PLoS ONE: IPA-3 hæmmer væksten af ​​leverkræft Cells ved at undertrykke PAK1 og NF-KB Activation

Abstrakt

hepatocellulært carcinom (HCC) er en af ​​de store maligniteter verdensplan og er forbundet med dårlig prognose på grund de høje forekomster af metastase og tumor tilbagefald. Vores tidligere undersøgelse viste, at overekspression af p21-aktiveret protein kinase 1 (PAK1) ofte observeres i HCC og er forbundet med en mere aggressiv tumor adfærd, hvilket antyder, at PAK1 er et potentielt terapeutisk mål i HCC. I den aktuelle undersøgelse, et allosterisk lille molekyle PAK1 inhibitor, IPA-3 blev evalueret for potentialet i at undertrykke hepatocarcinogenese. Overensstemmelse med andre rapporter, inhibering af PAK1 aktivitet blev observeret i adskillige humane HCC-cellelinier behandlet med forskellige doser af IPA-3. Brug af celleproliferation, kolonidannelse og BrdU-inkorporering assays demonstrerede vi, at IPA-3 behandling signifikant hæmmede væksten af ​​HCC-celler. De mekanismer, hvorigennem IPA-3 behandling undertrykker HCC cellevækst er forøgelse af apoptose og blokering af aktiveringen af ​​NF-KB. Endvidere vore data antydede, at IPA-3 ikke kun hæmmer HCC cellevækst, men også undertrykker metastatiske potentiale HCC-celler. Nøgne mus xenotransplantat assay viste, at IPA-3 reducerede signifikant tumorvæksthastighed og nedsat tumorvolumen, hvilket indikerer, at IPA-3 kan undertrykke

in vivo

tumorvækst af HCC-celler. Tilsammen vores demonstration af den potentielle prækliniske effekt af IPA-3 i HCC giver rationalet for kræftbehandlingen

Henvisning:. Wong LL-Y, Lam IP-Y, Wong TY-N, Lai WL, Liu HF, Yeung LL, et al. (2013) IPA-3 hæmmer væksten af ​​leverkræft Cells ved at undertrykke PAK1 og NF-KB-aktivering. PLoS ONE 8 (7): e68843. doi: 10,1371 /journal.pone.0068843

Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA

Modtaget: Februar 15, 2013; Accepteret: 3 juni 2013; Publiceret: 19 jul 2013

Copyright: © 2013 Wong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Hongkong Fund Research for Bekæmpelse af smitsomme sygdomme (nr 09.080.782) og Research Grant Råd Hongkong (HKU 7 /CRF /09), The University of Hong Kong (Small Project Funding 201.109.176.021 til LLY Wong og YP ching). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dr. Yick-Pang Ching er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Som den sjette mest almindelige ondartet svulst og den tredje hyppigste dødsårsag kræft på verdensplan, hepatocellulært carcinom (HCC) er ansvarlig for mere end en million dødsfald om året [1]. HCC er forbundet med dårlig prognose på grund af høje forekomster af tumortilbagevenden og metastase [2]. Leverresektion er en af ​​de store behandlinger på nuværende, men fortsat utilfredsstillende på grund af de høje tilbagefald satser [3]. Derfor er udvikling af nye behandlingsregimer for HCC påkrævet.

Overekspression af p21-aktiveret kinase 1 (PAK1) er hyppig i HCC [4]. Det er en nedstrøms effektor af den lille Rho GTPase, herunder Rac1 og Cdc42, som regulerer forskellige cellulære processer, herunder cellecyklusprogression, cellemotilitet, cellepolaritet og apoptose [5]. Aktiveret Rho GTPase binder til Paks på Cdc42 /Rac interaktive binding (CRIB) domæne, hvilket bevirker lindring af autoinhibitory domæne (AID), efterfølgende autophosphorylering af det katalytiske aktivering domæne og kinase [6]. Blandt de multiple autophosphoryleringssites, threonin-423 (T423) er særlig vigtig for at modvirke autohæmning og opretholde den komplette aktiverede tilstand [7].

IPA-3 (2,2′ dihydroxy-1,1′ dinaphthyldisuifide) er en meget selektiv, ikke-ATP-kompetitiv allosterisk inhibitor af PAK1 hvis hyperaktivitet har vist sig at være tæt forbundet med tumorigenese [8]. Tidligere undersøgelser viste, at IPA-3 forhindret Cdc42-induceret PAK1 autophosphorylering på T423 og signifikant hæmmet PAK1 katalytisk aktivitet [8], [9]. Den hæmmende virkning af IPA-3 opnås delvis ved at binde kovalent til det regulatoriske domæne af PAK1 som igen forhindrede den fysiske interaktion med Cdc42 eller andre GTPase aktivatorer [9]. IPA-3-targeting regulatoriske domæne er mindre konserveret inden kinaser, giver således en bemærkelsesværdig høj selektivitet for denne inhibitor [8].

