PLoS ONE: Split T celle Tolerance mod en Self /tumorantigen: Spontan CD4 + men ikke CD8 + T-celle responser mod p53 i kræftpatienter og raske donorer

Abstrakt

Analyser af NY-ESO-1-specifikke spontane immunreaktioner i kræftpatienter viste, at antistof og både CD4

+ og CD8

+ T-celle responser blev induceret sammen i kræftpatienter . At undersøge, om sådanne integrerede immunresponser også spontant induceret i andre tumorantigener, har vi vurderet antistof- og T-celle responser mod selv /tumorantigen p53 i ovariecancerpatienter og raske individer. Vi fandt, at 21% (64/298) af cancerpatienter ovarie- men ingen raske donorer viste specifikke IgG-responser mod vildtype p53-protein. Mens ingen af ​​12 patienter med høj titer p53 antistof udviste spontane p53-specifikke CD8

+ T-cellereaktioner efter en enkelt

in vitro

sensibilisering, signifikant p53-specifikke IFN-γ-producerende CD4

+ T celler blev påvist hos 6 patienter. Overraskende, tilsvarende niveauer af p53-specifikke CD4

+ T-celler, men ikke CD8

+ T-celler blev også påvist i 5/10 seronegative kræftpatienter og 9/12 raske donorer. Vigtigere, p53-specifikke CD4

+ T-celler i raske donorer stammede fra en CD45RA

– antigen-erfaren T-celle population og anerkendt naturligt processerede vildtype p53-protein. Disse resultater rejser den mulighed, at p53-specifikke CD4

+ T-celler afspejler abnormaliteter i p53 forekommer i normale individer, og at de kan spille en rolle i processer immunosurveillance eller immunregulering af p53-relaterede neoplastiske begivenheder.

citation: Tsuji T, Matsuzaki J, Ritter E, Miliotto A, Ritter G, Odunsi K, et al. (2011) Split T celle Tolerance mod en Self /tumorantigen: Spontan CD4

+ men ikke CD8

+ T-celle responser mod p53 i kræftpatienter og raske donorer. PLoS ONE 6 (8): e23651. doi: 10,1371 /journal.pone.0023651

Redaktør: Mauricio Martins Rodrigues, Federal University of São Paulo, Brasilien

Modtaget: Marts 4, 2011; Accepteret: 22 Juli 2011; Udgivet: 12. august 2011

Copyright: © 2011 Tsuji et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af Cancer Research Institute Kræft i æggestokkene arbejdsgruppe Grant og Cancer Vaccine Collaborative finansieret af Cancer Research Institute og Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Stigende beviser for, at både tumor antigen-specifikke CD4

+ og CD8

+ T-celler spiller en kritisk rolle i udryddelsen af ​​kræft [1], [2]. Vi har grundigt undersøgt spontane eller vaccine-inducerede immunrespons mod kræft-testis antigen NY-ESO-1 som en prototype tumorantigen i human [3], [4], [5], [6], [7], [8 ]. Naturligt forekommende NY-ESO-1-specifikke CD4

+ og CD8

+ T celle responser blev typisk kun påvises i patienter, som havde serumantistof mod NY-ESO-1, hvilket indikerer, at spontane immunresponser mod NY-ESO- 1 i cancerpatienter med NY-ESO-1-udtrykkende tumorer blev stærkt integrerede [3], [4]. For nylig blev det vist, at efter vaccination med NY-ESO-1 protein og CpG, NY-ESO-1-specifikke CD4

+ T-celler blev påviselig først, efterfulgt af fremkomsten af ​​antistof og CD8

+ T-celler , hvilket antyder en rolle for NY-ESO-1-specifikke CD4

+ T-celler til at lette antistof og CD8

+ T celle responser efter immunterapi [8]. Derudover har vi for nylig vist sig, at vaccination med MAGE-A3-protein inducerede integreret MAGE-A3-specifikt antistof, CD8

+ og CD4

+ T celle responser [9]. I ikke-småcellet lungekræft patienter, som fik MAGE-A3-protein formuleret i adjuvanssystemet AS02B blev CD8

+ T celle responser induceret kun hos patienter, som udviklede meget høj titer antistof og stærke CD4

+ T-cellereaktioner . Men sådan sammenhæng mellem antistof og T-celle responser er ikke fuldt behandlet for andre menneskelige tumorantigener.

