PLoS ONE: En ny Microarray Substrat for Ultra-Sensitive Genotypning af KRAS og BRAF genvarianter i kolorektal Cancer

Abstrakt

Molekylær diagnostik af humane kræftformer kan øge nøjagtigheden i prognosen, lette udvælgelsen af ​​den optimale terapeutiske regime , forbedre patientens resultat, reducere udgifterne til behandling og fordel udvikling af personlige tilgange til patientpleje. Desuden sensitivitet og specificitet er grundlæggende kendetegn for enhver diagnostisk metode. Vi udviklede en meget følsom microarray til påvisning af fælles KRAS og BRAF onkogene mutationer. I colorektal cancer, har KRAS og BRAF-mutationer er vist at identificere en klynge af patienter, der ikke reagerer på anti-EGFR terapier; identifikation af disse mutationer er derfor klinisk ekstremt vigtigt. For at kontrollere de tekniske karakteristika microarray system til korrekt identifikation af KRAS mutations status på de to hotspot-codon 12 og 13 og af BRAF

V600E mutation i kolorektal tumor, valgte vi 75 prøver tidligere karakteriseret ved konventionel og CO- forstærkning ved Lavere Denaturering temperatur-PCR (COLD-PCR) efterfulgt af High resolution Melting analyser og direkte sekventering. Blandt disse prøver, 60 blev indsamlet under operationen og straks gennemsyret af RNAlater mens de 15 rester var formalin-fikseret og paraffin-embedded (FFPE) væv. Detektionsgrænsen for den foreslåede metode var anderledes for de 7 KRAS testede mutationer og for V600E BRAF mutation. Navnlig har microarray systemet kunnet påvise et minimum på ca. 0,01% af muterede alleler i en baggrund af vildtype-DNA. En blind validering viste fuldstændig overensstemmelse mellem resultater. Den fremragende aftale af resultaterne viste, at den nye microarray underlaget er meget specifik i at tildele den korrekte genotype uden tilsætning strategi

Henvisning:. Galbiati S, Damin F, Pinzani P, Mancini I, Vinci S, Chiari M et al. (2013) En ny Microarray Substrat for Ultra-Sensitive Genotypning af KRAS og BRAF genvarianter i kolorektal cancer. PLoS ONE 8 (3): e59939. doi: 10,1371 /journal.pone.0059939

Redaktør: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, USA

Modtaget: Juli 6, 2012; Accepteret: 21 februar 2013; Udgivet: 25 marts 2013

Copyright: © 2013 Galbiati et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Definition af molekylære signatur af menneskelige kræftformer kunne være central til udviklingen af ​​en personlig tilgang til behandlingen af ​​patienten. Faktisk udpeges egnede biomarkører kan øge nøjagtighed i prognosen, lette udvælgelsen af ​​den optimale terapeutiske regime, forbedre patientens udfald, og reducere udgifterne til behandling [1]. Således lagdeling af enkelte patienter baseret på molekylære og genetiske karakteristika er den forventede udvikling i den moderne klinisk onkologi.

For nylig terapeutiske midler rettet mod specifikke genetiske varianter og godt karakteriserede molekylære tilgange er blevet udviklet. Dette er tilfældet for onkogenet KRAS som er en del af signalvejen af ​​flere forskellige molekyler. Gain-of-function missense-mutationer er ofte somatisk erhvervet i colorektal cancer, overvejende på tre brændpunkter repræsenteret ved kodoner 12, 13 og 61. Desværre på disse niveauer antallet af substitutioner er høj, hvilket gør deres detektion mere kompleks med allelspecifik teknikker. Konstitutivt, kan aktiverende mutationer i disse varme spot sites bestemme modstanden mod EGFR-målrettede terapier, som ellers væsentligt bør forbedre overlevelsesraten og livskvaliteten for patienter [2], [3], [4], [5]. Potentialet i KRAS codon 12/13 mutationer som effektive molekylære markører for udvælgelse stof har fået stor opmærksomhed, der fører til deres anvendelse i den rutinemæssige behandling af patienter med kolorektal cancer [6]. Den europæiske sundhedsmyndighed (https://www.emea.europa.eu/pdfs/human/press/pr/27923508en.pdf.) Samt American Society of Clinical Oncology [7] og National Comprehensive Cancer Network (NCCN , https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/PDF/colon.pdf.) kræver KRAS mutationsanalyse på kolorektal cancer før anti-EGFR-behandling.