In vitro Salg undersøgelser viste, at IPA-3 behandling førte til tilsvarende resultater som siRNA silencing af PAK1, hvori IPA-3 specifikt blokerede membranen transport af Wave2 og lamellipodia dannelse i humane brystcancerceller [10], og hæmmede endocytiske optagelse af menneskelig adenovirusserotype 35 i forskellige cellelinjer [11]. Imidlertid er virkningen af ​​IPA-3 i den terapeutiske behandling af human HCC stadig dårligt forstået. I denne undersøgelse var det et mål at undersøge potentialet af IPA-3 til at undertrykke proliferation og metastase af humane HCC-celler gennem en række

in vitro

og

in vivo

eksperimenter. Vi viste, at behandling af IPA-3 havde en betydelig indvirkning på apoptose, spredning og motilitet af HCC celler. Desuden IPA-3 var i stand til at undertrykke

in vivo

tumorvækst hos nøgne mus implanteret. Derfor er vores data giver støttende beviser for den potentielle anvendelse af IPA-3 i forvaltningen tumorgenese og metastase af HCC.

Materialer og metoder

Kemi

2,2′ dihydroxy-1,1′-dinaphthyldisuifide (IPA-3) blev syntetiseret og leveret af Dr. LL Yeung i Hongkong Universitet for Videnskab og Teknologi. Strukturen af ​​IPA-3 blev bekræftet ved massespektrometri-analyse. En stamopløsning af IPA-3 (100 mM) blev frisk fremstillet i DMSO. Andre kemikalier, medmindre specifikt angivne var fra Sigma-Aldrich i den højeste kvalitet.

Cell Kultur

menneskelige HCC celler H2M, H2P og det menneskelige ikke-tumorigen, udødeliggjort lever linje Miha var fra Dr. XY Guan, Afdeling for Klinisk Onkologi, University of Hong Kong, Pokfulam, Hongkong [12]. MHCC97L og MHCC97H celler fra Liver Cancer Institute, Fudan University, Shanghai, Kina [13]. HepG2 og Hep3B celler blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC). SMMC-7721 og Bel-7402 var gaver fra Shanghai Institute for Biokemi og Cellebiologi, Chinese Academy of Sciences. Alle celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle minimalt essentielt medium (DMEM) med højt glucoseindhold suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 1 mM natriumpyruvat og 100 enheder penicillin /streptomycin ved 37 ° C i befugtet 5% CO

2 incubator.

MTT assay

Fire tusind H2M brønd blev podet i plader med 96 brønde og inkuberet i normal tilstand i 24 timer. Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af IPA-3 til 1 og 2 dage. Celler blev behandlet med 100 pi 5 mg /ml (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) (Invitrogen) opløsning i 4 timer ved 37 ° C, indtil krystaller var dannet. MTT-opløsning blev fjernet fra hver brønd og 100 pi DMSO blev tilsat til hver brønd for at opløse krystallerne. Color intensitet blev målt ved Microplate Reader (Bio-Rad) ved 570 nm. hvert forsøg bestod af fire replikationer og mindst tre uafhængige forsøg blev udført.

celleproliferationsassay

fremgangsmåden for proliferation assay er tidligere blevet beskrevet [4]. Den bedste pasform vækstkurven og fordoblingstid blev beregnet ved anvendelse af GraphPad Prism 5 (GraphPad Software , Inc., San Diego, CA). Kort fortalt, H2M (1 × 10

4), H2P (1 × 10

4), HepG2 (2 × 10

4), MHCC97L (1 × 10

4) eller Miha (2 × 10

4) celler blev udpladet på plader med 6 brønde indeholdende komplet medium på dag 0. Enten vehikelkontrol (DMSO) eller IPA-3 (5 eller 10 uM) blev tilsat til mediet på dag 1. medier med eller uden IPA-3 blev opdateres på dag 3 og 5. i triplo blev celler trypsinzed og talt under anvendelse celletæller på dag 3, 4, 6 og 7 til opførelse af vækstkurven.

kolonidannelse assay

analysen blev udført som tidligere [14] beskrevne. Kort fortalt blev cellerne podet ved 200 celler per brønd i plader med 6 brønde indeholdende komplet DMEM på dag 0. DMSO eller IPA-3 (5 eller 10 uM) blev administreret til medierne, der blev opdateres to gange om ugen. På dag 14 blev kolonier fikseret med 3,7% formaldehyd i 15 minutter og farvet med 1% krystalviolet før kvantificering.