I de seneste årtier har immunreaktioner mod p53 blevet grundigt undersøgt [10], [11], [12 ], [13]. P53-proteinet blev opdaget i vores laboratorium som en immunogen tumor-specifikt antigen ved serologiske undersøgelse af tumorbærende mus [14], og samtidigt i to andre laboratorier under anvendelse af andre metoder [15], [16]. Det blev senere opdaget, at p53-genet hyppigt muteret i forskellige kræftformer, hvilket fører til tab af heterozygoty, dysregulering af p53 feedback-netværk, og i sidste ende resulterer i langsommere p53 omsætning og dermed akkumulering af mutant p53-protein i tumorceller. Hos mennesker er p53 akkumuleret i op til 70% af tumorer fra patienter med visse cancere, såsom tyktarmen eller hoved- og halskræft, og denne akkumulering er et stærkt immunogen begivenhed, spontant udløser højtitrede specifikt antistofrespons [12]. Faktisk har p53 været en af ​​de hyppigst detekteret antigener genkendes af naturligt forekommende antistoffer i cancerpatienter ved screening af cDNA-ekspressionsbiblioteker fra humane tumorer med autologe antistof (SEREX) og ved ELISA i vores laboratorium [17], [18] [19], [20]. Naturligt forekommende p53 serumantistoffer hos cancerpatienter vides at genkende vildtype N-terminale eller C-terminale sekvenser af p53, men ikke det centrale område af proteinet, hvor 90% af mutationer forekommer. Vi og andre har også undersøgt T-celle responser mod vildtype p53 og mange epitoper for både CD8

+ og CD4

+ T-celle er blevet bestemt ved revers immunologi tilgange og gentagen stimulering af T-celler med syntetiserede peptider [10 ], [21], [22]. De seneste resultater af T-celle immunomonitoring af æggestokkene og kolorektal kræftpatienter vaccineret med p53 overlappende peptider viste stærk induktion af p53-specifikke CD4

+ T-celle responser, der var endda påvises ved

ex vivo

analyser af perifert blod mononukleære celler (PBMC’er) efter vaccination uden at inducere nogen påviselig p53-specifikke CD8

+ T-celler [23], [24].

i den foreliggende undersøgelse har vi undersøgt spontan antistof og T-celle responser mod p53 i æggestokkene kræftpatienter, hvis tumorer ofte ophobes p53 protein [25], og raske donorer. For at sammenligne

in vivo

immunogenicitet af p53 med den for NY-ESO-1, monitorerede vi p53-specifikke CD4

+ og CD8

+ T-cellereaktioner ved hjælp af immunomonitoring procedurer, der blev udviklet til overvåge spontane NY-ESO-1-specifikke T-cellereaktioner. Disse standardiserede metoder blev tidligere vist at detektere NY-ESO-1-specifikke cirkulerende CD4

+ og CD8

+ T celle responser kun i NY-ESO-1-seropositive patienter med NY-ESO-1-udtrykkende tumor, men ikke hos raske donorer med lav frekvens af prækursorer [4], [26]. Ved anvendelse af denne protokol, fandt vi, at IFN-γ-producerende CD4

+ T-celler mod vildtype p53-sekvenser blev påvist hyppigt i seropositive kræftpatienter. Overraskende spontan p53-specifikke CD4

+ T-celle responser af samme størrelsesorden blev også fundet i de fleste seronegative patienter og raske donorer. I modsætning hertil ingen spontan CD8

+ T-celle responser mod vildtype p53 eller mod patientens egne muteret p53-sekvenser blev påvist i nogen testede donorer, hvilket antyder, at den spontane aktivering af CD8

+ T-celle responser mod p53 er stærkt styret

in vivo

.

Materialer og metoder

patienter og sunde donorers prøver

PBMC’er og serum blev opnået fra æggestokkene kræftpatienter på Roswell Park Cancer Institute, under en godkendt protokol fra Institutional Review Board. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter. PBMC’er og serum fra raske donorer blev opnået fra New York Blood Center.

