PLoS ONE: Størrelse-Based Berigelse af ekspanderet tumorceller i urin øger følsomheden for DNA-baseret detektion af Blære Cancer

Abstrakt

Blærekræft diagnosticeres ved cystoskopi, en kostbar og invasiv procedure, der er forbundet med patient ubehag. Analyse af tumor-specifikke markører i DNA fra sedimenter af udtømt urin har potentiale til ikke-invasiv påvisning af blærekræft; imidlertid følsomheden begrænset af lave fraktioner og lille antal tumorceller afstødes i urinen fra lav-grade tumorer. Formålet med denne undersøgelse var at forbedre følsomheden for ikke-invasiv detektion af blærekræft efter størrelse baseret opsamling og berigelse af tumorceller i urinen. I en split-prøve opsætning, urin fra en konsekutiv serie af patienter med primære eller tilbagevendende blæretumorer (N = 189) blev behandlet ved mikrofiltrering under anvendelse af et membranfilter med en defineret porestørrelse, og sedimentering ved centrifugering, hhv. DNA fra prøverne blev analyseret for syv blære tumorassocierede methylering markører ved hjælp MethyLight og pyrosekventering assays. Fraktionen af ​​tumor-afledt DNA var højere i filter prøver end i de tilsvarende sedimenter for alle markører (

s

0,000001). På tværs af alle tumor faser, antallet af tilfælde er positive for en eller flere markører var 87% i filterprøver sammenlignet med 80% i de tilsvarende sedimenter. Den største stigning i sensitivitet blev opnået i lav kvalitet Ta tumorer, med 82 ud af 98 tilfælde positive i filteret prøver (84%) versus 74 ud af 98 i sedimenter (75%). Vores resultater viser, at præ-analytisk behandling af udtømt urin efter størrelse-baserede filtrering kan øge følsomheden for DNA-baseret påvisning af blærekræft

Henvisning:. Andersson E, Steven K, Guldberg P (2014) størrelse- baseret Berigelse af ekspanderet tumorceller i urin øger følsomheden for DNA-baseret detektion af blærekræft. PLoS ONE 9 (4): e94023. doi: 10,1371 /journal.pone.0094023

Redaktør: Ludmila Prokunina-Olsson, National Cancer Institute, National Institutes of Health, USA

Modtaget: 23. oktober 2013; Accepteret: 12 Marts 2014; Udgivet: 14 April, 2014

Copyright: © 2014 Andersson et al. . Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: yde støtte : The Candy Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft er den syvende mest almindelige kræftform i verden og tegner sig for mere end 150.000 dødsfald hvert år [1]. Mere end 90% af blæretumorer er overgangsordninger celle karcinomer (også kaldet urotelial karcinom) følger af de urothelial celler foring af blæren. Typiske symptomer på blærekræft er mikroskopiske og makroskopiske hæmaturi, smertefuld vandladning og polyuri. Men ingen af ​​disse symptomer er specifik for sygdommen, og kan være forårsaget af en række andre tilstande, herunder cystitis, nyresten og prostata sygdom. Den gyldne standard til diagnosticering blærekræft er transuretral resektion af blæren tumor (TURBT). De fleste patienter er diagnosticeret med non-invasiv blærekræft (stadie Ta), der har en fem-års overlevelse på 90%. gentagelse sats er dog høj (50-70%) og 10-25% fremgang til invasiv blærekræft, berettiger langsigtet opfølgning fra cystoskopi hos patienter med ikke-invasive tumorer [2] – [4]. Cystoskopi er en invasiv metode, der er ubehageligt for patienterne og kræver store tekniske og økonomiske ressourcer. Det er derfor vigtigt at udvikle ikke-invasive metoder, der er enkle og omkostningseffektive for diagnosticering og opfølgning af blærekræft.

