PLoS ONE: hypometylering of intragensekvenserne LINE-1 undertrykker Transskription i cancerceller gennem AGO2

Abstrakt

I humane kræftformer, er methylering af lange afbrudt nukleare element -1 (LINE-1 eller L1) retrotransposoner reduceret. Dette sker inden for rammerne af genomet bred hypometylering, og selv om det er almindeligt, er dens rolle dårligt forstået. L1S er vidt udbredt både i og uden for gener, intrageniske og intergeniske henholdsvis. Interessant indsættelse af aktive fuld længde L1-sekvenser ind i værtsceller gen introns ødelægger genekspression. Her har vi vurderet, om intragenisk L1 hypometylering påvirker deres vært genekspression i kræft. Først udvundet vi data fra L1base (https://l1base.molgen.mpg.de), en database, der indeholder formodet aktive L1 indrykninger, og sammenlignede intrageniske og intergeniske L1 tegn. Vi fandt, at intrageniske L1 sekvenser er blevet konserveret tværs evolutionær tid med hensyn til transkriptionel aktivitet og CpG-dinukleotid sites for mammal DNA-methylering. Derefter sammenlignede vi reguleret mRNA-niveauer af celler fra to forskellige eksperimenter tilgængelige fra Gene Expression Omnibus (GEO), en database repository af high throughput genekspression data, (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) ved chi-square. De odds ratio på ned-regulerede gener mellem demethyleret normal bronkieepitel og lungekræft var høj (p 1E

-27, OR = 3,14; 95% CI = 2,54-3,88), hvilket tyder på kræft genom bred hypometylering nedregulere gen udtryk. Omfattende analyse mellem L1 steder og genekspression viste, at ekspression af gener der indeholder L1S havde en signifikant højere sandsynlighed for at blive undertrykt i cancer og hypomethylated normale celler. I modsætning hertil er mange mRNA afledt af gener, der indeholder L1S forhøjet i Argonaute 2 (AGO2 eller EIF2C2) -depleted celler. Hypomethylated L1S øge L1 mRNA-niveauer. Endelig fandt vi, at AGO2 mål intron L1 præ-mRNA-komplekser og undertrykker cancer gener. Disse resultater repræsenterer en af ​​de mekanismer i kræft genom bred hypometylering ændre genekspression. Hypomethylated intragenisk L1S er en nuklear siRNA medieret

cis

reguleringsmyndigheder element, der kan undertrykke gener. Denne epigenetisk regulering af retrotransposoner sandsynlige påvirkninger mange aspekter af genomisk biologi

Henvisning:. Aporntewan C, Phokaew C, Piriyapongsa J, Ngamphiw C, Ittiwut C, Tongsima S, et al. (2011) hypometylering af intragensekvenserne LINE-1 undertrykker Transskription i kræftceller via AGO2. PLoS ONE 6 (3): e17934. doi: 10,1371 /journal.pone.0017934

Redaktør: Esteban Ballestar, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), Spanien

Modtaget: 14. september 2010; Accepteret: 18 februar 2011; Udgivet: 15. marts 2011

Copyright: © 2011 Aporntewan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse understøttes delvist af forskningsfonden Thailand (TRF), det nationale center for Genetic Engineering og Bioteknologi (BIOTEC), National Science and Technology Development Agency (NSTDA), Four Seasons Hotel Bangkok og den thailandske Røde Kors 4th Cancer Care Charity og Chulalongkorn. Chureerat Phokaew understøttes af en Royal Golden Jubilee Ph.D. tilskud (PHD /0190/2550), franske ambassade i Thailand og Chulalongkorn. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i kræft, DNA-methylering i resten af ​​genomet, især i en lang indflettet nuklear element-1 (LINE-1 eller L1) retrotransposon, almindeligvis forarmet og denne begivenhed indtræffer i forbindelse med genom eller global hypomethylering [1], [2], [3]. Global hypomethylering kan spille flere roller i flertrins carcinogenese. Mest almindeligt anerkendt virkning er at lette kromosomal ustabilitet [4], sandsynligvis medieret af hypomethylated genom forbundet replikation uafhængig DNA dobbeltstrengsbrud risiko for fejl reparation [5], [6]. For nylig er der en rapport, som hypometylering af et L1 aktiverer alternativ promotor af MET onkogen [7]. Men rollen som global L1 methylering, om genom bred genekspression, er mindre hyppigt undersøgt og således ikke velkarakteriseret.