Måling af serum p53-specifikt antistof

Rekombinant vildtype p53 blev fremstillet og p53-specifikt antistof i serum blev målt som tidligere beskrevet [20]. En gensidig titer blev estimeret ud fra optisk tæthed læsninger af serielt fortyndede prøver og kontroller, som beskrevet [20].

overlappende peptider

Sekvenser af overlappende peptider fra vildtype p53 protein anvendes til præsensibilisering og detektion er vist i tabel S1. Alle peptider blev syntetiseret ved biosyntese (Lewisville, TX) og blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) ved 10 mM koncentration og opbevaret ved -80 ° C. De var designet 25 aminosyrer langt, undtagen # 1 (19-mer) og # 30 (22-mer) til at være og har 15 aminosyrer overlapper. Aminosyre for codon 72 af vildtype p53 viser ofte Arg til Pro polymorfi [27]. For at løse dette polymorfi, to forskellige peptider med Arg eller Pro ved position 72 er udarbejdet for peptid # 6 og blev blandet ved en 1:01 ratio.

præsensibilisering

In vitro

præsensibilisering blev udført som beskrevet før [28]. CD8

+ og CD4

+ T-celler blev adskilt fra PBMC’er ved hjælp Dynabeads (Invitrogen-Dynal AS) og blev uafhængigt stimuleret med CD8

-CD4

– celler, der blev pulset natten over med en pool ( # 1- # 30), 2 swimmingpools (# 1- # 15 og # 16- # 30) eller 3 pools (# 1- # 10, # 11- # 20 og # 21- # 30) af overlappende peptider ifølge til antallet af celler efter separation og bestrålet. Cellekulturer blev suppleret med 10 U /ml IL-2 og 20 ng /ml IL-7 to gange om ugen. Parallelt hermed en del af CD4

+ T-celler blev polyklonalt udvidet med phytohæmagglutinin (PHA, Remel) i nærvær af lavdosis IL-2 og IL-7, som anvendes som målceller (T-APC) i ELISPOT assay. I nogle forsøg CD4

+ T-celler blev yderligere separeret i CD45RA

+ og CD45RA

– delmængder efter phycoerythrin (PE) -konjugeret anti-CD45RA-monoklonalt antistof (mAb) (BD Biosciences) og anti-PE -magnetic perler (Miltenyi Biotec).

Påvisning af p53-specifikke T-celle respons

p53-specifikke IFN-γ-produktion blev evalueret ved ELISPOT assay på dag 9-12 for CD8

+ T-celler og dag 18-25 for CD4

+ T-celler. Først blev T-celler evalueret for deres reaktivitet mod 6 puljer af 5 peptider (# 1- # 5, # 6- # 10, etc.). I nogle eksperimenter blev en pulje af 17 overlappende peptider fra NY-ESO-1 anvendes som irrelevante peptider. Hvis IFN-γ-produktion blev detekteret mod nogen af ​​peptidpools blev uafhængige peptider i puljen testet for at bestemme et enkelt peptid genkendes. Alle resultater fra ELISPOT-analyser blev præsenteret som det gennemsnitlige antal IFN-γ pletdannende celler fra dobbelte brønde uden at trække antallet af baggrundsniveauet pletter mod unpulsed målceller. Responser blev betragtet som positive, hvis antallet af pletter mod peptid (er) -pulsed målceller var 3 gange mere end det mod unpulsed målceller og mere end 25 spots /50.000 effektor T-celler. For nogle patienter, blev p53-specifikke T-celler påvist ved intracellulær cytokin-farvning og CD107a ekspressionsassays. Intracellulær cytokin-farvning for IFN-γ, IL-4, og TNF-α blev udført som tidligere [28] beskrevne. For CD107a ekspressionsassays, præsensibiliseret CD8

+ T-celler blev restimuleret i nærvær af 40 pl /ml PE-konjugeret anti-CD107a mAb (BD Biosciences) og 0,66 pl /ml GolgiStop (BD Biosciences). I nogle eksperimenter blev p53 peptid-specifikke CD4

+ T-celler isoleret ved flowcytometrisk sortering af CD154 udtrykkende celler efter restimulering med p53-peptider og de blev polyklonalt udvidet med PHA som tidligere [28] beskrevne. Anerkendelse af naturligt forarbejdede p53-protein og cytokinproduktion af p53-specifikke CD4