En anden lovende biomarkør for anti-EGFR modstand er repræsenteret ved BRAF

V600E mutation, der forekommer i omkring 10% af colorektale cancere. BRAF er den umiddelbare downstream effektor af KRAS i Ras /Raf /MAPK signalvejen og BRAF

V600E aktiverende mutation er gensidigt udelukkende for KRAS-mutationer [6]. Trods de aktuelt begrænsede data, og mangelen på fuldstændig enighed, er det sandsynligt, at BRAF-mutationer har en rolle i fastsættelsen af ​​respons på anti-EGFR mAb behandling, og det er forbundet med dårligere prognose, uafhængigt af behandling [8], [9]. Desuden kan patienter med tumorer, der bærer mutant BRAF også drage fordel af selektive BRAF-hæmmere såsom PLX-4032 [10].

I det nuværende scenario af screening strategier, de nuværende analysemetoder (konventionel sekventering, pyrosekventering osv .) er tidskrævende, dyrt og mangler robusthed. Et andet nyt spørgsmål er forbundet til den virkelige følsomhed af disse metoder, der synes at påvise minority muterede alleler kun når til stede i koncentrationer på over 10-20%. I tidligere værker [11], [12], understregede vi vigtigheden af ​​følsomhed i detektion af mindretal muterede alleler i biologiske prøver og bekræftede nytten af ​​COLD-PCR for deres berigelse, især i prøver med lave procenter af tumorceller. I gennemsnit 15% af patienterne oprindeligt klassificeret som negative for KRAS eller BRAF

V600E varianter blev fundet positive efter COLD-PCR [11], [12].

Mikroarrays repræsenterer en billig og præcis værktøj til parallel genotypebestemmelse af flere markører, der er egnede til rutinemæssig analyse i medicinsk diagnostik [13]. Her rapporterer vi om udviklingen af ​​et meget følsomt microarray til detektion af KRAS og BRAF-mutationer. Mikroarrayet er udviklet under anvendelse af en krystallinsk silicium objektglas belagt med en termisk dyrket siliciumdioxid (SiO

2) lag og funktionaliseres ved adsorption af en copolymer af dimethylacrylamid (DMA), N-acryloyloxysucinimide (NAS) og meta-acryloy propyl trimethoxysilan (MAPS), copoly (DMA-NAS-MAPS), oprindeligt udviklet til glas mikromatrice [14]. Rygraden i polymeren består af DMA, en monomer, der adsorberer til overfladen ved hydrogenbinding; NAS er den kemisk reaktive monomer, der reagerer kovalent med bio-sonder, mens MAPS bidrage til film stabilitet ved at kondensere med overflade silanoler. Proceduren Belægningen er enkel og reproducerbar, når der sammenlignes med organo-silanisering, en proces, der kræver stærkt kontrollerede forhold og lider af dårlig reproducerbarhed. Denne funktionelle polymer har været almindeligt anvendt i biosensor feltet for bio-funktionalisering af polystyren nanobeads [15], silicium microcantilevers [16], polydimethylsiloxan [17], og nitrocellulose [18] substrater.

Valget af siliciumsubstrat overtrukket med et lag af SiO

2 100 nm tykkelse fører til en kraftig intensivering af fluorescens på overfladen som følge af optisk konstruktiv interferens mellem den indfaldende og reflekterede lys af den fluorescerende stråling. Betingelsen for konstruktiv interferens på substratoverfladen er opfyldt i flere typer af objektglas belagt med lag af dielektriske eller metalfilm [19]. Men den er involveret i produktion af sådanne komplekse flerlagsstrukturer strategi ofte lider lav reproducerbarhed og vanskelig proces kontrol. Den simpleste konfiguration for at opnå en fluorescerende enhancement tæt til den, som multi-lag slides består af silicium plane reflektor belagt med en tynd film af SiO

2 [20], [21] foreslået af dette arbejde.

for at vurdere de tekniske præstationer af den nyudviklede platform og kontrollere dets evne til at korrigere genotypning af KRAS og BRAF

V600E mutationer i kolorektale tumorprøver, valgte vi 60 vævsprøver allerede klassificeres for disse genetiske varianter af komplette protokoller for konventionel og KOLDT -PCR, High resolution Melting analyse og direkte sekventering. Den fremragende resultat af resultaterne vil blive drøftet med henblik på at vise fordele og ulemper ved begge teknologier.

