år på diagnosetidspunktet, der bor i det undersøgte område, talte engelsk, var i stand til at fuldføre et interview, og havde ingen forudgående historie CRC, Crohns sygdom, colitis ulcerosa, eller kendt familiær adenomatøs polypose. Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board ved University of Utah; alle deltagere underskrev et informeret samtykke formular.

miRNA Processing

RNA blev ekstraheret fra formalin-fikserede paraffin indstøbt væv og behandles som beskrevet tidligere [17]. 100 ng total RNA blev mærket med Cy3 og hybridiseret til Agilent Menneskelig miRNA Microarrays V19.0 og blev scannet på en Agilent SureScan microarray scanner model G2600D hjælp Agilent Feature Extract software v.11.5.1.1. Data blev forpligtet til at videregive strenge QC parametre fastsat af Agilent der omfattede test for overdreven baggrund fluorescens, overdreven variation blandt probesekvens replikater på array, og foranstaltninger af den samlede gen signal på arrayet til at vurdere lavt signal. Hvis prøverne ikke opfyldte QC standarder, blev prøven gentaget, og hvis en prøve mislykkedes QC vurdering en anden gang prøven blev anset for at være af dårlig kvalitet og blev udelukket fra down-stream-analyse. Agilent platform viste sig at være yderst pålidelig (r = 0,98), at have en rimelig aftale med NanoString [18] samt fremragende aftale med QRT-PCR (Pellatt, i trykken). For uparrede prøver som følge af manglende normale scanninger, vi imputerede værdier for normal slimhinde som tidligere beskrevet i [19]. For at minimere forskelle, der kunne tilskrives den vifte, mængden af ​​RNA, placering på række, eller andre faktorer, der fejlagtigt kan påvirke udtryk, blev total gen signal normaliseret ved at gange hver prøve med en skaleringsfaktor som var medianen af ​​75

percentil af alle prøverne divideret med 75

percentil af hver enkelt prøve [20]. Denne skaleringsfaktor blev gennemført ved hjælp af SAS 9.4.

mRNA Sequencing Bibliotek Forberedelse, sekventering, og Data Processing

RNA bibliotek konstruktion blev gjort med Illumina TruSeq Strandede Total RNA Sample Preparation Kit med Ribo-Zero . Prøverne blev derefter fragmenteret og primet til cDNA-syntese, adaptorer blev derefter ligeret på cDNA, og de resulterende prøver blev derefter amplificeret ved anvendelse af PCR; det amplificerede bibliotek blev derefter oprenset under anvendelse Agencount AMPure XP perler. En mere detaljeret beskrivelse af de metoder, kan findes i vores tidligere arbejde [21].

Sekventering blev udført ved hjælp af en Illumina TruSeq v3 enkelt læser flow-celle og en 50 cyklus enkelt læse sekvens run blev udført på en Illumina HiSeq instrument. Læser blev derefter justeret til en sekvens database, der indeholder det humane genom (bygge GRCh37 /hg19 februar 2009 fra genome.ucsc.edu) og tilpasning blev udført ved hjælp novoalign v2.08.01. Python og en pysam biblioteket blev anvendt til at beregne tæller for hver exon og UTR af gener ved anvendelse af en liste over gen koordinater opnået fra https://genome.ucsc.edu. Vi faldt funktioner, der ikke blev udtrykt i vores data eller for hvilke manglede udtrykket for størstedelen af ​​prøverne. En mere detaljeret beskrivelse af de metoder, kan findes i vores tidligere arbejde [21].