+ T-cellelinier blev undersøgt ved anvendelse af autologe monocytafledte dendritiske celler (mo-DCS) præ-pulset natten over med p53 overlappende peptider (3,3 uM), rekombinant p53-protein (20 ug /ml) eller kontrol NY-ESO-1 protein (20 ug /ml). Cytokinniveauer i supernatanterne blev målt ved sandwich-ELISA under anvendelse af følgende mAb parvis: umærket og biotinyleret-anti-IFN-γ (BD Biosciences), umærket og biotinylerede-anti-GM-CSF mAb’er (BD Biosciences), umærket og biotinyleret-anti -IL-4 mAb’er (BD Biosciences), umærkede og biotinyleret-anti-IL-13 mAb’er (eBioscience), umærkede og biotinyleret-anti-IL-10 mAb’er (eBioscience), umærkede og biotinyleret-anti-TGF-p mAb’er (eBioscience ), umærkede og biotinylerede-anti-IL-17 mAb’er (eBioscience) og umærkede og biotinyleret-anti-IL-9 mAb’er (eBioscience). Standard cytokin proteiner blev opnået fra eBioscience.

Resultater

Anti-p53 antistof respons

At evaluere spontan immunitet mod p53, vi målte serum antistoftitere mod p53 og NY-ESO -1 proteiner i 298 avancerede epitelial æggestokkene kræftpatienter og 153 raske personer ved ELISA. Som vist i figur 1, 21% af patienterne, men ingen af ​​de raske individer viste signifikant anti-p53-serum-antistof, som var meget lig frekvensen af ​​anti-NY-ESO-1 antistofresponser observeret (21%). Disse frekvenser af spontane antistofresponser mod p53 og NY-ESO-1, er i området fra dem rapporteret for patienter med ovariecancer i forskellige undersøgelser [29]. Derimod kan et mindre antal patienter (7%) viste signifikant serumantistof mod kræft /testis antigen MAGE-A3 (data ikke vist). Hyppigheden af ​​patienter, som viste både NY-ESO-1 og p53 serumantistoffer var 4,7%, hvilket er tæt på den beregnede hyppighed fra frekvenser mod hvert antigen antagelse, at induktionen af ​​disse reaktioner er uafhængigt (0,21 (21% mod p53) × 0,21 (21% mod NY-ESO-1) = 0,044 (4,4% mod begge antigener)).

Sera fra 298 æggestokkene cancerpatienter og 153 raske individer blev vurderet for antistof mod vildtype p53 og NY -ESO-1-proteiner ved ELISA. Gensidige titre beregnes som beskrevet i reference [20].

målbart spontan CD8

+ T-celle respons hos kræftpatienter og raske donorer

For immunomonitoring af spontan T celle responser, er det vigtigt at vælge en fremgangsmåde, der kan skelne

in vivo Salg -primet T-celler fra

in vitro

-induceret T-celler. At overvåge spontant-induceret T-celle-responser mod p53, anvendte vi en enkelt

in vitro

sensibilisering protokol, der er blevet udviklet og valideret til at detektere spontan NY-ESO-1-specifikke T-celle responser kun i NY-ESO- 1 seropositive cancerpatienter, men ikke hos raske personer. Ved anvendelse af denne protokol, NY-ESO-1-specifikke CD8

+ T-celler blev hyppigt fundet fra NY-ESO-1 seropositive patienter ovariecancer men ikke fra raske individer i denne undersøgelse kohorte (figur S1 (A)). I modsætning hertil kan flere runder af stimulation af professionelle antigenprocesseringsveje celler (APC’er), såsom mo-DC’er inducere NY-ESO-1-specifikke T-celler fra naive NY-ESO-1-specifikke forstadier hos raske donorer [30], [31 ]. På grund af den hyppige forekomst af spontan serum antistof mod p53 i æggestokkene kræftpatienter, vi først analyseret p53-specifikke CD8

+ T-celle responser hos disse patienter. Fra den opdagelse, at spontane NY-ESO-1-specifikke T-celler kan påvises kun i seropositive patienter blev 12 æggestokkene cancerpatienter med spontane antistofresponser mod p53 udvalgt til evaluering af T-celle responser. CD8

+ og CD4

+ T-celler blev isoleret fra PBMC’er som beskrevet i materialer og fremgangsmåder, og de blev separat stimuleret med p53 peptid-pulserede CD4

-CD8

– celler. Efter dyrkning i cirka 10 dage blev antallet af IFN-γ-producerende p53-specifikke CD8