DNA methylering er et grundlæggende molekylær karakteristik af det humane genom, og ændring af denne epigenetisk regulering er forbundet med cancere [2]. Virkningerne af promotor-methylering på kromatin konfiguration og gentransskription er blevet veldokumenteret [8]. I modsætning hertil mekanismerne, hvordan DNA methylering i et gen (gen organ methylering) styrer genekspression, er mindre kendt. Gene organ methylering ændringer kan besidde flere konsekvenser. Unikke methylerede sekvenser i introner ofte findes i højt udtrykte gener [9]. I modsætning hertil dannelsen af ​​heterochromatin af tæt intragenisk DNA-methylering begrænser effektiviteten af ​​RNA-polymerase [10]. Alligevel disse beviser antydede, at methylering af intrageniske repetitive sekvenser, herunder L1S, også kan være vigtigt for at opretholde den normale funktion af bundet genomiske loci.

L1S er også vidt udbredt i genomet [11]. L1 indsættelse har flere potentielle funktionelle konsekvenser [12]. Det er bemærkelsesværdigt, at L1S ikke er jævnt fordelt [11], og mange er udelukket fra genomiske regioner, der indeholder husholdningsgener [13]. En genetisk manipuleret in vitro-undersøgelse viste, at indsættelsen af ​​aktive L1 sekvenser i værtsgen introns forstyrrer genekspression [14]. Gennem evolution, retrotranspositionshastigheder begivenheder produceret 500.000 eksemplarer af L1 i det menneskelige genom [15]. Men ikke alle L1S er fulde længde og aktiv; de fleste er trunkeret. Der er 80-100 retrotranspositionshastigheder-kompetent L1S i det humane genom, men kun seks af disse menes at ligge til grund for alle historiske retrotranspositionshastigheder begivenheder [16]. Mere end 10.000 L1S er længere end 4,5 kb og indeholder en 5 ‘UTR, to åbne læserammer og en 3’UTR, der indeholder et polyadenyleringssignal [17]. Mere end 2.000 af disse L1S er intragenisk, og de bor i mere end 1.000 gener.

For nylig har vi vurderet de mønstre for methylering af 5’UTR’er af L1-sekvenser [1], [18] og fandt, at methylering varierer ved hvert locus og i forskellige celletyper i vildtypeceller. I humane cancere, er methylering af L1 retrotransposoner reduceret variabelt [1], [18], [19]. Tabet af genomet bred L1 methylering i cancerceller forekommer som et generaliseret proces. Imidlertid er L1 methylering påvirket af dens placering i genomet [18]. For eksempel er L1S i forskellige introner af de samme gener i almindelighed modificeres på tilsvarende måde [18]. L1 hypomethylering er korreleret med visse cellulære fænotyper. I kræft, er L1 hypometylering direkte forbundet med flertrins carcinogenese og aggressive kræftformer med dårlige prognoser [1], [20], [21], [22], [23], [24]. Desuden er der i normale celler methylering af L1 kan ændres i forbindelse med visse cellulære fænotyper såsom høj kræftrisiko, vævsdifferentiering og kosten [25], [26], [27], [28], [29], [30] [31], [32], [33]. Interessant intersperse repetitive sekvens (IRS) hypometylering mønstre er forskellige i celler med forskellige fænotyper. For eksempel er Alu hypometylering almindeligt forekommende i aldrende celler, men L1 hypometylering er ikke [34]. Disse linjer af beviser føre os til hypotesen, at tusinder af gener kan reguleres ved intragenisk L1 hypometylering i kræftceller.