Bioinformatik Analyse

En liste over mRNA gener blev opnået fra Ensembl hjælp Ensembl s Biomart værktøj, der bruger den version kortlagt til menneskelige genom GRCh38. Vi anmodede om en liste over Ensembl Gene ID’er og associerede Gene Navne, der havde GO sigt attribut “immunrespons”. Dette gav en liste over 1.762 Ensembl ID’er, der svarer til 1.355 unikke gen navne. En liste over miRNA-gen foreninger blev derefter genereres ved hjælp af Homo sapiens repository fra miRTarBase, der udnytter miRBase 21. miRNA, der var forbundet med gener, der findes i den “immunrespons” liste og blev eksperimentelt verificeret ved hjælp af enten “reporter assay”, “QRT -PCR “, eller” western blot “, da disse metoder anses stærkere ved miRTarBase, blev analyseret yderligere. Disse begrænsninger gav 1.413 miRNA målgruppen foreninger omfatter 395 unikke “immunrespons” gener og 327 unikke miRNA. Agilent platformen svarer til miRBase 19 nomenklatur, og ved at bruge denne version til FASTA sekvenser, vi kan se, hvilke aktuelle sekvenser blev differentielt udtrykte i vores datasæt. Som miRTarBase v6.0 er baseret ud af miRBase 21, dette giver os mulighed for at kende de mest aktuelle foreninger, og kun de miRNA som matcher i navn blev fremført i analysen. MRNA 3’UTR FASTA sekvenser blev opnået for de gener, der er blevet verificeret mål for miRNA fra Ensembl s Biomart; vi anvendt et filter krav om “CCDS ID” for at opnå kun konsensus-sekvenser. Seed regioner blev frembragt for hver miRNA ved at beregne den omvendte DNA-komplement af nukleotider 2-7, 1-7, 2-8 eller 1-8 af 5′-enden af ​​miRNA at gøre 6-mer, 7α-mer ( også kaldet 7-mer-A1 i litteraturen), 7β-mer (også kaldet 7-mer-m8 i litteraturen), og 8-mer frø henholdsvis. Vi derefter søgte 3’UTR af mRNA’et, der blev eksperimentelt bekræftet at være målrettet efter miRNA hvorfra de blev genereret for hvert af de frø sekvenser. MiRNA, der fandt sted i kun ét frø kategori blev gennemført på i analysen; dette blev gjort til at polarisere resultaterne samt reducere tvetydighed i afledte miRNA-gen foreninger. Et diagram af denne proces kan ses i fig 1. De endelige miRNA grupperinger bestod af 99 miRNA: 15, 22, 39, og 23 miRNA til 6-mer, 7α-mer, 7β-mer og 8-mer frø henholdsvis. Antallet af miRNA svarende til hver gruppe kan ses i Fig 2. Efter bestemmelse som miRNA blev væsentligt differentielt udtrykt mellem den normale colorectal slimhinde og colorektalt carcinom væv identificerede vi et nyt sæt af målgener for disse miRNA. Den resulterende liste var ikke “immunrespons”-specifik, selvom det omfatter “immunrespons” gener, som de miRNA in vivo sandsynligvis ikke ville begrænse deres indsats på mRNA, de er rettet mod. Disse gener blev derefter analyseret, som beskrevet nedenfor, for foreninger med deres respektive målretning miRNA for yderligere at undersøge virkningen af ​​frø-typen binding på mRNA-ekspression.

statistiske metoder

Vores stikprøve bestod af 1893 forsøgspersoner med miRNA ekspressionsniveauerne for både carcinom og normale slimhinde væv. Vi sammenlignede log base 2 forvandlet miRNA udtryk niveauer mellem parret karcinom væv og normal kolorektal slimhinde samlet, stratificeret ved undersøgelse med betydningen analyse af microarrays (SAM) teknik i R pakke siggenes [22]. P-værdier genereret fra SAM var baseret på 1.000 permutationer med en falsk opdagelse sats (FDR), der er på 0,05 [23]. Vi analyserede fire frø regioner, 6-mer, 7α-mer, 7β-mer, og 8-mer, i fællesskab. For de miRNA, der var betydeligt differentielt udtrykte, rapporterer vi det gennemsnitlige niveau af udtryk og folden ændring (på ikke-log transformerede data) mellem colorectal carcinom væv og normal kolorektal slimhinde.