Materialer og metoder

Etik

Vævsprøver blev indsamlet på Azienda Ospedaliera Universitaria Careggi i Firenze (Italien) fra 75 patienter, der gennemgår kirurgi for CRC i perioden 1/6 /2009-2 /5/2011. Alle personer indskrevet i denne undersøgelse forudsat skriftligt informeret samtykke. Undersøgelsen blev godkendt af revisionen bestyrelsen for University of Florence. Desuden har vi brugt to cellelinier leveret af ATCC-LGC Standards Partnership: CCRF-CEM-cellelinie som reference for KRAS mutation p.G12D (heterozygot) og den humane melanoma cellelinie A375 som kilden til homozygot BRAF

V600E DNA . Den menneskelige kolorektal carcinom cellelinie SW620 (bruges som reference for KRAS-mutation pG12V, homozygousand human brystcancer MCF-7 (vildtype for både KRAS og BRAF-gener) blev leveret af Banca Biologica e Cell Factory (IRCCS Azienda Ospedaliera Universitaria San Martino -. IST Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro)

Prøveforberedelse

Sixty vævsprøver blev indsamlet under operationen og straks gennemsyret af RNAlater (Qiagen Gmbh, Hilden, Tyskland) ved 4 ° C i 24 timer og derefter opbevaret ved -80 ° C indtil analyse. Væv blev sprængt ved Tissue Lyser med rustfrit stål Beads 5 mm (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. DNA oprensning blev udført med QIAcube ™ og QIAamp DNA mini Kit (Qiagen )

koncentrationen af ​​DNA blev bestemt med NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (Thermo Scientific, DE, USA)

, blev også analyseret desuden 15 FFPE væv.. DNA fra FFPE væv blev ekstraheret ved hjælp af FFPE Tissue (Qiagen) efter producentens anvisninger.

DNA-prøver blev først undersøgt ved hjælp af konventionel PCR og COLD-PCR-amplifikation efterfulgt af HRM og direkte sekventering. Efterfølgende blev de blindt indsendt til analyse af den nyudviklede microarray enhed at vurdere sin evne i KRAS og BRAF-mutationer genotypebestemmelse.

Positive kontrolprøver var repræsenteret ved DNA af cellelinjer huser mutationer i target gener (Se foregående afsnit Etik). Især vildtype og mutant prøver blev analyseret separat som enkelte prøver og som blandinger, for at få kendt procentdel af muteret allel (fra 6% til 0,01%), der skal anvendes til bestemmelse af assay-følsomhed for KRAS p.G12D og BRAF V600E varianter.

Endvidere blev plasmid-DNA indeholdende vildtype sekvenser og alternativt alle de betragtede varianter anvendes til at opnå rekonstituerede prøver at bevise assay sensitivitet og specificitet for alle de andre KRAS-mutationer.

Mutagenese

Mutant-bærende plasmider blev genereret gennem kloning af specifikke mutageniserede PCR-produkter, der huser de syv testede i assayet mutationer og den tilsvarende vildtype-fragment. Mutageniserede fragmenter blev fremstillet under anvendelse af en modifikation af metoden tidligere rapporteret [22]. Kort beskrevet mutagenese blev opnået ved at dividere hvert amplikon i to fragmenter. Den “fragment 5 blev derefter amplificeret med den oprindelige forward primer og en revers primer mutagenisering indføre en konservativ transversion. Samtidig blev det fragment 3 amplificeret med den oprindelige reverse primer og en mutageniseret fremadrettet primer indføre den samme nucleotid variationen som ovenfor (se tabel S1). Dette førte til produktionen af ​​to delvist overlappende fragmenter, som var hver gel-elueret i et slutvolumen på 50-100 pi destilleret vand for at fjerne ikke-inkorporerede primere. Vi blandede 2 pi af hver eluerede opløsning sammen; hver blanding blev derefter forlænget i 15 cykler i nærvær af PCR-reaktionsblandingen indeholdt alle reagenser, men primere. Produktet fra forlængelsen reaktion, hvilket resulterer i en fuld-længde centralt mutageniserede fragment, blev yderligere PCR amplificeret i 20-30 cyklusser ved tilsætning af den fuldstændige PCR-blandingen og klonet i plasmidvektoren (TOPO TA Cloning, Invitrogen, LifeTechnologies, Milano, Italien ) ifølge producentens protokol. Direkte sekventering bekræftede, at det ønskede nukleotidændring blev indført i det mutageniserede kontrol

PCR-betingelser Salg

Exon 2 af KRAS-genet blev amplificeret med følgende primersæt:. 5′- GCC TGC TGA AAA TGA CTG AA-3 ‘(fremad) og 5′- AGA ATG GTC CTG CAC CAG TAA-3’ (5-amino-modificeret, reverse) generering af et 167 bp fragment. Primere anvendt til amplifikation af BRAF exon 15 (amplikonstørrelse 173 bp) var 5’TGC TTG CTC TGA TAG GAA AAT G-3 ‘(fremad) og 5′- CCA CAA AAT GGA TCC AGA CA-3’ (5-amino -modificeret, omvendt).