bortfalder urinprøver fra patienter med blæretumorer indeholder normalt afstødes tumorceller, der kan detekteres ved cytologisk analyse. Urincytologi er en ikke-invasiv metode, der har en høj specificitet, men en lav følsomhed ( 40%), især hos patienter med lav kvalitet tumorer [5], [6]. Mere følsomt ikke-invasiv fremgangsmåde til påvisning af blærecancer er baseret på analyse af tumorspecifikke ændringer i DNA isoleret fra urin sedimenter. Kromosomale tab og somatiske mutationer i specifikke gener såsom

FGFR3

TP53

har alle været anvendt med succes som biomarkører til detektering af forskellige stadier af blærekræft [7] – [9]. I de senere år har afvigende hypermethylering ved promotor- CpG-øer blevet vist at forekomme ofte og tidligt i udvikling af cancer og kan endog gå forud genetiske ændringer, såsom mutationer og genomisk omlejring i cancerogenesis [10]. Flere undersøgelser har rapporteret hypermethylering af promoter CpG øer i blæretumorer (revideret i Refs [11] – [13].) Og kan påvises disse ændringer i urin sedimenter fra blæren kræftpatienter [14], [15]. Der er ingen enkelt DNA-methylering markør, der definerer alle typer blære tumor, og de fleste undersøgelser har anvendt et panel af markører til påvisning af blærecancer i kliniske prøver. Følsomheden og specificiteten af ​​DNA-baserede blære tumor detektion varierer betydeligt på tværs af studierne, hvilket kan henføres til valg af markører og metoder til at vurdere disse markører, samt forskelle i repræsentationen af ​​de forskellige tumor faser i patientkohorter [16] – [23].

i undersøgelser, hvor parrede tumorprøver og sedimenter fra urin er blevet analyseret parallelt til det samme panel af DNA-markører, følsomheden af ​​påvisning er konsekvent lavere i urinen [15], [17], [20]. Eksfoliering af tumorceller i urinen afhænger af tumor egenskaber såsom størrelse, scene og kvalitet og viser stor intra-individuel variation [24] også. Især små ikke-invasive tumorer er mindre tilbøjelige til at kaste nok celler i urin, der skal detekteres i efterfølgende analyse. Derudover kan urin fra blærecancerpatienter indeholde et øget antal andre celletyper, herunder hvide blodlegemer, hvilket kan påvirke følsomheden af ​​sediment analyse. Derfor er en metode, der muliggør en berigelse af tumorceller i urinprøver kan øge robusthed og følsomhed til ikke-invasiv påvisning af blærecancer.

Tumorceller afledt af epitelceller er generelt større end hvide blodlegemer, og denne størrelse forskel kunne potentielt udnyttes til berigelse for tumorceller i heterogene biologiske prøver, såsom urin. Tidligere undersøgelser har anvendt filtre for størrelse-baserede isolation af sjældne cirkulerende tumorceller (CTCs) i perifert blod [25], [26]. Ideen om at fange celler i urin på et filter blev indført mere end tredive år siden [27], og senere undersøgelser har udnyttet membranfiltre til fremstilling af epitelceller fra urin til påvisning af urothelial carcinoma ved cytologi eller fluorescens in situ hybridisering (FISH) analyse [28] – [30]. I denne undersøgelse har vi testet en enkel og omkostningseffektiv fremgangsmåde til præ-analytisk urin filtrering for at forøge den del af tumorceller og dermed følsomheden for DNA-baseret detektion løbet ufiltrerede sedimenter. I et split-prøve opsætning blev urinprøver fra patienter blærekræft vurderet for tilstedeværelse af tumor-DNA med et panel af methylering markører ofte fundet i blærekræft. Fraktionerne af methylerede alleler blev kvantificeret i sedimenterede og filtrerede prøver ved MethyLight assays og pyrosekventering. Vi fandt, at denne filtrering metode øget den del af tumor-afledt DNA og også forbedret følsomhed og robusthed blære tumor afsløring fra urinprøver.

Materialer og metoder

Etik Statement

undersøgelsen blev godkendt af Københavns Komité, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter og kontroller ved inklusion.