+ T-celler vurderet ved ELISPOT assay. Som vist i figur 2A viste to repræsentative seropositive patienter ingen påviselig anti-p53 CD8

+ T-cellereaktion ved vores standard immunomonitoring protokol. Tilsvarende ingen signifikant IFN-γ-produktion fra CD8

+ T-celler blev påvist fra 10 yderligere seropositive patienter (figur 2B). Ti seronegative ovariecancer patienter og 12 raske donorer blev også testet for deres spontane CD8

+ T-celle respons mod p53 og som forventet var der ingen indikation af p53-specifikke CD8

+ T-celler (figur 2B). Det er muligt, at p53-specifikke CD8

+ T-celler mangler IFN-γ-producerende evne, og at de er påviseligt ved ekspression af andre molekyler. For at teste om p53-specifikke CD8

+ T-celler kunne påvises af andre aktiverings-induceret molekyler, 5 seropositive og seronegative 5 patienter blev analyseret for TNF-α produktion og CD107a ekspression efter restimulering med peptider. Som vist i figur 2C, ingen p53-specifikke CD8

+ T-cellereaktion påvistes baseret på TNF-α og CD107a ekspression.

(A) CD8

+ T-celler fra antistof-positive ovariecancer patienter blev præsensibiliseret med en pulje af 30 p53 overlappende peptider. Efter 9-12 dage blev p53-specifikke IFN-γ producerende T-celler vurderet ved ELISPOT-analyser. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse (SD) gentagne brønde. Autologe T-APC’er blev anvendt som målceller i ELISPOT-analyser. (B) CD8

+ T celle responser i 7 seropositive og seronegative 5 Ovariecancerpatienter og 12 raske donorer er vist. (C) præsensibiliseret CD8

+ T-celler blev analyseret ved intracellulær TNF-α farvning og CD107a ekspressionsassays efter restimulering med p53-peptider-pulserede, irrelevante (NY-ESO-1) -peptider-pulserende eller unpulsed målceller.

Disse resultater indikerer, at spontan IFN-γ-producerende CD8

+ T-cellereaktioner mod vildtype p53 ikke kunne påvises selv i seropositive patienter kræft ved vores præsensibilisering protokol i modsætning til den hyppige påvisning af NY -ESO-1-specifikke CD8

+ T celle responser i NY-ESO-1-seropositive patienter (figur S1 (A)). Ophobning af muteret p53-protein i tumorceller vides at korrelere med antistofrespons [32]. Fordi muterede peptider anses for at være immunogene som følge af manglende tolerance og immunogenicitet af mutant p53 til at fremkalde CD8

+ T celle responser blev påvist i mus [33], [34], vi næste søgte CD8

+ T-celle responser mod muteret p53. For at gøre dette, exon 5-7 af p53-genet fra tumorvæv og normale lymfocytter i æggestokkene kræftpatienter blev sekventeret for at identificere potentielle p53 mutationer i tumor (data ikke vist). Blandt de fundne mutationer, tre hyppigt forekommende mutationer, S127F, R273C, og R282W, blev udvalgt til at lede efter specifikke CD8

+ T-celle respons mod epitoper, der omfatter disse mutationer. CD8

+ T-celler fra tre patienter, som havde tumoren med S127F, R273C eller R282W mutation blev stimuleret med peptider indeholdende patientens p53 mutation eller med peptider indeholdende det tilsvarende vildtype-sekvens. Ingen muterede peptid-specifikke CD8

+ T-cellereaktion påvistes i disse tre patienter (data ikke vist).

CD4

+ T-celle-responser i cancerpatienter og sunde individer

for at detektere naturligt forekommende CD4

+ T-celle responser mod p53, CD4

+ T-celler fra seropositive cancerpatienter blev stimuleret med overlappende peptider pulset på autologe T-celle-depleterede PBMC’er anvendt som APC’er. Efter 20 dages dyrkning med forekomst af lav-dosis IL-2 og IL-7, IFN-γ-producerende CD4

+ T-celler blev optalt ved ELISPOT assay mod subpuljer af overlappende peptider og derefter mod individuelle peptider fra reaktive subpuljer . I modsætning til den målbart p53-specifikke CD8