BrdU-inkorporering assay

Analysen blev udført som tidligere [15] beskrevne. Celleproliferation blev kvantificeret ved den måling af BrdU-inkorporering under DNA-syntese med celleproliferation ELISA, BrdU Kolorimetrisk kit (Roche Diagnostics). Assayet blev udført ifølge producentens manual. Kort fortalt lige antal H2M, H2P, Miha, HepG2 eller MHCC97L celler blev udpladet i 96-brønds plader og serum-udsultet natten over. Serumudsultning induceret celle-cyklus synkronisering, således at størstedelen af ​​cellerne blive i G1 /S overgang lige før S-fasen post. Celler blev derefter behandlet med enten DMSO eller forskellige koncentrationer af IPA-3 (10 og 20 uM) i 15 minutter, efterfulgt af FBS opfyldning og BrdU mærkning til 2, 4 eller 8 timer. Signalet BrdU mærkning blev kvantificeret ved måling af den relative absorbans (Abs

370 nm-Abs

492 nm). Hvert assay blev udført tre gange. Forsøgene blev udført mindst tre gange uafhængigt af hinanden.

Annexin V-7ADD Farvning Assay

Påvisning af apoptotisk celledød blev udført under anvendelse af PE Annexin V Apoptose Detektion Kit I (BD Pharmingen). I tre eksemplarer blev H2M-celler udpladet i 60 mm skål, serum-udsultet natten over og derefter behandlet med DMSO eller IPA-3 (10 eller 20 uM) i medium indeholdende serum i 24 timer. Flydende celler blev vasket bort, medens de bundne celler blev trypsinbehandlet, skyllet og resuspenderet i bindingsbuffer. Efter farvning med annexin V-PE og 7-AAD blev prøver straks analyseret ved flowcytometri. Excitation: 488 nm (annexin V-PE og 7-AAD). Emission: 578 nm (annexin V-PE), 675 nm (7-AAD). Celler blev talt per prøve, og dataene blev analyseret med WinMDI (Version 2.8, Joe Trotter).

konfokalmikroskopi

Efter lægemiddelbehandling blev H2M eller H2P cellerne fikseret i 4% paraformaldehyd i 15 minutter, vasket og permeabiliserede med 0,2% Triton X-100 i PBS i 15 minutter [4], [15]. Objektglas blev farvet med TRITC-phalloidin (Invitrogen) i 10 minutter og immunfluorescens billeddannelse blev fanget i et Carl Zeiss LSM700 konfokalt laserskanningsmikroskop.

Transwell Migration Assay

Transwell migration assay blev udført som beskrevet tidligere [4]. Kort fortalt H2M (1 × 10

5) celler blev udpladet i serum-frit DMEM ved det øvre rum og serum-suppleret medium blev tilsat til den nedre rum i Transwell kammer (Corning). I nærvær eller fravær af IPA-3 (10 pM) blev de serum-udsultede celler lov til at migrere i 24 timer. Cellerne blev derefter fikseret med 3,7% formaldehyd, farvet med 1% krystalviolet og talt under et mikroskopisk felt ved forstørrelse på 40X. Tre forskellige områder blev tilfældigt udvalgt til hver indsats.

Kvantitativ Reverse Transcription-PCR (QRT-PCR)

Serum-udsultede H2M-celler blev behandlet med eller uden IPA-3 forbehandling (10 eller 20 uM, 15 minutter) efterfulgt af TNF-α (10 eller 20 ng /ml, 24 timer), FBS opfyldning og overnatskultur. QRT-PCR blev udført som tidligere beskrevet [4]. Kort beskrevet blev totalt RNA ekstraheret under anvendelse af Trizol (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Totalt RNA blev revers transkriberet til første-streng cDNA under anvendelse PrimeScript RT reagens Kit (Takara, Japan). Real-time qPCR blev udført ved hjælp af SYBR® Green Real Time-system (Takara, Japan) i en My IQTM2 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad). β-actin blev anvendt som en intern kontrol og tilladt normalisering af prøverne. DNA-sekvenser af PCR-primerne er anført i tabel S1. QRT-PCR blev udført tredobbelt og gentaget tre gange.