Her har vi udtrukne data fra L1base (https://l1base.molgen.mpg.de) [ ,,,0],17], til en database, der indeholder formodet aktive L1 indrykninger, sammenligne intrageniske og intergeniske L1 tegn. Derefter sammenlignede vi mRNA-niveauer fra hypomethylated normale celler og cancer ekspressionsarray biblioteker, der er tilgængelige fra Gene Expression Omnibus (GEO), en database repository af high throughput genekspression data, (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) [35], [36]. Endelig omfattende analyser mellem L1 steder og genome wide genekspression blev udført for at evaluere gen reguleringsmekanismer af intragenisk L1S i kræft.

Resultater

intragensekvenserne og intergeniske L1 sekvenser viser tydelige strukturelle træk

Sekvens varianter af hver langside L1 klassificeres efter evolutionære periode og retrotransposition aktivitet [17]. Her har vi analyseret hvis L1S kan skelnes afhængigt steder, hvis sekvenserne er i gener, intragenisk, eller i mellem gener, intergeniske (fig. 1A). Forskellige egenskaber, der er beskrevet i L1base [17], herunder kromosomal placering, underfamilie, sekvens og CpG øer, af 9355 intergeniske L1S og 2546 intragenisk L1S fundet i 1.454 gener blev evalueret af 218 chi-square test og 18 t-test (Støtte tabel S1 og S2). Eksempler på en chi-square test og en t-test blev demonstreret (fig. 1B og 1C). Statistisk analyse viste, at der er mange strukturelle karakteristika intragenisk L1S der er adskilt fra intergeniske L1S (fig. 1 og Støtte tabel S2). 100 chi-square test analyserede variationer af sekvenserne, der bestemmer L1 transkriptionel og retrotranspositional aktivitet og tilstedeværelsen af ​​CpG øer og 57 af prøverne var signifikant forskellige ved p-værdier 0,001 (. Figur 1D og Støtte tabel S2). Disse tests viste prævalens s af konserverede sekvenser af intrageniske L1S var altid højere end intergeniske L1S hvorimod alle muterede sekvenser var mere almindelige i intergeniske L1S (fig. 1D og støtte tabel S2). Derudover blev observeret hyppigere CpG øer intragenisk L1S (fig. 1D og støtte tabel S2). Dette fund blev støttet ved at sammenligne hjælp af 18 funktioner af t-test (fig. 1C, 1E og støtte tabel S2). Intergeniske L1S indeholder flere A- og T nukleotider, rammeforskydninger, mangler og stopkodoner. I modsætning hertil intrageniske L1S indeholder højere G-C indhold og intakt score (fig. 1E og Støtte Tabel S2). Som konklusion har intrageniske L1-sekvenser blevet bevaret tværs evolutionær tid med hensyn til transkriptionel aktivitet og CpG-dinukleotid sites for mammal DNA-methylering. Disse resultater indebar fysiologiske funktioner intragenisk L1 methylering.

A) L1S blev delt i to klasser, intrageniske og intergeniske L1S som er repræsenteret ved blå og røde pile hhv. B) Forskellene i strukturelle egenskaber mellem L1 grupper blev analyseret ved hjælp af chi-square test for kategoriske funktioner og C) homoscedastic

t

-test for ikke-kategoriske funktioner. D) 100 p-værdier af chi-square test af tre klasser af L1 sekvens tegn blev de konserverede sekvenser, de muterede sekvenser og tilstedeværelsen af ​​CpG-øer, der findes overrepræsenteret eller underrepræsenteret i intrageniske L1S vises, intragenisk L1S intergeniske L1S og intergeniske L1S intrageniske L1S hhv. E) 18 p-værdier for t-test af L1 tegn, er overrepræsenteret og underrepræsenterede i intrageniske L1S blev vist i blåt, intra inter, og rød farve, inter intra henholdsvis