Indsamling af urinprøver

bortfalder morgen urinprøver blev indsamlet fra blæren kræftpatienter indlagt for TURBT på Rigshospitalet, Herlev, Danmark, mellem juni 2010 og oktober 2011, og fra raske frivillige uden kendte urologiske maligniteter. Prøverne blev sendt til det danske Kræftens Bekæmpelse og behandles inden for 4-6 timer efter tømning.

Behandling af urinprøver

Halvtreds milliliter af hver urinprøve blev sedimenteret ved centrifugering ved 2000 g i 10 min . Pelleten blev vasket i phosphatpufret saltvand (PBS) efterfulgt af yderligere 10 minutters centrifugering. Supernatanten blev kasseret, og pelleten blev resuspenderet i ca. 200 pi PBS. Samtidig blev urin fra den samme prøve trukket ind i en engangssprøjte og ledes gennem en Whatman Nuclepore ætsede spor polycarbonat hydrofil membranfilter (diameter 25 mm) monteret i den tilsvarende filterholder (Whatman, Maidstone, UK). Den urinprøve blev ledt gennem filteret ved positiv kraft, indtil en modstand følte (mætning), med et maksimum på 125 ml. Alle filtre blev skyllet med PBS før fjernelse fra filterholderen. Urin sedimenter og filtre med filter indhold blev opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere forarbejdning.

DNA Isolation og omdannelse med bisulfit

DNA blev isoleret fra urin sediment og filter prøver under anvendelse af Qiagen Mini Prep kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Filterprøver og sedimenter blev inkuberet med ATL puffer og proteinase K ved 56 ° C i mindst en 1 time eller natten over. Efterfølgende behandling blev udført i overensstemmelse med protokollen for DNA oprensning fra væv. DNA fra filtre og sedimenter blev elueret i 50 pi og 100 pi buffer AE henholdsvis og opbevaret ved -80 ° C. DNA-koncentrationen blev målt under anvendelse af et NanoDrop spektrofotometer (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).

bisulfit omdannelse blev udført ved anvendelse af EZ DNA-methylering-Gold Kit (Zymo Research Corp, Orange, CA, USA) i overensstemmelse til fabrikantens protokol. Den bisulfit omdannet DNA blev elueret i 2 × 10 pi M-elueringspuffer og opbevaret ved -80 ° C. For parrede prøver (sediment og filter), blev den samme mængde DNA anvendt, med et maksimum på 500 ng. I tilfælde, hvor DNA-koncentrationen var for lav til at bestemmes nøjagtigt ved hjælp af NanoDrop spektrofotometer blev den maksimale prøvevolumen (20 pi) anvendes. Normalt humant blæreepitelet afledt fra en 66 år gammel mand blev indkøbt fra Capital Biosciences (Rockville, MD, USA).

Cell Culture

T24-cellelinien (DSMZ, Braunschweig, Tyskland) blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% føtalt bovint serum. Lymfocytter blev isoleret fra blod fra en rask donor væsentlige som beskrevet [31] og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Celler i enkelt-cellesuspension blev talt og målt under anvendelse af en grevinde Automated Cell Counter (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). De to celletyper blev blandet i de angivne forhold og behandles ved centrifugering og filtrering som beskrevet ovenfor for urinprøver.

denatureringsgradient gelelektroforese

Mutation analyse af

HRAS

exon 2 ved denaturerende gradient-gelelektroforese (DGGE) blev udført i det væsentlige som beskrevet [32]. Primersekvenser og PCR-betingelserne er anført i tabel S1. PCR-produkter blev sat på en 0% denatureringsmiddel /6% polyacrylamid-90% denatureringsmiddel /9% polyacrylamid dobbelt-gradient gel [33]. De geler blev kørt ved 170 V i 4,5 timer i TAE buffer holdes ved en konstant temperatur på 58 ° C, farvet med ethidiumbromid og fotograferet under UV-gennemlysning.