Western blotting-analyse

Protein ekstraktion og Western blotting blev udført som tidligere beskrevet [4], [15]. Immunoblotting blev gjort for PAK1, P-PAK1 (T423), PARP1, paxillin, P-paxillin (S 178), SAPK /JNK, P-SAPK /JNK (T183 /Y185), kløvet caspase 3 (Cell Signaling Technology), NF KB (Santa Cruz Biotechnology) og β-actin (Sigma-Aldrich) efterfulgt af tilsvarende peberrod-peroxidase (HRP) konjugeret sekundære antistoffer (GE Healthcare). Signaler af målrettede proteiner blev opdaget af Enhanced Chemiluminsence (GE Healthcare). Intensiteter af proteinbånd blev analyseret ved hjælp af Adobe Photoshop CS4.

Nude Mouse xenotransplantat

MHCC97L celler (1 x 10

6) blev injiceret subkutant i den højre flanke af 4 uger gamle mandlige nøgen mus. Tumorstørrelse blev beregnet som tidligere beskrevet [4]. Mus med tumorer med en gennemsnitlig størrelse på 100 mm

3 blev grupperet i behandlingsgrupper kohorter. I alt 15 mus blev anvendt og opdelt i tre grupper (5 mus pr gruppe): Kontrol (DMSO), IPA-3 (2 mg /kg) og IPA-3 (4 mg /kg). IPA-3 blev formuleret i DMSO og administreret tre gange om ugen (TIW) (2 mg /kg eller 4 mg /kg) ved intraperitoneal injektion (i.p.) under undersøgelsen og tumorstørrelsen blev registreret to gange om ugen. Dyreforsøg var blevet specifikt er godkendt af Animal (Kontrol af forsøg) Bekendtgørelse kapitel 340, Department of Health, Hong Kong Special Administrative Region (Ref .: (11-786) i DH /HA P /8/2/3 Pt. 33).

Statistisk analyse

Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og data blev præsenteret som gennemsnit ± SD. Studerendes

t

-test blev anvendt til statistisk analyse, og data fra mere end to grupper blev analyseret ved envejs variansanalyse (ANOVA) i GraphPad Prism 6 efterfulgt af Dunnetts test. Resultaterne blev betragtet som signifikante, når

P

. 0,05

Resultater

IPA-3 hæmmer aktiviteten af ​​PAK1

HCC celler har vist sig at have en høj endogen PAK1 niveau, især i de stærkt metastatiske HCC-cellelinier [4], såsom H2M, men ikke i den ikke-tumorigene, immortaliserede leverceller, Miha (fig. 1A). For at undersøge virkningen af ​​IPA-3 på væksten af ​​H2M-celler, blev MTT-assayet udføres. MTT-analysen viste, at IPA-3 undertrykte proliferation af H2M celler i tids- og dosisafhængige manerer (fig. 1B). Den halve maksimale hæmmende koncentration (IC

50) af IPA-3 i H2M-celler var omkring 28 um og 21 uM på dag 1 og 2, henholdsvis. For at bekræfte den inhiberende virkning af IPA-3 på PAK1 aktivitet, H2M-celler blev serumudsultet og derefter behandlet med IPA-3 i komplet medium natten over. The Western blotting-analyse viste, at IPA-3 dosisafhængigt reduceret phosphorylering niveau af PAK1 (fig. 1C). Konsekvent viste resultaterne IPA-3 forårsager et fald i PAK1 phosphorylering i association med et fald i H2M cellelevedygtighed. Desuden phosphorylering af nedstrøms substrat af PAK1, c-Jun N-terminal kinase (JNK), blev også reduceret, hvilket yderligere understøtte reduktionen af ​​PAK1 kinaseaktivitet af IPA-3 (fig. 1C). Lys mikroskopisk undersøgelse af IPA-3-behandlede celler afslørede markante morfologiske ændringer. Fig. 1D viste morfologiske forandringer i H2M-celler efter behandling med IPA-3. I høje doser af IPA-3 (20 og 40 uM), en signifikant population af H2M-celler blev oprulning og frigøres fra skålen.