intragensekvenserne. L1S undertrykke gener i kræftceller

L1S er hypomethylated i mange kræftformer [1]. For at undersøge om intrageniske L1S kontrol vært gener i L1 hypomethylated kræftceller, vi sammenlignet genekspression i kræft mellem gener besidder intragenisk L1S og resten. Gener besidder L1S blev bestemt ved L1base [17] og udtryk microarray data er offentligt tilgængelige data fra GEO [35], [36]. Hvert gen blev klassificeret af to studerende t-tests, op- og ned-regler. Hvis middelværdien af ​​cancer gruppe var statistisk højere eller lavere end normalt gruppe, blev genet klassificeret som op- eller nedreguleret, hhv. Hvis t-test ikke var statistisk signifikant, blev genet klassificeret som ikke op- eller ikke nedreguleret henholdsvis. Fordelingen af ​​gener besidder L1S som viste forøget ekspression i cancer blev sammenlignet med resten af ​​gen indstilles ved chi-square test (fig. 2A). Den samme analyse blev udført for gener med nedsat udtryk i kræft (Fig. 2B). Figur 2A og 2B demonstrerede eksempler på chi-square tests for genekspression i gastrisk cancer. Gener besidder intrageniske L1S fandtes mindre tilbøjelige til at være opreguleret (odds ratio (OR) = 0,61, p = 3.04E-06) (fig. 2A). Endvidere ekspression af gener, der indeholder L1S var mere almindeligt faldt (OR = 1,64, p = 2.66E-13) (fig. 2B). Intragensekvenserne L1S kan styre hundredvis af gener. Blandt 1.340 gener indeholdende L1S blev 1.242 gener ikke opreguleret og 304 gener blev nedreguleret (fig. 2A og 2B). Analyse af en række ekspressionsvektorer arrays viste lignende resultater. Vi testede hoved og hals pladecellekarcinom, cervicale cancerceller, lunge adrenocarcinoma celler, levercancer, brystcancerceller, duktal og luftrør brystcancer, blærecarcinom situ, mikrosatellit ustabilt gastrisk cancer, metastase prostatacancer. Vi fandt, at gener nedreguleret i cervicale cancerceller, lunge adrenocarcinoma celler, brystcancerceller, duktal og luftrør brystcancer, blærecarcinom situ, mikrosatellit ustabilt mavekræft er mere tilbøjelige til at indeholde L1S. Desuden gener med højere ekspressionsniveauer i hoved og hals pladecellekarcinom, cervicale cancerceller, levercancer, brystcancerceller, blærecarcinom situ, mikrosatellit ustabilt gastrisk cancer, metastase prostatacancer er mindre tilbøjelige til at besidde L1S (Støtte Tabel S3 og Fig . 2C). Derfor kan intrageniske L1S undertrykke værtsgener i disse kræftformer. Selvom in vitro-indsættelse af aktive L1 sekvenser i værtsgen introner afbrudte gen-ekspression [14], de fleste mRNA-niveauer fra gener indeholdende L1 var ikke fraværende (Støtte fig. S1). Endvidere viser en sammenligning af gener i cancer, som beskrevet i støttebordet S3.1-S3.9, viste, at sandsynligheden for gener indeholdende L1 til at blive almindeligt nedreguleret i uafhængige eksperimenter er højere end gener uden L1 (p-værdi = 7.99E-08, gennemsnitlig L1 = 1,6642, mener ingen L1 = 1,4861) (Støtte fig. S2). Disse analyser understøttes biologiske betydning af intragenisk L1S i genregulering i kræft.