+ T-celler, signifikant IFN-γ-producerende p53-specifikke CD4

+ T-celle responser på subpuljer af overlappende peptider blev fundet i 6 af 12 seropositive patienter (figur 3A og data ikke vist), med sammenlignelig størrelse til spontan CD4

+ T-celle responser mod NY-ESO-1 i NY-ESO-1-seropositive patienter med ovariecancer i dette studie kohorte (figur S1 (B)). Dernæst evalueres spontan CD4

+ T-celle responser mod p53 i 10 seronegative patienter og 12 raske individer. Overraskende, selvom vores præsensibilisering metoden ikke påvise NY-ESO-1-specifikke CD4

+ T-celler i raske individer (figur S1 (B)), den samme procedure detekteret signifikant IFN-γ-producerende CD4

+ T celle responser i 5/10 seronegative patienter og 9/12 raske individer testet (fig 3B og C og data ikke vist). Hos udvalgte patienter, p53-specifikke CD4

+ T-celler kunne påvises af TNF-α produktion efter intracellulær cytokin-farvning (Fig S2).

CD4

+ T-celler fra antistof-positive (A) og negativ (B) ovariecancer patienter og raske donorer (C) blev præsensibiliseret med pool (e) p53 overlappende peptider. Efter 18-25 dage blev p53-specifikke IFN-γ producerende T-celler evalueret mod peptid-pulserede eller unpulsed (

φ

) målceller ved ELISPOT-analyser. Fejlbjælkerne viser SD af dobbelte brønde. Autologe T-APC’er blev anvendt som målceller i ELISPOT-analyser. T-celle responser blev først evalueres i forhold subpuljer af peptider (1. assay) og derefter mod uafhængig peptid i en reaktiv subpulje (2nd assay). For en sund donor er vist i (C), gjorde CD4

+ T-celler, blev præsensibiliseret med # 1- # 10 eller # 21- # 30 peptid ikke vist signifikante responser (data ikke vist).

Figur 4 opsummerer epitoper genkendt af CD4

+ T-celler fra seropositive og seronegative kræftpatienter og raske donorer. Som vist i figur 4, blev epitoper fundet i både seropositive og seronegative kræftpatienter og raske donorer fordelt over hele sekvensen af ​​p53-proteinet. Visse peptider, såsom # 9, # 13 og # 26 inducerede hyppigere CD4

+ T celle responser i 4 (20% af respondenter), 6 (30%) og 7 (35%) donorer hhv. Nogle seronegative cancerpatienter og raske donorer viste multiple epitop-specifikke CD4

+ T celle responser, som det ses i seropositive kræftpatienter. At overveje den ofte observerede polymorfi på et codon 72, vi brugte en blanding af to variant peptider til peptid # 6 (tabel S1), der kunne fremkalde

de novo

reaktioner hos personer med en p53 homozygot genotype på et codon 72. der blev imidlertid detekteret nogen T-celle respons mod # 6 peptider i denne undersøgelse, hvilket indikerer, at vores kortsigtede kultur protokol ikke syntes at inducere

de novo

CD4

+ T-cellereaktioner. Reaktionsstyrken og distribution af epitoper var ens i kræftpatienter og raske personer. Det er velkendt, at epitoper genkendt af p53-specifikt antistof er begrænset til N-terminus og C-terminus region af proteinet [32], [35]. Der var imidlertid ingen korrelation mellem kortene over epitoper for CD4

+ T-celler og for antistoffer (figur 4). Desuden er mutation af p53-protein i cancerceller ofte findes i den centrale region af genet [32]. Der var imidlertid ingen overrepræsentation af CD4

+ T-celleepitoper i denne region, hvilket tyder på, at svarene ikke blev medieret af krydsreaktivitet af muterede peptid-specifikke CD4

+ T-celler. At finde mutationsspecifikke CD4

+ T-celler i tre patienter med muteret p53-udtrykkende tumor, blev CD4

+ T-celler fra patienterne præsensibiliseret med peptider indeholdende patienternes sammenhørende mutation. Selvom én patient, hvis tumor havde S127F-mutationen viste svage CD4

+ T-celle responser mod både muterede og tilsvarende vildtype-peptider, der kunne påvises nogen væsentlig mutationsspecifikke CD4

+ T-celle respons (data ikke vist).