(A) Relativ proteinniveauer af PAK1 i forskellige cellelinier. Signalintensiteterne af båndene blev kvantificeret og normaliseret ved at tage dette niveau af Miha som 1. (B) MTT-analyse på dag 1 og 2. H2M-celler (4 × 10

3) podedes på plader med 96 brønde og behandlet med forskellige doseringer af IPA-3. Cellerne blev høstet efter inkubering og MTT-assayet blev udført som nævnt i Materiale og metode. Grafen viste procentdelen af ​​levedygtige celler afbildet over doseringen af ​​IPA-3 (C) Western blotting-analyse af P-PAK1, total PAK1, P-JNK og total JNK. Serum-udsultede H2M-celler blev behandlet med enten DMSO eller IPA-3 ved den angivne koncentration i 15 minutter efterfulgt af FBS opfyldning og overnatskultur. (D) H2M-celler blev serumudsultet og behandlet med IPA-3 (10, 20 eller 40 uM) i komplet medium og lodes vokse natten over. Cellemorfologien billeder blev taget til fange ved en forstørrelse på 40X. Scale bar, 0,4 mm.

IPA-3 hæmmer proliferationen af ​​HCC Celler

For yderligere at evaluere effekten af ​​IPA-3 på HCC celledeling, to primære HCC cellelinjer, HepG2 og H2P, to metastase HCC-cellelinier ,. H2M og MHCC97L, og den ikke-tumorigene, udødeliggjort liver cellelinie, Miha, blev separat behandlet med forskellige doseringer af IPA-3. I celleproliferationsassay, behandling af IPA-3 reduceret antallet af metastatiske HCC-celler (H2M og MHCC97L) og i mindre grad for de primære HCC-celler (HepG2 og H2P), scoret på en dosis-afhængig måde (Fig. 2A ). I modsætning hertil Miha havde den højeste kemoresistens til IPA-3, hvilket antyder, at IPA-3 kunne inhibere hepatom celleproliferation med en lille virkning på normale hepatocytter. For at bekræfte virkningen af ​​IPA-3, blev de samlede cellelysater af H2M-celler opsamlet på dag 7 og testet for PAK1 inhibering ved Western blotting-analyse. Resultatet viste, at IPA-3 behandling markant inhiberede aktiverende phosphorylering af PAK1, hvilket antyder, at IPA-3 inhiberer celleproliferation ved at reducere PAK1 aktivitet (Supplerende fig. S1). Konsekvent, ledsagende reduktion af phosphoryleringen af ​​JNK, downstream mål for PAK1, blev også observeret (Fig. S1). At belyse, om anti-proliferative mekanisme IPA-3 på HepG2, H2P, H2M og MHCC97L celler skyldtes et fald i cellecyklus post, blev BrdU mærkning assay udføres. For at opnå en fremtrædende virkning af IPA-3, 10 pM og en højere dosis (20 uM) blev anvendt til undersøgelsen. Vores data viser, at IPA-3 behandling på de synkroniserede H2M og MHCC97L celler resulterede i en betydelig reduktion i antallet af BrdU inkorporering, i sammenligning med DMSO kontrol i tids- og dosisafhængige manerer (Fig. 2B). Men IPA-3 havde kun en marginal effekt på BrdU iblanding af H2P og HepG2-celler, implicerer, at IPA-3 er meget specifik for de metastatiske HCC cellelinjer. For yderligere at bekræfte virkningen af ​​IPA-3 om bekæmpelse af HCC cellevækst, blev kolonidannelse assayet udført under anvendelse af ikke-tumorigene (Miha), primær (HepG2) og metastatisk (H2M) HCC-celler. Resultatet viste, at IPA-3 hæmmede signifikant væksten af ​​HepG2 og H2M celler, men blot havde en meget marginal effekt på Miha celler (Fig. 2C). Bemærkelsesværdige, Miha celler, som har en meget lav endogen niveau af PAK1, viste ingen forskel i celleproliferation upon IPA-3-behandling. Tilsammen disse resultater viste, at IPA-3 behandling undertrykte HCC celledeling i en faldende rækkefølge, metastatisk HCC primær HCC . Ikke-transformerede hepatocytter, og i en PAK1-afhængig måde

(A ) virkningen af ​​IPA-3 på celleproliferationen satser af Miha (øvre, venstre panel), HepG2 (øverste, midterste panel) H2P (øvre, højre panel), H2M (nedre, venstre panel) og MHCC97L (nedre, højre panel ) celler. Statistisk analyse blev udført ved at sammenligne med værdien af ​​DMSO kontrol. *

P

0,05, **

P

0,01 (ANOVA). (B) BrdU mærkning analyser af Miha (øverste, venstre panel), HepG2 (øverste, midterste panel), H2P (øverste, højre panel), H2M (nedre, venstre panel) og MHCC97L (nederste, højre panel) celler. *

P

0,05 (ANOVA) i forhold til DMSO-kontrol. Fejlsøjler, middelværdi ± SD af tredobbelte prøver. (C) Repræsentative plader af kolonidannelse assay af Miha (venstre panel), HepG2 (midterste panel) og H2M celler (højre panel). Søjlediagram over kolonidannelse assayet (nederste panel). *

P

0,001, **

P

0,01 (ANOVA) i forhold til DMSO-kontrol. Fejl barer, gennemsnit ± SD for tredobbelte prøver.