Dernæst undersøgte vi virkningen af differential miRNA udtryk på overlevelse ved hjælp af Cox proportional hazard model i 1855 forsøgspersoner med overlevelsesdata rådighed. Vi beregnet hazard ratio (HR) og tilsvarende 95% konfidensintervaller (CI) med enheden af ​​forandringer er den interkvartile område (IQR), korrigeret for alder, køn og AJCC scenen generelt samt stratificeret efter studie og scene. Vi testede CRC-specifik overlevelse baseret på måneder mellem diagnose dato og død eller sidste opfølgende date. Enkeltpersoner dør af andre årsager eller som var tabt for opfølgning blev censureret på deres dødstidspunktet eller dato for sidste kontakt. R pakke overlevelse blev anvendt til at beregne p-værdier baseret på 10.000 permutationer af sandsynligheden kvotientkriteriet. Fordi en række miRNA sjældent blev udtrykt, som vi defineret som udtryk i mindre end 50% af patienterne, vi beregnet HR for disse miRNA baseret på ethvert udtryk uden brug af permutationer til at beregne p-værdier i SAS 9.4 (SAS Institute, Cary , NC). Vi kombinerede p-værdierne for begge de mere almindeligt udtryk miRNA og sjældent udtrykte miRNA og justeret for multipel sammenligning bruger en FDR på 0,05.

Endelig har vi undersøgt sammenhængen mellem differentielt udtrykte miRNA og deres respektive mRNA mål gener ved at evaluere 302 kombinationer identificeret i miRTarBase ved fremgangsmåden beskrevet ovenfor i undergruppen af ​​148 forsøgspersoner med mRNA data tilgængelige metode. Vi genererede lineære regressionsmodeller korrigeret for alder og køn på 1000 bootstrap [24] prøver. Vi beregnede forskellen mRNA udtryk som forskellen af ​​log bunden 2 af RPKM (Læser pr kilobase pr Million) til karcinom og normale slimhinde væv. P-værdier blev genereret fra fordelingen af ​​p koefficienter for hver miRNA og evaluering H

0: β = 0 vs. H

1: p ≠ 0 ved hjælp af boot pakke i R. Vi justeret for multipel sammenligning ved hjælp af en FDR niveau på 0,05. Vi standardiseret skråninger genereret fra den samlede datasæt for at sammenligne resultaterne på tværs af miRNA.

Resultater

En samlet oversigt over miRNA indgår i analyserne og udelukket fra analysen efter frøene generation kan findes i S1 tabel.

Fyrre-tre miRNA var signifikant forskelligt udtrykt mellem normale kolorektale slimhinde og kolorektal carcinom væv (tabel 1). Ud over de differentielt udtrykte for tarmkræft blev tre miRNA differentielt udtrykt for kun coloncancer og tre blev differentielt udtrykt for kun rektal cancer. Af de 49 samlede dysregulerede miRNA, blev 18 opreguleret og 31 blev nedreguleret i carcinoma væv versus normal kolorektal slimhinde. Seks af miRNA blev klassificeret som 6-mer bindende, 12 blev klassificeret som 7α-mer, 19 som 7β-mer, og 12 som 8-mer. Seksten af ​​disse miRNA havde en fold ændring af ≥1.5 eller ≤0.67 repræsenteret ved en 6-mer, fire 7a-merer, fire 7p-merer, og syv 8-mer.

Atten miRNA var signifikant forbundet med ændret overlevelse; 17 af disse miRNA var forbundet med overlevelse efter diagnosen med endetarmskræft og én var forbundet med den samlede CRC overlevelse efter korrektion for multiple sammenligninger (tabel 2). Af de 18 miRNA, der var forbundet med ændret overlevelse, 15 også var signifikant differentielt udtrykt mellem normal colorectal slimhinde og kolorektal carcinom væv. Ingen miRNA ændret overlevelse for kun tyktarmskræft. Tre af disse miRNA blev klassificeret som 6-merer, fem som 7a-merer, fire som 7P-merer, og tre som 8-mer.

Nitten miRNA var forbundet med udtryk for deres kendte målrettede mRNA (tabel 3); 12 af disse forblev signifikant efter justering for multiple sammenligninger. Af disse 12 blev seks miRNA omvendt forbundet med målrettet mRNA udtryk og seks var direkte forbundet med målrettet mRNA-ekspression. Af de miRNA, der viste en direkte sammenhæng med differentiale udtryk for mRNA blev en klassificeret som en 7α-mer, to som 7P-merer, og tre som 8-mer. Af de miRNA, der viste en omvendt sammenhæng med differentiale mRNA-ekspression to blev klassificeret som 7a-merer og fire blev klassificeret som 7P-merer.