størrelsen af ​​CD4

+ T celle responser i patienter med ovariecancer med eller uden p53-specifikt antistof i serum og raske donorer mod p53 overlappende peptider er plottet. Hvert symbol repræsenterer en person. Alle viste responser var signifikant sammenlignet med antallet af baggrunden pletter. 6/12 seropositive (lyserøde symboler) og 5/10 seronegative (blå symboler) æggestokkene kræftpatienter og 9/12 raske individer (sorte symboler) viste positive CD4

+ T-celle responser mod p53 peptid-pulserede målceller sammenlignet med unpulsed målceller.

oprindelse repertoire af p53-specifikke CD4

+ T-celler

i modsætning til detektion af p53-specifikke CD4 + T-celler i seropositive og seronegative kræftpatienter samt hos raske donorer, vores præsensibilisering protokol tillader kun detektion af NY-ESO-1-specifik IFN-γ-producerende CD4

+ T-celler i NY-ESO-1 seropositive cancerpatienter, men ikke hos seronegative kræftpatienter og sundt individer når PBMC-afledt hele CD4

+ T-celler er præsensibiliseret med NY-ESO-1 overlappende peptider. Men vi for nylig rapporteret, at NY-ESO-1-specifikke CD4

+ T-celler kunne induceres fra CD45RA

+ naive CD4

+ T-celler i raske donorer efter

in vitro

præsensibilisering ved at fjerne CD25

+ regulatoriske T-celler [36], [37]. Disse resultater indikerer, at NY-ESO-1-specifikke CD4

+ T-celle-forstadier er til stede i raske individer er modtagelige for undertrykkelse af regulatoriske T-celler, men hos cancerpatienter,

in vivo

-primet NY-ESO -1-specifikke CD4

+ T-celler bliver resistente over for denne undertrykkelse [36], [37]. Påvisning af IFN-γ-secernerende p53-specifikke CD4

+ T-celler i raske individer efter en enkelt

in vitro

sensibilisering i tilstedeværelsen af ​​regulatoriske T-celler tyder på, at de allerede er primet

in vivo

. For at bestemme aktiveringsstatus af p53-specifikke CD4

+ T-celler i raske donorer, naive og antigen-erfarne CD4

+ T-celler blev separeret baseret på CD45RA-ekspression og blev stimuleret med p53 overlappende peptider. Induktion af p53-specifikke CD4

+ T-celler blev vurderet ved ELISPOT-analyser. Som vist i figur 5A og 5B, i modsætning til hvad der var blevet observeret med NY-ESO-1-specifikke CD4

+ T-celler, p53-specifikt IFN-γ-producerende CD4

+ T-celler kunne påvises fra en CD45RA

– antigen-erfarne population af raske donorer. Desuden blev mindre responser induceres også fra CD45RA

+ naive T-celle population (figur 5A). Fordi CD45RA er ikke en absolut markør for naive T-celler, er der stadig en mulighed for, at p53-specifikke CD4

+ T-celler i CD45RA

+ T-celle population allerede blev aktiveret

in vivo

[ ,,,0],38]. Men dette resultat indikerede, at mindst en del af p53-specifikke CD4

+ T-celler er blevet primet

in vivo

selv i raske individer.

(A-B)

In vivo

priming af p53-specifikke CD4

+ T-celler i raske individer. CD4

+ CD45RA

+ naive og CD4

+ CD45RA

– antigen-erfaren T-celler blev isoleret ved flowcytometri og præsensibiliseret med p53 overlappende peptider. Efter 20 dage blev p53-specifikke IFN-y-producerende T-celler vurderet ved ELISPOT-analyser. Autologe T-APC’er blev anvendt som APC’er. (C) anerkendelse af naturligt forarbejdede p53-protein. p53-specifikke CD4

+ T-cellelinjer mod p53 # 1- # 15 peptider pool eller # 16- # 30 peptider pool var etableret fra 3 raske donorer, som beskrevet i materialer og metoder. De blev stimuleret af autolog mo-DC præ-pulset med p53-peptider, p53-protein eller NY-ESO-1 protein. IFN-γ-produktion blev evalueret ved ELISPOT-analyser (venstre) og ELISA (højre). Fejl søjler repræsenterer SD af dobbelte brønde.