MethyLight

Real-time kvantitativ methyleringsspecifik PCR (MethyLight; Ref. [34]) blev udført i det væsentlige som beskrevet [20]. Primer og probesekvenser er anført i tabel S1. Reaktioner blev udført på LightCycler 480 platformen ved hjælp LightCycler 480 Probes Master Kit (Roche, Mannheim, Tyskland) og 1 pi behandlet med bisulfit DNA pr reaktion. Specificiteten af ​​hvert assay blev etableret ved hjælp af

in vitro

methylerede DNA (IVM; CpGenomeTM Universal Methyleret DNA, Chemicon /Millipore, Billerica, MA) og DNA fra udvalgte cancer cellelinjer som positive og negative kontroller til methylering, henholdsvis og vand og ikke-bisulfitbehandlet genomisk DNA som negative kontroller til amplifikation. En MethyLight assay for

ALUC4

og en fortyndingsserie af IVM blev anvendt til at bestemme DNA-koncentrationen af ​​prøven efter bisulfitbehandling [20], [35]. Sager blev kasseret, hvis en af ​​de parrede sediment eller filter prøver var koncentrationen under hvad der svarer til 0,25 ng /pl non bisulfit-behandlet DNA. Methylering niveauer blev beregnet som procent methyleret reference (PMR, Ref. [35]) ved at normalisere markør-specifikke reaktion værdier til

ALUC4

værdier i forhold til de samme værdier for fuldt methyleret kontrol (IVM). De små mængder af udgangs-DNA for mange af prøverne begrænset antallet af markører, der kunne afprøves, og alle analyser blev udført som enkelte reaktioner. Den methylering niveau baggrund for hver markør blev bestemt ved hjælp af DNA fra sedimenterede og filtrerede urinprøver fra 11 raske kontrolpersoner samt humant genomisk DNA (Roche, Mannheim, Tyskland). De afskårne PMR værdier var 3 for

HoxA9

, 2 for

POU4F2

, 0,5 for

SALL3

og 2 for

VIM2.

Pyrosequencing

Pyrosequencing assays til

HRAS

p.G12V (c.35G T) mutation og

BCL2

promotor methylering blev designet ved hjælp af PyroMark assay design software (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). Primersekvenser og PCR-betingelserne er anført i tabel S1. PCR blev udført i et slutvolumen på 25 pi indeholdende PCR-puffer (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland), 200 uM af hver dNTP, 0,4 uM hver primer og 1 U Taq HotStarTaq DNA Polymerase (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). Pyrosekventering blev udført på et PyroMark Q24 platform, ved hjælp PyroMark Gold Q24 Reagenser (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). Analyse af resultaterne blev udført med PyroMark Q24 software (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). Gennemsnitlige methylering niveauer for

BCL2

blev beregnet for de syv CpG sites indgår i analysen. Baggrundssignalet for

BCL2

methylering assay blev fastsat til 5% baseret på en analyse af bisulfit-behandlet humant genomisk DNA (Roche, Mannheim, Tyskland). For

BCL2

methylering analyse, kun kliniske prøver med en koncentration svarende til 5 ng /pl non bisulfit-behandlet DNA eller mere blev inkluderet.

Resultater

Capture og berigelse blære tumorceller på et membranfilter

for at teste evnen af ​​membranfiltre til at indfange blære tumorceller, vi først brugt et modelsystem designet til at ligne urinprøver indeholdende lave fraktioner af tumorceller. Et eksperiment er vist i figur 1. Oprensede dyrkede perifere blodlymfocytter (diameter 7-8 um) blev tilsat 0,5% T24 blære cancerceller (diameter 16-17 um). En del af denne celleblanding blev sedimenteret ved centrifugering, mens resten blev ledt gennem et membranfilter med en porestørrelse på 8 um (figur 1A). Gennemstrømningen fra filteret blev også opsamlet og sedimenteret ved centrifugering. For at vurdere, om filtrering forøger den del af tumorceller i prøven, DNA blev isoleret og analyseret for to tumorspecifikke ændringer forekommer i T24-celler;