Et resumé af antallet af miRNA markant differentielt udtrykt, der er forbundet med risiko for at dø af kolorektal eller endetarmskræft, og forbundet med differentiale mRNA-ekspression er vist for hvert frø kategori i tabel 4. Mens frø gruppen 7α-mer havde den højeste andel af miRNA i hvert statistisk test, de procentsatser for hver kategori var meget tæt, hvilket antyder ingen sand forskel i proportioner. Da det samlede antal miRNA i hver kategori er relativt lille, kan en eller to miRNA forklare forskellen i andele.

Overlapningen af ​​miRNA repræsenteret af hver af analyserne kan ses i figur 3. Fra dette diagram, ser vi, at kun fire miRNA væsentligt blev differentielt udtrykt, var forbundet med ændret overlevelse, og var signifikant associeret med ændret mRNA-ekspression efter korrektion for multiple sammenligninger. Af disse fire miRNA blev to klassificeret som 8-mer, en som 7β-mer, og en blev klassificeret som 7α-mer. Kun én af disse fire, HSA-miR-150-3p, blev omvendt associeret med mRNA-ekspression, resten var direkte forbundet.

Diskussion

Mange miRNA i denne undersøgelse var forskelligt udtrykt mellem colorectalt carcinom væv og normal colorektal mucosa, var forbundet med ændret risiko for at dø af enten CRC eller rektal cancer eller blev associeret med differentiel colon-mRNA-ekspression. Fire af disse miRNA viste sig at have betydelige foreninger i alle tre prøver. Vi antager, at, fordi længere frø regioner har en større effekt af mRNA undertrykkelse og mere præcise bindende resultater i mRNA nedbrydning, at de længere frø regioner ville være forbundet mere med mRNA differential udtryk samt CRC risiko. Generelt frø gruppen 7α-mer, som består af miRNA med frø omfatter nukleotid 1-7, havde mere signifikante fund i form af, hvor mange miRNA tilhører hver kategori var forbundet med enten miRNA differential udtryk, mRNA differential udtryk eller overlevelse. , Da procenterne er ret tæt for alle grupper, er det dog sandsynligt, at dette resultat er ikke statistisk forskellige. Derudover var der ingen lineær trend, dvs. tal fra 6-frø nummer fra 7a /β-frø tal fra 8-frø eller omvendt, vil andelen af ​​miRNA fra hvert frø gruppe, der var betydelig med mRNA differential ekspression eller med overlevelse. Dette antyder, at frø længde alene, i det mindste som det er defineret i denne undersøgelse, er ikke forbundet med enten mRNA differentiel ekspression mellem koloncarcinomvæv og normal colon mucosa eller med risiko for at dø af CRC. Der var en lille lineær trend i miRNA differential udtryk med fold ændringer ≥1.5 eller ≤0.67 som den vedrører frø region længde, med successivt flere miRNA bliver differentielt udtrykt som frø region længde forøget. Dette er imidlertid usandsynligt, at være biologisk relevant.

I modsætning til deres veletablerede rolle som repressorer, miRNA er for nylig blevet vist at aktivere mRNA-translation, når cellerne er i en hvilende tilstand [25]. Konkret eksogen HSA-let-7 blev vist sig at øge

HMGA2

oversættelse, når det tilsættes til serum-sultede (hvilende) HeLa-celler. I vores undersøgelse observerede vi forøget ekspression af HSA-lad-7d-5p i kolorektal cancer væv i forhold til normal kolorektal slimhinde, og en direkte sammenhæng mellem HSA-lad-7f-5p og

HGMA2

udtryk (β = 0,16, P

adj = 0,032), hvilket indikerer en efterfølgende stigning i

HGMA2

udtryk i karcinom væv. HSA-lad-7d-5p er kategoriseret som en 7β-mer bindende miRNA i vores datasæt. Da denne dynamiske tidligere blev set i hvilende celler, kan det være, at individer, som udtrykker højere niveauer af HSA-let-7d-5p og