IPA-3 fremkalder apoptose af HCC Celler

For at undersøge om IPA-3 påvirker apoptose i HCC celler, en annexin V-7ADD farvning blev udført. Siden 10 pM IPA-3 inhiberer proliferation og en højere koncentration, dvs. 20 pM forårsager en signifikant resultat i BrdU inkorporering assay i H2M-celler blev 10 uM og 20 uM anvendt til at undersøge den fremtrædende virkning af IPA-3. Resultatet viste, at inkubation af H2M-celler med 20 pM IPA-3 førte til en højere procentdel af celler, som viser et positivt signal for annexin V-farvning, i sammenligning med DMSO kontrol, hvilket antyder, at celler undergik apoptose under behandling med IPA-3 ( fig. 3A). Desuden blev den potentielle pro-apoptotiske aktivitet af IPA-3 yderligere undersøgt ved spaltning af PARP1 og caspase 3. Behandling af IPA-3 i H2M-celler resulterede i en svækket niveau af PARP ved 20 uM og spaltningen form af PARP1 kunne detekteres ved 40 uM (fig. 3B). Dette blev ledsaget af en dosisafhængig reduktion af PAK1 phosphoryleringsniveauerne af PAK1 (fig. 3B). Desuden er niveauet af spaltede caspase 3 steg på en dosisafhængig måde. Samlet set viser disse resultater antydede, at IPA-3 inducerer apoptose gennem PAK1 inhibering ved en høj koncentration.

(A) Annexin V-7ADD farvning assay. Fluorescenssignalerne af annexin V-PE og 7-AAD blev detekteret med PE-A og Per-Cy5-5-A kanaler henholdsvis (øvre panel). Procentdelen af ​​H2M celler farvet med annexin V-PE kun under forskellige behandlinger blev vist i et søjlediagram (nederste panel). *

P

0,001 (ANOVA) i forhold til DMSO-kontrol. (B) Serum-udsultede H2M-celler blev behandlet med stigende doser af IPA-3 sammen med serum opfyldning i 24 timer. Western blotting-analyse af PARP1 blev P-PAK1 (T423), total PAK1 og kløvet caspase 3 udført.

IPA-3 blænder HCC Cell Migration

PAK1 har en fremtrædende rolle i cellemigrering, især i reguleringen af ​​stress fibre dannelse og fokale adhæsioner omsætning. Således blev immunfluorescensfarvning udført for at undersøge, om IPA-3 kan påvirke disse processer. IPA-3 blev forøge dannelsen af ​​stress fibre og fokale adhæsioner i både H2M og H2P celler, som blev visualiseret ved de phalloidin og paxillin immuno-positive signaler af stress fibre og fokale adhæsioner, medens DMSO kontrol viste en svag og spredt farvning. Desuden viste resultaterne, at behandlingen af ​​IPA-3 væsentligt forbedret antallet af fokale vedhæftning komplekser i H2M og H2P celler som afsløret ved paxillin farvning (fig. 4A). Phosphorylering af paxillin i serin-178 (S 178) er vigtig for PAK1-medieret cellemigration, som er blevet vist at blive phosphoryleret af JNK [4], [16]. I H2M-celler, blev phosphorylering af paxillin på S 178 væsentligt reduceret sammen med en overnatning behandling af IPA-3 (fig. 4B). Således IPA-3 inhiberer signalering af den PAK1 /JNK /paxillin pathway. Desuden blev et Transwell migration assay udført for at undersøge virkningen af ​​IPA-3 på

in vitro

migration evne H2M celler. Vi fandt, at IPA-3 undertrykte signifikant migrering af H2M-celler som antallet af migrerede celler bemærkelsesværdigt blev reduceret med 79%, sammenlignet med DMSO-kontrol (fig. 4C). Tilsammen disse data illustreret, at IPA-3 reducerer PAK1-afhængige celle mobilitet HCC-celler betydeligt.