A) og B) er chi-square 2 × 2 tabeller, p-værdier og odds ratio, sammenligner andele af mavekræft gener besidder L1S mellem op – ( “Op”) eller down- ( “down”), reguleret og ikke op- eller ikke nedreguleret grupper, hhv. C) Procentdelen af ​​L1-holdige mRNA’er, der er op- eller nedreguleret i forskellige cancertyper. D) EPHA3 mRNA og L1-EPHA3-IVS5 og IVS15 methylering niveauer i WSU-HN-celler og Aza-dC-behandlet WSU-HN17s. E) To chi-square 2 × 2 tabeller, p-værdier og odds ratio, sammenligner andele af Aza-dC-behandlede hBECs eller hMSC’er gener besidder L1S mellem nedreguleret ( “Down”) og ikke nedreguleret grupper, hhv. F)% af mRNA’er fra gener indeholdende L1S i Aza-dC-behandlede hBECs og hMSC’er. “Op” og “Down” tyder på øget og nedsat udtryk, hhv. GSE optegnelser, GSM prøver og typen af ​​

t

-test og 2 × 2 tabeller af chi-square test findes i Støtte tabel S3.

For at demonstrere forholdet mønstret mellem L1 methylering niveauer og genekspression, målte vi intrageniske L1 methylering niveauer og vært genets mRNA-niveau. Vi har tidligere evalueret methylering niveauer af 17 intragenisk L1 loci og fandt, at L1 methylering niveauer af L1-EPHA3-IVS5 og L1-EPHA3-IVS15 er stærkt korreleret i kræftceller, hvilket tyder locus specifik mekanisme [18]. Måling af intrageniske L1-EPHA3 methylering og EPHA3 mRNA niveauer i hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) cellelinjer (WSU-HNS) viste, at lavere niveauer af intragenisk L1-EPHA3-IVS5 og L1-EPHA3-IVS15 methylering korreleret med lavere EPHA3 mRNA-niveauer (Pearson r = 0,7961 og 0,7638, henholdsvis;. figur 2D). EPHA3 mRNA i WSU-HN17 celler var også signifikant lavere, når L1-EPHA3 blev hypomethylated (parret

t

-test; p 0,001;. Figur 2D). Derfor kan niveauet af mRNA være direkte korreleret med intragenisk L1 methylering.

Tab af methylering i normal celle undertrykker gener, som skjuler L1S

En analyse af genekspression i humane bronkiale epitelceller (hBECs ) og humane mesenchymstamceller (hMSC’er) efter genom bred demethylering med 5-aza-2′-deoxycytidin (aza-dC) behandling udviste større forekomst af intragenisk L1S i nedregulerede gener (OR = 1,52, p = 0,0017 og OR = 1,62, p = 0,0069, henholdsvis) (fig. 2E, 2F og støtte tabel S3), interessant, et lignende mønster som findes i kræft (fig. 2C). Vi nærmere, hvis genom bred hypometylering regulerede gener i cancer. Vi udførte en chi-square test for at bestemme betydningen af ​​overlapning mellem nedregulerede gener i demethylerede hBECs og i lungecancer. Gener, som blev nedreguleret i Aza-dC behandling på hBECs fandtes fortrinsvis at have lavere mRNA-niveauer i kræftceller i lungerne (p = 2.67E-28; OR = 3,14; 95% CI = 2,54-3,88; Figur 3A og 3B og støtte tabel S4). Dette understøtter hypotesen om, at hypometylering ned regulerer gener i cancer.