HRAS

p.G12V mutation og hypermethylering af

BCL2

promotor. Figur 1B viser den fysiske opløsning af mutant og vildtype

HRAS

alleler ved hjælp af DGGE, som har en afsløring niveau på ca. 2% [36]. Mutanten

HRAS

allel var helt detekterbar som homo- og heteroduplexer i filteret prøven, men ikke i sedimentet eller gennemstrømning prøver (figur 1b). Kvantitativ analyse af de samme prøver ved hjælp pyrosekventering viste en stigning i forholdet mellem mutant (T) i løbet af vildtype (G)

HRAS

alleler fra 3-4% i sedimentet og gennemstrømning prøver til 19% i filteret prøve (figur 1C og data ikke vist). Bisulfit pyrosekventering viste en tilsvarende stigning i den del af

BCL2

hypermethyleret alleler, specifikt for T24 celler efter filtrering (Figur 1D).

(A) Skematisk tegning af split-sample eksperimentel sæt -op. Urinprøve eller cellesuspensionen opdelt i to og underkastet centrifugering og filtrering, hhv. DNA fra celler i sediment eller fanget på filteret derpå isoleret og analyseret for tumorspecifikke markører. (B) Påvisning af

HRAS

p.G12V mutation af DGGE. Cellelinien T24 er homozygot for mutante allel. Sediment og gennemstrømning prøver kun vise vildtype allelen, mens filteret prøven viser både muterede og vildtype alleler. Heteroduplexer er hybrid molekyler, der består af en mutant streng og en vildtype streng. (C) Pyrographs viser fordelingen mellem vildtype (G) og mutant (T)

HRAS

alleler i sedimentet og filter prøver. (D) Pyrographs af

BCL2

promoter CpG ø methylering analyse i sedimentet og filter prøver. De individuelle bindingssteder for CpG i målregionen er angivet med mørkegrå skravering, og procentdelen af ​​methylerede alleler (C) er angivet på hvert site.

For at teste filtreringsmetode i et klinisk miljø, urin prøver blev opnået fra 15 patienter blærekræft optaget til TURBT. I denne serie af prøver, vi også vurderet, om porestørrelsen kan påvirke forholdet mellem tumorceller til normale celler. Fra hver urinprøve blev 50 ml fremstillet ved centrifugering, mens den resterende mængde blev delt ligeligt og passeret gennem to filtre med porestørrelser på 8 um og 10 um, hhv. DNA blev isoleret fra alle urin sedimenter og filter prøver og undersøges for

BCL2

methylering ved hjælp af en meget specifik og følsom MethyLight assay. Syv ud af de 15 urinprøver var positive for denne markør, i overensstemmelse med tidligere rapporter, som viser

BCL2

hypermethylering i en stor procentdel af blæretumorer [16], [22]. For at estimere den del af tumor-afledt DNA blev methylering niveauer beregnet for

BCL2

-positive prøver ved hjælp af normaliserede værdier (PMR). Der var kun en lille forskel i methylering niveauer mellem 8 og 10 um filtre, med lidt højere niveauer i 8 um filter (tabel S2). Kvantitativ analyse af

BCL2

methylering ved Pyrosekventering bekræftede resultaterne af MethyLight analyse (figur 2). Især alle filter prøver (både 8 um og 10 um) viste højere

BCL2

methylering niveauer end de tilsvarende sedimentprøver, hvilket indikerer en højere fraktion af tumorceller.

Gennemsnitlige methylering niveauer af

BCL2

promoter CpG ø i urinprøver fra syv patienter blærekræft, som bestemt af pyrosekventering. Sediment og to filter prøver (8 og 10 um porestørrelse, henholdsvis) blev fremstillet fra hver urinprøve. Sedimentet prøve fra patient 2 mangler på grund mislykkedes DNA-ekstraktion.