(A) paxillin proteinekspression blev påvist ved immunfluorescens analyse under IPA-3 behandling. H2M og H2P (øverste panel) celler blev serumudsultet natten over og behandlet med enten DMSO kontrol eller IPA-3 (20 pM) i 15 minutter, efterfulgt af FBS genopfyldning i 10 minutter. Immunofluorescens signaler af phalloidin (Red), paxillin (grøn) og DAPI (blå) repræsenterer stress fiber, fokal adhæsion og kerne, henholdsvis (forstørrelse 40X). Antallet af fokal vedhæftning (paxillin) blev talt i H2M (nedre, venstre panel) og H2P (nederste, højre panel), og repræsenteret i søjlediagram. Fejlsøjler, middelværdi ± SD af tredobbelte prøver. *

P

0,01 (

t

-test) sammenlignet med DMSO kontrol. (B) Western blotting-analyse på phosphoryleringsniveauerne af PAK1 og paxillin. Serum-udsultede celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af IPA-3 som angivet i 15 minutter, efterfulgt af FBS genopfyldning i 10 minutter. (C) Repræsentative billeder af Transwell migration assay af H2M-celler. Celler blev behandlet med enten DMSO eller 10 pM IPA-3, og fik lov til at migrere i 24 timer. Billeder viser de celler, der har migreret til det nedre kammer (øvre panel). Antallet af migrerede celler blev talt og repræsenteret i søjlediagram (nederste panel). Fejlsøjler, middelværdi ± SD af tredobbelte prøver. *

P

. 0,01 (

t

-test) sammenlignet med DMSO kontrol

IPA-3 blænder NF-KB Nuclear translokation

Tidligere rapporter viste, at PAK1 stimulerer aktiviteten og subcellulær translokation af nuklear faktor let kæde enhanceren af ​​aktiverede B-celler (NF-KB), og fremmer celleoverlevelse [17], [18]. Vi undersøgte således, om IPA-3 er i stand til at inhibere aktiviteten af ​​NF-KB. H2M med en høj endogen ekspression niveau af PAK1 og immortaliserede hepatocytter, Miha celler blev serumudsultet og derefter separat behandlet med IPA-3 efterfulgt af tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α). Som vist i fig. 5A, NF-KB positiv farvning blev overvejende fundet i cytoplasmaet i DMSO kontrol, hvorimod NF-KB-farvning blev akkumuleret i kernen efter TNF-α induktion. Interessant H2M-celler forbehandlet med IPA-3 resulterede i et cytoplasmatisk farvning af NF-KB, hvilket indikerer, at IPA-3 undertrykte TNF-α-induceret nuklear målretning af NF-KB. I modsætning H2M-celler, havde IPA-3 ikke undertrykke TNF-α-induceret NF-KB-aktivering i Miha celler, som mangler det endogene PAK1. Dette resultat antydede, at inhiberingen af ​​NF-KB-aktivering af IPA-3 er PAK1-afhængig. For yderligere at undersøge, om PAK1 inaktivering er involveret i IPA-3-induceret suppression af NF-KB translokation, blev phosphorylering af PAK1 bestemt (fig. 5B). I overensstemmelse med en tidligere undersøgelse, som viste, at PAK1 straks blev aktiveret ved TNF-α i forskellige cellelinier [19], blev phospho-PAK1 niveau forhøjet i celler stimuleret med TNF-α (20 ng /ml). Phosphoryleringsniveauet var højest ved 0,5-time og derefter gradvist reduceret bagefter. På den anden side blev phosphoryleringen af ​​PAK1 fuldstændig undertrykt i IPA-3 forbehandlede celler. Dette resultat antydede, at IPA-3 er i stand til at afskaffe PAK1 aktivering induceret af TNF-α, hvilket korrelerede godt med IPA-3-inhibering på TNF-α-induceret NF-KB-translokation. Induktionen af ​​metalloproteinase (MMP) -9 af TNF-α viste sig at være medieret af PAK1 [19]. For at belyse virkningen af ​​IPA-3 på TNF-α-induceret aktivitet af MMP-9 og COX-2, som er nedstrøms mål for NF-KB [20], [21], udførte vi QRT-PCR for at kvantificere mRNA produktion af MMP-9 og COX-2. Efter normalisering med β-actin, H2M-celler reagerede på TNF-α med en stigende mRNA produktion af MMP-9 og COX-2 (fig. 5C). viste dog resultaterne, at behandling af IPA-3 undertrykte signifikant ekspressionen af ​​MMP-9 og COX-2-transkripter på en dosisafhængig måde.