A) 2 × 2 tabeller, s værdier og odds ratio og B) odds ratio for mRNA, der er under-udtrykkes ( “Down”) i lungekræft og Aza-dC-behandlede HBEC celler sammenlignet med ikke-Aza-dC-behandlede HBEC celler til (A og B) alle gener, (B) gener med L1S (L1) og gener uden L1S (Ingen L1). B) Den midterste, øverste og nederste linjer af hver to-farve box er odds ratio og øvre og nedre 95% konfidensinterval (CI), hhv. C) 2 × 2 tabeller, p-værdier og odds ratio og D) procentdele af mRNA’er, der er under-udtrykt ( “Down”) i begge Aza-dC-behandlede celler og cancerceller sammenlignet med gener, der ikke er nedreguleret i Aza-dC -behandlede celler eller kræft, for gener med og uden L1S (L1 og nr L1). De tilsvarende 2 × 2 kontingenstabeller for A) og B), og C) og D) leveres i Støtte tabel S4, og S5, henholdsvis.

Interessant hypometylering ned regulerer begge grupper af gener , med L1 (p 2.59E-04 OR = 3,24; 95% CI = 1,73-6,05; Støtte tabel S4) og uden L1 (p 2.34E-24, OR = 3,09; 95% CI = 2,46-3,87; støtte tabel S4). Derfor er det muligt, at der ud over L1 er der andre DNA methyleret gen kropselement at regulerede genekspression. Denne hypotese understøttes af en nylig rapport, at der i gen krop, unikke methylerede sekvenser er mere forekomst i højt udtrykte gener [9]. For yderligere at differentiere rolle L1S, vi sammenlignet mellem gener med og uden L1S. Vi fandt, at tilfælde af nedregulering af gener i både Aza-dC behandlede hBECs og lungekræft er mere udbredt i gener indeholdende L1S end i gener uden L1. (OR = 2,08, p = 0,009;. Figur 3C og 3D og Støtte tabel S5). Derfor hypometylering nedsætter ekspressionen af ​​mange gener i kræft, og intragenisk L1S fungere som en methylering-medieret

cis

reguleringsmyndigheder element.

Mange gener ofte nedreguleret i cancer display hypermethyleret initiativtagere [8] . Vi fandt imidlertid ingen sammenhæng mellem promotor hypermethylering i kræft og tilstedeværelsen af ​​intragenisk L1S. Gener med hypermethyleret promotor har vist sig at være opreguleret når cellerne blev demethyleret. Den ekspression af gener med L1 blev ikke ofte øges, når kræftceller blev demethyleret (Støtte tabel S6.1 og S6.2).

L1 hypometylering øger L1 RNA-niveauer

Måling af methylering og RNA niveauer viste en omvendt korrelation mellem genom bred L1 methylering og L1 RNA (Pearson r = -0,6955;. figur 4A). Dette fund understøtter den hypotese, at L1 hypometylering øger L1 RNA-transkription [37]. Introniske gener er blevet foreslået til dannelse af afvigende RNA komplekser med værtsgener og dermed inaktivere værtens gentranskription [38]. L1S er retrotransposable elementer, der kan stadig besidder transkriptionsaktivitet på et betydeligt antal loci [29]. Desuden er nogle L1S transskriberet ud over deres polyA addition sites og dermed producere kimære RNA, der omfatter både L1 og unikke intronsekvenser [39]. Vi screenet for og fundet L1-EPHA3 RNA fra intron 15 i EPHA3 genet og observeret en signifikant omvendt sammenhæng mellem L1-EPHA3 RNA og L1-EPHA3 methylering (Pearson r = -0,8686;. Figur 4B). Derfor L1 hypometylering fører til øget L1 transskription og dermed producerer mere intron L1 RNA.

A) Genom bred L1 methylering og L1 RNA-niveauer i WSU-HN celler. B) L1-EPHA3 methylering og L1-EPHA3 RNA niveauer.