Urin Filtrering Øger Fraktion af Tumor DNA i kliniske prøver

have opnået bevis for princippet om, at membranfiltre kan fange og berige for blære tumorceller i urinprøver, vi foretaget en klinisk undersøgelse af 220 konsekutive blære tumor patienter. Demografiske og klinisk-patologiske karakteristika ved disse patienter er anført i tabel S3. Der var et lige stort antal patienter med primære og tilbagevendende tumorer i denne kohorte. Morning urinprøver blev opsamlet og bearbejdet i overensstemmelse med split-prøve design illustreret i figur 1A, ved anvendelse af en 8 um filter. DNA blev isoleret fra alle urin sedimenter og filterprøver og behandlet med natriumbisulfit. Koncentrationen af ​​bisulfit-behandlet DNA i hver prøve blev bestemt ved anvendelse af et MethyLight assay for

ALUC4

. Tredive-én parrede prøver blev kasseret på grund af lav DNA udbytte (tabel S3).

Screening af alle 189 parrede prøver til

BCL2

methylering af MethyLight analyse identificeret 121 sager er positive for denne markør (eksempler er vist i figur 3A). I 60 af disse sager, både filtrer og sedimentprøver indeholdt tilstrækkelige mængder af DNA for pålidelig kvantitativ analyse ved pyrosekventering (figur 3B). I 18 ud af 60 sager, den gennemsnitlige

BCL2

methylering niveau var under baggrunden signal til pyrosekventering i både sediment og filter prøver. Af de resterende 42 tilfælde, 29 (69%) viste højere methylering niveauer i filteret prøve sammenlignet med sedimentprøven, fem tilfælde (12%) viste lige methylering niveauer ( 2 procentpoint forskel) og otte tilfælde (19% ) viste højere methylering niveauer i sedimenterne end i de tilsvarende filtre (figur 3C). Det gennemsnitlige methylering niveau var 28% i filter prøver sammenlignet med 21% i sedimenter (

s

0,001, parret t-test). Stigningen i methylering niveauer fra sediment at filtrere varierede fra 3 til 35 procent point, med en medianværdi på 10 procentpoint. Kvantitativ analyse af alle 121 sager er positive for

BCL2

methylering hjælp normaliserede værdier (PMR) fra MethyLight analyse viste et gennemsnitligt methylering niveau på 10,0% i sedimentprøverne og 14,4% i de filter prøver, med median niveau stigende fra 1,6% til 4,0% (figur 4;

s

0,001, parret t-test)

(A) Eksempler på MethyLight analyse af

BCL2

promotor. CpG ø methylering. I patient A, amplifikation ses i filteret prøven, men ikke i sedimentprøven. I patient B, er amplifikation ses i begge prøver; dog med en højere Ct værdi for sedimentprøven. (B) Eksempler på

BCL2

promoter CpG ø methylering analyse ved pyrosekventering i parrede prøver. Gennemsnitlig methylering niveau beregnes for de syv individuelle CpG sites analyseret (angivet med mørkegrå skravering). Den gennemsnitlige methylering niveau i sedimentet prøven fra patient B var under baggrundssignalet for pyrosekventering, i modsætning til MethyLight assay (A), der viser forskellen i analytisk følsomhed mellem de to assays. (C) Gennemsnitlige methylering niveauer for parrede prøver som fastsat af pyrosekventering. Vist er resultaterne for de tilfælde, hvor mindst én af de parrede prøver viste signaler over baggrunden for pyrosekventering (N = 42).

Vist er medianen af ​​normaliserede værdier (procent denatureret reference, PMR) fra MethyLight analyse af syv methylering markører. For hver markør, de methylering niveauer varierede fra 1% til 100% (ikke vist). *, P 0,05; **, P. 0,01

For at analysere prøver negative for

BCL2

methylering, vi udvidet MethyLight-baserede analyse af yderligere seks promoter CpG øer tidligere er rapporteret at være hyppigt hypermethyleret i blærekræft, herunder

CCNA1

,

EOMES

,

HoxA9

,

POU4F2

,

SALL3

VIM2

[16], [18], [23]. Vi har valideret disse markører sammen med

BCL2 Salg i et panel af 51 blæretumorer repræsenterer forskellige tumor stadier (22 low-grade Ta tumorer, 2 høj kvalitet Ta tumorer, 8 T1 tumorer, 17≥T2 tumorer og 2 Tis ). Hver af disse markører var positiv i 45% af tumorerne i dette panel, og 48 af tumorerne (94%) var positive for mindst én markør. Tumor specificitet markørerne blev bekræftet ved analyse af normal blære væv

Kvantitativ analyse af alle syv DNA methylering markører viste en stigning i methylering niveauer i filter prøver sammenlignet med sedimenter (Figur 4;.

p

0.000001, parret t-test). Denne forskel var også statistisk signifikant for nogle enkelte markører, herunder

BCL2

,

HoxA9

VIM2

(figur 4).