(A) Effekt af IPA-3 på subcellulær lokalisering af NF- KB blev bedømt ved immunfluorescensfarvning. Efter natten over serumudsultning blev H2M (venstre panel) og Miha (højre panel) celler behandlet med enten DMSO eller IPA-3 (20 pM, 15 minutter) efterfulgt af en tilsætning af TNF-α (20 ng /ml, 15 minutter) . NF-KB blev påvist med et specifikt antistof (grøn) og nucleus blev farvet med DAPI (blå). (B) Western blotting-analyse af P-PAK1 (T423) og total PAK1 blev påvist i H2M-celler stimuleret med TNF-α (20 ng /ml) med eller uden IPA-3 forbehandling (20 uM, 15 minutter). TNF-α var inkluderet i dyrkningsmediet i 0, 0,5, 1, 2 eller 4 timer. (C) Ekspression af kvantitativ real-time PCR blev udført for at analysere mRNA-niveauet af MMP-9 (venstre panel) og COX-2 (højre panel). Serum-udsultede H2M-celler blev behandlet med eller uden IPA-3 forbehandling (10 eller 20 pM, 15 minutter) efterfulgt af TNF-α (10 eller 20 ng /ml, 24 timer). Kvantitative resultater af MMP-9 og COX-2-mRNA-niveauer blev normaliseret for p-actin. Værdierne repræsenterede gennemsnittet ± SD af tre uafhængige forsøg. *

P

0,001 (ANOVA), ***

P

. 0,05 (ANOVA) i forhold til TNF-α kontrol

IPA- 3 blænder tumorigenese i Nude Mouse xenograftmodel

bredden i IPA-3 antitumoraktivitet

in vivo

blev evalueret ved hjælp af en nøgen mus xenograftmodel. Siden H2M celle linje var ude af stand til at udvikle solide tumorer i nøgne mus, blev et andet menneske HCC linje MHCC97L med lignende PAK1, der er anvendt (fig. 1A). Efter tumoretablering (100 mm

3), blev fem mus pr grupper behandlet med enten DMSO eller forskellige doser af IPA-3 (2 mg /kg og 4 mg /kg) TIW ved i.p. indsprøjtning. Mens behandlingen var veltolereret som bevist af nogen væsentlig vægttab, IPA-3 undertrykte signifikant tumorvækst (fig. 6A) og resulterede i lavere tumor vægte (fig. 6B). Desuden viste Western blotting-analyse, at IPA-3 reducerede phosphorylering af PAK1 og dens nedstrømsmål JNK (fig. 6C). Taget sammen viste disse resultater, at IPA-3 kan undertrykke tumorigenese

in vivo

ved at reducere PAK1 aktivitet.

(A) MHCC97L celler blev anvendt til xenotransplantat-model. Mus blev behandlet tre gange om ugen enten med DMSO eller IPA-3 (2 mg /kg eller 4 mg /kg, i.p.). *

P

0,001 (ANOVA) i forhold til DMSO kontrolgruppen. (B) Tumorvægte blev målt ved slutningen af ​​studiet. *

P

0,001, **

P

0,01, (ANOVA) i forhold til DMSO kontrolgruppen. (C) Repræsentative resultater af Western blotting-analyse. P-PAK1 (T423), total PAK1 påvistes P-JNK og total JNK. ***

P

0,05 (ANOVA) i forhold til DMSO-kontrol. Fejl barer, gennemsnit ± SD af 5 dyr pr gruppe.

Diskussion

PAK1 er involveret i et komplekst signalering transduktion netværk, som er knyttet til forskellige cellulære processer, herunder cytoskelet modellering, celle motilitet, overlevelse og proliferation og cellecyklusprogression [5]. Dereguleret eller hyper-aktiveret PAK1 er ofte forbundet med HCC [19]. Således har PAK1 blevet en potentiel terapeutisk mål ved styring tumorgenese og metastase af HCC [22]. IPA-3 er blevet identificeret til at være en allosterisk lille molekyle inhibitor af PAK1 [8]. Med små eller mindre rapporter om IPA-3 i behandling af human HCC, vi ansat forskellige

in vitro

og

in vivo

eksperimenter for at undersøge den anti-tumorigen evne IPA-3 behandling på humane HCC cellelinjer.

i denne undersøgelse viste vi, at IPA-3 kunne hæmme spredning på HepG2, H2P, H2M, og MHCC97L celler i dosis- og tidsafhængige manerer.