HMGA2

har flere celler, der er i en sovende tilstand. Vi så opregulering af HSA-miR-196a-5p og HSA-miR-196b-5p i kolorektal cancer væv i forhold til normale kolorektal slimhinde; vi efterfølgende oplevede en direkte sammenhæng med HSA-miR-196a-5p og

HOXB7

og HSA-miR-196b-5p med

HOXA10

i colon carcinom væv. De samme forhold mellem disse miRNA og mRNA blev observeret hos patienter med Huntingtons sygdom i forhold til normale hjerner [26]; denne undersøgelse tilskrives denne observerede dynamik til afvigende mRNA-processering. Da denne undersøgelse identificerer en nøgle pathway beriget af disse gener som “Celledød og Survival”, findes ved hjælp af IPA, kunne det være, at denne uortodokse forhold skyldes ændringer i denne pathway. Phosphatase og tensin homolog eller

PTEN

, koder for et enzym, der findes i mange af kroppens væv og virker til at hæmme ukontrolleret vækst, og dermed fungerer som en tumor suppressor [27]. Dette gen var direkte forbundet med HSA-miR-425-5p, som blev forøget i karcinom væv (fold ændring = 1,79, P-værdi 0,0001). Over udtryk for HSA-miR-425-5p i kolorektal carcinom var forbundet med nedsat risiko for at dø af endetarmskræft (IQR Range HR 0,84 95% CI 0,74, 0,95 P

adj = 0,0354). Da denne miRNA var forbundet med øget ekspression af

PTEN

i colon væv (β = 0,25, P

adj = 0,024), og differential ekspression af denne miRNA var tilsvarende for colon og rektal væv, er det muligt at en tilsvarende forbindelse med PTEN ville ses i rektal væv. Den ændrede risiko for endetarmskræft kan derfor blive påvirket af PTEN evne til at undertrykke ukontrolleret vækst.

En begrænsning er, at vi evaluerede mRNA data for kun kolon væv. Mens vi har vist, at dysregulering af miRNA er tilsvarende for colon og rektal cancer [18], er det uvist, om dysregulering af mRNA er den samme for rektal og tyktarmskræft. Men hvis det er, det er interessant at bemærke, at af de miRNA, der var forbundet med både ændret overlevelse efter diagnose med rektal cancer og mRNA-ekspression i colon væv, de, at øget overlevelse (HSA-MIR-192-5p, hsa- miR-30e-5p, HSA-miR-425-5p, HSA-miR-142-3p, og HSA-miR-196b-5p) havde direkte associationer til mRNA-ekspression (β 0), og dem, der øget risiko for at dø af cancer (HSA-miR-486-5p og HSA-miR-150-3p) havde en omvendt sammenhæng med mRNA-ekspression (β 0). Som en hvilende celle er ikke dividere ukontrollabelt, er det muligt, at dette forhold mellem miRNA og mRNA-aktivering i hvilende celler bidrager til den forbedrede overlevelse i disse fag, men da nogle af disse gener har onkogene egenskaber (

MYC

,

MYB

, og

IGF1R

) eller er relateret til DNA transskription og cellulær differentiering (

KAT2B

,

HOXB7

,

HOXB8

,

HOXA7

,

HoxA9

, og

HOXA10

) det er sandsynligt, at mange faktorer påvirker den samlede genekspression i cellen og den efterfølgende effekt på overlevelse. Også, fordi alle de miRNA forbundet med ændret risiko og mRNA-ekspression er fra forskellige sædgrupper, er det usandsynligt, at frø binding alene bidrager til denne begivenhed.