Karakterisering af p53-specifikke CD4

+ T-celler

For yderligere at karakterisere p53-specifikke CD4

+ T-celler i raske donorer, blev p53-specifikke T-cellelinier frembringes ved at isolere CD154 udtrykkende CD4

+ T-celler efter restimulering med p53-peptider efterfulgt af polyklonal ekspansion med PHA (data ikke vist). Denne CD154 ekspressionen-baserede metode blev anvendt til at detektere flere CD4

+ T celle-undergrupper til analyse af cytokinproducerende mønster [28]. Fire CD4

+ T-cellelinjer blev frembragt mod p53 peptidpools fra 3 raske donorer. Alle CD4

+ T-cellelinjer specifikt produceret GM-CSF, som fremstilles af både Th1 og Th2-celler, efter stimulering med peptid-pulserede mo-DC’er (tabel 1). Niveauer af andre cytokiner produceret af CD4

+ T-cellelinjer er vist i tabel 1. I overensstemmelse med en effektiv detektion af p53-specifikke CD4

+ T-celler ved IFN-y ELISPOT-analyser, alle p53-specifikke CD4

+ T-cellelinier fra raske donorer producerede store mængder af IFN-γ. Ud over IFN-γ blev signifikante niveauer af IL-13 og små mængder af IL-4 også specifikt produceret, hvilket indikerer, at T-cellelinier var en blanding af Th1 og Th2-celler. To CD4

+ T-cellelinier producerede små niveauer af immunregulerende cytokin, IL-10. En CD4

+ T-cellelinje producerede små men signifikante niveauer af IL-9, som er produceret af Th9 og reguleres af IL-4 og TGF-β, potentielt indikerer tilstedeværelsen af ​​TGF-β-signalering under differentieringen af ​​p53 -specifik CD4

+ T-celler. Men produktionen af ​​TGF-β blev ikke påvist i supernatanten (data ikke vist). Desuden IL-17, som er produceret af Th17, blev ikke detekteret i nogen CD4

+ T-cellelinjer (data ikke vist). Dernæst blev anerkendelsen af ​​naturligt forarbejdet p53 protein undersøgt ved hjælp af autologe mo-DCs som APC. Som vist i figur 5C, alle CD4

+ T-cellelinier effektivt anerkendt p53-protein-pulseret målceller som påvist ved IFN-γ-sekretion. Dette resultat viser p53-specifikke CD4

+ T-celler kan påvises i raske donorer er i stand til at genkende naturligt forarbejdede p53-protein og gør det usandsynligt, at de er aktiveret

in vivo

af andre proteiner med lignende sekvenser.

Discussion

Akkumulering af muteret p53-protein i tumoren observeres hyppigt i mange typer af tumorer og inducerer humorale immunresponser, hvilket viser kraftig immunogenicitet af p53 [12]. Således har p53 været betragtet som et lovende mål for vaccination mod flere former for kræft. Alligevel rapporterer vi her den manglende detektering

in vivo

-primet p53-specifikke CD8

+ T-celle-responser i cancerpatienter med spontane antistoffer mod p53 samt i p53-seronegative patienter og hos raske donorer bruge vores single

in vitro

overfølsomhed protokol. I modsætning hertil den samme protokol hyppigst påviste NY-ESO-1-specifikke CD8

+ T-celler i NY-ESO-1-seropositive kræftpatienter i samme undersøgelse kohorte, hvilket indikerer, at naturlige immunogenicitet at inducere spontan CD8

+ T celle responser kan være anderledes i p53 og NY-ESO-1 selv i seropositive patienter til disse antigener. Det blev rapporteret, at skønt cyclin B1-specifikke CD8

+ T-celler blev spores efter en enkelt

in vitro

stimulering, p53-specifikke CD8

+ T celler mod 6 HLA-A * 02 bindende korte kunne ikke påvises peptider i 5 cyclin B1-reaktive og 5 ikke-reaktive patienter med den samme metode [39]. Vores resultater udvide deres bemærkninger ved at overvåge CD8

+ T-celle responser til hele regionen af ​​proteinet ved hjælp overlappende peptider og ved at inkludere med immunomonitoring af spontan antistof og CD4

+ T-celle responser. Adskillige vaccine forsøg såsom p53-transducerede DCs eller lange overlappende peptider har rapporteret induktion af T-celle responser med begrænset klinisk fordel [23], [24], [40], [41].