Urin Filtrering Øger følsomhed for påvisning af blærekræft

Vi endelig rettet, om de øgede fraktioner af tumor-afledte DNA opnås ved urin filtrering kan påvirke følsomheden for detektion af blærekræft. For at bestemme niveauerne af baggrunden methylering for hver af de syv markører, undersøgte vi DNA fra filtrer og sediment urinprøver fra 11 raske kontroller såvel som DNA fra perifere blodlymfocytter. Late-cycle forstærkning blev lejlighedsvis observeret for fire af de markører (

HoxA9

,

POU4F2

,

SALL3

VIM2

), hvoraf nogle var opretholdt ved gentagne analyser. På grundlag af disse data blev en afskæringsværdi defineret for hver af disse markører, over hvilken en prøve blev anset positiv.

BCL2, CCNA1

og

EOMES

viste ikke nogen baggrund methylering.

Med positivitet defineret som hypermethylering af mindst en af ​​de syv markører, følsomheden på tværs af alle tumor etaper var 80% (152/189) i urinen sedimenter, mens det var 87% (164/189) i filteret prøverne. Dette mønster var klart også for individuelle markører, der alle viste en højere følsomhed i filteret prøver (figur 5). Markøren viser den højeste følsomhed var

VIM2

, som var positiv i 56% af sedimentprøverne og 67% af filter prøver. De seks andre markører havde følsomhed på 35-53% i sedimenter og 43-62% i filtre. Følsomheden for højere-trins tumorer (≥T1) var generelt høj ( 90%) i sedimenter og var kun lidt, om end konsekvent, steg efter filtrering. Især blev der imidlertid en dramatisk effekt ses for lav kvalitet Ta tumorer, hvor følsomheden steget fra 75% (74/98) i sedimenter til 84% (82/98) i filtre (tabel 1). Blandt de 95 primære tumorer, 80 (84%) blev påvist i sedimentet og 84 (88%) blev påvist i filteret. Blandt de 94 tilbagevendende tumorer, blev påvist 73 (78%) i sedimentet og 80 (85%) blev påvist i filteret.

Vist er de procentdele prøver positive for de syv DNA-methylering markører. Den sidste kolonne ( “Alle”) viser den procentdel af prøver positive for en eller flere markører.

Diskussion

Ikke-invasive analyser, der kan præcist og pålideligt registrere blære kræft vil have en væsentlig indvirkning på patienterne og sundhedsvæsenet ved at reducere behovet for hyppige, dyre og ubehagelige cystoskopi. Der er gjort betydelige fremskridt med at identificere urin-baserede biomarkører, der kan udkonkurrerer urin cytologi, og nogle af disse markører er blevet udviklet til kommercielle tests. Alligevel udfordringer i at nå følsomheden af ​​cystoskopi [37] – [39]. Målet med denne undersøgelse var at øge følsomheden for DNA-baseret påvisning af blærecancer i urinprøver gennem en simpel filtrering procedure, for at berige for tumorceller. I en stor træk kohorte af blære tumorpatienter, har vi testet en kommerciel ætsede spor polycarbonat filter med en porestørrelse på 8 um og sammenlignet det med standard urin sediment analyse. Kvantitativ analyse over et panel af syv DNA methylering markører udviste signifikant forhøjede niveauer af tumor-DNA i filtrerede urinprøver sammenlignet med de tilsvarende sedimenter, hvilket antyder, at filteret indfanger blæren tumorceller fortrinsvis i forhold til andre celler til stede i urinen. Vigtigst, filtrering procedure identificeret et større antal prøver fra blære tumor patienter som positiv, hvilket resulterer i en samlet diagnostisk sensitivitet på 87% i filter prøver sammenlignet med en følsomhed på 80% i de tilsvarende sedimenter.