intragenisk LINE-1 elementer undertrykke transskription i kræftceller via AGO2

retrotransposon RNA eller afskrifter danner dsRNA strukturer udløse RISC samling [40]. Efter binding små interfererende RNA’er (siRNA), RISC genkender og nedbryder komplementære RNA-molekyler [41]. L1S besidder op til tre interne promotorer, ved 5′- og 3′-ender og i 5 ‘antisense retning [42], [43], [44]. Sense- og antisense-promotorer i 5’-UTR producere tovejskommunikation transkripter, der derefter forarbejdes til siRNA’er at forhindre retrotransposition [40]. Derfor hypotese vi, at L1 RNA og intron-præ-mRNA af gener indeholdende L1S grund af komplementariteten mellem de to sekvenser, danner dsRNA der kan målrettes ved RISC dermed nedbryder mængden af ​​mRNA afledt fra gener indeholdende L1S. Den RISC-komplekset består af Dicer, Argonaute og siRNA. En lignende kompleks med AGO2 virker til at lukke munden gentranskription i kernen [45], [46].

Hvis intragenisk L1 RNA reducerer vært gen mRNA via AGO2 vil AGO2 protein afsavn føre til øge mRNA niveauer af gener hosting L1S. Analyse af mRNA microarray af AGO2 nedreguleres celler, AGO2sh [47], viste, at den begrænsede ekspression af AGO2 i en human embryonal nyre-cellelinie (HEK293T) resulterede i et ekspressionsmønster af gen indeholdende L1S der var modsat der observeret under L1 hypometylering; nemlig, de var mere tilbøjelige til at være opreguleret (OR = 1,44, p = 0,0004;. figur 5A og 5B og Støtte tabel S3). Den shRNAs af DICER1, AGO1, AGO3 og AGO4 ikke opregulere gener med L1 (Støtte Tabel S6.3-S6.7). Dette antydede, at AGO2 fortrinsvis begrænser koncentrationen af ​​mRNA’er afledt af gener, der indeholder L1S. Vi evalueres yderligere en mRNA microarray eksperiment hybridiseret af AGO2 udfældet RNA [48] og fandt, at AGO2 ikke direkte kan forringe mRNA, der er afledt af gener, der indeholder L1S. Selvom RISC binder og nedbryder mRNA, mRNA’er afledt af gener, der indeholder L1S var mindre tilbøjelige til at blive bundet af AGO2 (OR = 0,64, p = 0,009;. Figur 5A og 5B og støttebord S3), der oprindeligt var overraskende i betragtning af resultaterne af AGO2sh eksperimenter (fig. 5A og 5B og Støtte tabel S3).

A) 2 × 2 tabeller, p-værdier og odds ratio og B) procentdele af L1 indeholder-gener, der udviser øget mRNA-niveauer i AGO2sh-behandlede celler ( “Op”), eller er bundet af AGO2 i AGO2IP ( “Bound”), hhv. C) 2 × 2 borde, p-værdier og odds ratio og D) odds ratio (95% CI) sammenligner HEK293T mRNA mellem opreguleret gener og ikke opreguleret gener på AGO2sh og bundet af AGO2 proteiner til alle gener (D), gener med L1S (L1) og gener uden L1S (nr L1), (C og D). D) Den midterste, øverste og nederste linjer af hver to-farve box er odds ratio og øvre og nedre 95% CIs hhv. E) Niveauer af AGO2, EPHA3 mRNA og L1RNA i WSU-HN17 AGO2si celler. Data repræsenterer middelværdier ± SEM. GSE optegnelser, GSM prøver, type

t

-test for A) og B) er angivet i Støtte tabel S3. 2 × 2 kontingenstabeller til C) og D) er givet i støtte Tabel S4. F) To scenarier for AGO2-target binding afspejler i forskellige mRNA-array ved brug AGO2-IP og AGO2sh som prober. Negativt resultat var forventet fra mRNA udtryk microarray hjælp AGO2-IP-RNA som prober, ( “AGO2-IP + mRNA array”), når introner af præ-mRNA var målrettet. Blev dog positivt resultat forventes fra mRNA udtryk microarray hjælp mRNA fra AGO2sh som prober, ( “AGO2sh + mRNA array”), uanset AGO2 mål præ-mRNA eller mRNA.

Når man sammenligner AGO2-bundne mRNA’er