Denne undersøgelse evaluerer kun CRC væv. Mens vi mener, at frøet regioner bør opføre sig på samme måde i andre væv, har miRNA ekspression blevet vist at være vævsspecifik og dette kan begrænse generalisering af disse resultater som anvendt på andre vævstyper. Der er mange mulige faktorer, der kan også påvirke miRNA-mRNA binding. Da vi var interesseret i, hvordan frø region længde påvirket miRNA binding, mRNA-ekspression, og overlevelse i CRC patienter, er der nogle potentielt relevante elementer, som vi ikke overveje i denne undersøgelse. Disse påvirkninger på miRNA-mRNA binding omfatter: andre elementer microRNA-anerkendelse (MREs), AU komposition og AU-rige elementer (Ares) og andre påvirkninger på stedet tilgængelighed, 3 ‘(af miRNA) kompenserende bindende, GC-indhold af frø region, om frøene sekvensen er bevaret, og afstanden fra stopcodonen i og placering nær slutningen af ​​3’UTR af mRNA’et [1, 2, 15, 28]. Derudover kan det være, at nogle miRNA primært interagerer med mRNA’er via deres 3’-ende, eller udviser ikke-kanonisk bindingssteder (som undertiden i litteraturen afbildet som frø, der er 6 nukleotider lang i stedet for 7 eller 8), manifesteret ved buler eller enkeltstrenget nukleotid sløjfer i frøet regioner, eller binde i midterområdet af miRNA [16]. Disse variationer på miRNA-mRNA binding ikke blev undersøgt i denne undersøgelse, og som sådan nogle interaktioner kan blive savnet. Endelig, som tidligere nævnt, den 7α-mer (beskrevet andetsteds som 7-mer-A1) og 8-mer frø er i nogle undersøgelser afbildet som dem, der har en adenin i position ét. Vi har ikke beregne frø regioner på denne måde, i stedet fandt vi præcis, Watson-Crick, matcher mellem miRNA frø og mRNA. Fordi denne skelnen anvendes typisk til mRNA target forudsigelse, og vi kun kiggede for frø kampe i mRNA, der var eksperimentelt verificeret som mål for miRNA, der differentielt udtrykte, føler vi ikke, at dette er en ulempe for vores undersøgelse. Nogle af miRNA, dem, der begynder med en uracil, har komplementære sekvenser, der begynder med en adenin, og som sådan vores datasæt indeholder nogle 7a-merer og 8-mer, der gør følge denne standard, og andre, der følger den bredere Watson-Crick parring . Den tilgang, vi tog i undersøger frø region ligheder så på perfekt matching og forsætligt polariseret datasættet ved kun at analysere miRNA optræder i en frø kategori. Mens dette blev gjort for at begrænse sammenligninger og gøre fortolkning af resultaterne lettere, kunne det være, at denne tilgang ikke er hensigtsmæssig for den ønskede analyse. Det er muligt, at en tilgang, der bestemmer en konsensus sekvens eller sekvenser og giver mulighed for miRNA til at være i flere grupper ville være bedre, og vi opfordrer andre undersøgelser for at undersøge dette.

Konklusioner

Vi hypotese, at de miRNA tilhører de længere sædgrupper, dvs. i de 7 og 8-seed kategorier, ville omfatte størstedelen af ​​resultaterne for mRNA differentiel ekspression samt for overlevelse, på grund af deres foreslåede kapacitet til mRNA undertrykkelse. Mens mange miRNA blev differentielt udtrykt mellem karcinom væv og normal kolorektal slimhinde, var forbundet med risiko for at dø efter en diagnose med endetarmskræft, eller var forbundet med differentiale mRNA-ekspression, frø region længde ikke påvirke disse foreninger. Vores resultater kan blive påvirket af den måde, hvorpå vi bestemt frø region, og som miRNA at inkludere i analysen. Vi fandt, at miRNA, der var direkte forbundet med colon-mRNA-ekspression øget overlevelse fra rektal cancer, og dem, der blev omvendt forbundet med colon-mRNA-ekspression øget risiko for at dø af CRC. På grund af det lille antal miRNA, der var forbundet med CRC overlevelse, opfordrer vi andre undersøgelser for at undersøge denne dynamik.

Støtte Information

S1 Table. Oversigt over miRNA resultater og frø region gruppe

doi:. 10,1371 /journal.pone.0154177.s001

(DOCX)

Tak

Indholdet af dette manuskript er alene den forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis den officielle visning af National Cancer Institute. Vi vil gerne anerkende dr Bette Caan og Kaiser Permanente Medical Research Program til prøve bidrag, Erika Wolff og Michael Hoffman for miRNA behandling, Brett Milash og Bioinformatik delte ressource for Huntsman Cancer Institute og University of Utah for miRNA og mRNA bioinformatik databehandling, og Sandie Edwards for hendes indsats i den samlede undersøgelse overvågning og tumorvæv kollektion.