Lav -Grade, lav-trins blæretumorer repræsenterer den største udfordring i urin-baseret detektion tilgange, herunder standard cytologi og FISH, da disse tumorer tendens til at kaste lavere antal celler i urinen [40], [41]. Denne begrænsning var også tydeligt i vores DNA tilgang, hvor følsomheden i urin sedimenter var tæt på eller over 90% for fase ≥T1 tumorer, mens det kun var 75% for lav kvalitet Ta tumorer. Interessant filtrering af urinprøver øget følsomhed for lav kvalitet Ta tumorer til 84%, hvilket antyder, at denne procedure kan afhjælpe nogle af vanskelighederne ved detektering disse tumorer. Blandt de i alt 189 patienter undersøgt, 16 tilfælde var negative for alle methylering markører i både filtrer og sedimentprøver, og 13 af disse havde høj eller lav kvalitet Ta tumorer. Vi [20] og andre [42] har tidligere vist, at en delmængde af overfladiske blæretumorer vise lave hypermethyleringsassocierede begivenheder. Interessant, disse tumorer viser i stedet relativt høje aktivering

FGFR3

mutationer [20] og derfor, at kombinationen af ​​methylering markører og

FGFR3

mutationer kan øge følsomheden for detektion af overfladiske tumorer i en diagnostisk indstilling [20], [43]. Vi begrænset vores analyse til én type markør (DNA hypermethylering) for at give en ensartet og sammenlignelig kvantitativt mål for at vurdere de to procedurer for udarbejdelse af diagnostiske celler (filtrering og sedimentering), hvilket var det vigtigste formål med vores undersøgelse. Endvidere har vi kasseret et relativt stort antal prøver (14%) på grund af lav DNA udbytte, kan bringe den kvantitative analyse. Men disse prøver kunne godt have været kvalitativt testet for methylering af DNA markører i et diagnostisk indstilling.

Som op til 70% af patienter med non-invasiv blærekræft vil opleve tilbagefald, ikke-invasive urinprøver er meget ønskeligt for tilbagefald overvågning. Halvdelen af ​​patienterne i vores kohorte præsenteret med en tilbagevendende tumor, og i denne gruppe, som for patienter med primære tumorer, urin filtrering gav en højere følsomhed end sedimentering (85% vs. 78%). Disse data antyder, at urin filtrering også kan forbedre diagnose af blærecancer tilbagefald, som kan være særligt nyttige som tilbagevendende tumorer ofte er mindre og kaste færre celler end primære tumorer. Alligevel kan denne procedure ikke afhjælpe andre begrænsninger af DNA-methylering baseret gentagelse tilsyn, herunder højpositive blandt cystoskopi-negative tilfælde, som kan være forårsaget af epigenetiske ændringer i normalt udseende urothelium (epigenetisk felt defekt) [44], [ ,,,0],45].

En indlysende kritisk parameter for størrelse-baseret berigelse af tumorceller i biologiske prøver er porestørrelsen af ​​filteret. Ideelt set bør porerne være store nok til at udelukke normale celler og lille nok til at bevare tumorceller, under hensyntagen til deformerbarhed af celler under tryk. Tidligere undersøgelser med sigte på at berige sjældne CTCs i blod ved filtrering konstateret, at en 8 um porestørrelse forarmet prøver af 99,9% af leukocytter og samtidig bevare 85-100% af carcinomaceller [25], [46]. Med en større porestørrelse (12-14 um), færre leukocytter, men også betydeligt færre carcinomceller (ned til 18%), blev tilbageholdt på filteret [46]. Anvendelse af et kommercielt track-ætset polycarbonat filter med en porestørrelse på 8 um, hvilket svarer til filtrene anvendt i disse tidligere undersøgelser, var vi i stand til at berige den del af tumorceller i urinprøver.