PCR for begge gener blev udført i 25 pi reaktion indeholdende 15 ng DNA, 200 uM af hvert deoxynukleotid, 10 mM Tris-HCI (pH 8,3), 50 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 1,5 U DNA-polymerase (AmpliTaq Gold, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og 10 pmol af hver primer. Cyklingsbetingelser indebar en indledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 35 cykler ved 95 ° C i 30 s, 58 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s, og en afsluttende forlængelse ved 72 ° C i 10 min .

PCR oprensning

Efter amplifikationsprocessen, hver amplikon blev oprenset og afsaltet med anvendelse af en 96-brønds plade (Multiscreen-PCR-plader MANU 030) kombineret med den Multiscreen Separation System (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA). PCR-produkter blev elueret i 35 pi 1 × trykning puffer (150 mM natriumphosphat, pH 8,5).

Reporter og stabilisator design

Journalister blev udformet i et dot-blot-format med basen variation svarende til hotspots placeret internt (tabel 1). En universel mærkning format blev anvendt (figur 1), er baseret på journalister, der indeholder en sekvens-specifik hale der hybridiserer til universal Cy3 eller Cy5 mærkede prober (vildtype sonde: CTC AAT GTT CGG ACT CAG-Cy3; mutant sonde: TGT CAA GCG ATA TAC TGC-Cy5) [23]

Hybridiseringsbetingelser trin:. 1) stabilisator oligonukleotid for at åbne den sekundære struktur af PCR-fragmentet; 2) “universel reporter mix”. Blandingen indeholder vildtype og mutant reportere. Hver reporter forlænges med en hale komplementær til den mærkede universelle oligonukleotid. Cyanin 3- (Cy3) og Cyanin 5- (Cy5) mærket universel oligonukleotid annealer til vildtype og mutant journalister, henholdsvis.

Stabilisator (oligonukleotid nødvendigt at åbne de sekundære strukturer til stede i amplikonet) og reporter design blev udført med hjælp af web-fri programmer (DNAmfold server: https://www.bioinfo.rpi.edu/Ezukerm/rna og OligoAnalyzer 3.0 af Integrated DNA Technologies: http: //www.idtdna .com) [24]. Alle journalister blev designet ved hjælp af antisense-strengen som målamplicon. Alle de 7 KRAS-mutationer blev analyseret med den samme stabilisator oligonukleotid rapporteret i tabel 1. codon 600 BRAF mutation krævede anvendelse af to stabilisatorer (Stab 1: placeret ved 5 ‘for mutationen; Stab 2: placeret på 3’ for mutationen , rapporteret i tabel 1).

Silicon glassets belægning og microarray forberedelse

Ubehandlet silicium glider 1000A Thermal Oxide (14 × 14 mm

2) blev leveret af SVM, Silicon Valley Microelectronics Inc . (Santa Clara, CA USA). Siliciumskiver blev forbehandlet med 0,1 M natriumhydroxid i 30 minutter og vasket med vand og tørret. Efter forbehandling blev siliciumskiver nedsænket i 30 minutter i en copoly (DMA-NAS-MAPS) opløsning (1% vægt /volumen i 0,9 M (NH4)

2SO

4 vandopløsning). Copoly (DMA-NAS-MAPS) blev syntetiseret og karakteriseret som beskrevet [14].

Objektglas blev endelig skyllet med vand og tørret under vakuum ved 80 ° C. Salg

PCR-produkterne for hver gen, amplificeret fra primere med en 5’primær aminogruppe, er nødvendige for at binde de amplikoner kovalent til substratet ved en reaktion mellem aminogrupperne og de aktive estere af polymerbelægningen, blev spottet på mikroarrayet substrater. Tre pi af amino-modificerede amplikoner blev trykt i 6 replikater ved hjælp af en piezoelektrisk spotter, SciFLEXARRAYER S5 (Scienion Tyskland), om coatede siliciumskiver. En amino-modificeret oligonucleotid mærket med Cy3 blev spottet som en positionel reference i fire kolonner i hver opstilling. Spotting betingelser blev udført ved som beskrevet [25]. Amplikonerne blev koblet til de arrays ved inkubation i en udækket opbevaringskasse, lagt i et forseglet kammer, mættet med natriumchlorid (40 g /100 ml H

2O) og inkuberet ved stuetemperatur natten over.

efter inkubering blev alle resterende reaktive grupper i overtrækspolymeren blokeret ved at dyppe slide i forvarmet blokerende opløsning som rapporteret [25].

hybridisering

Umiddelbart før hybridisering, trykte objektglas blev dyppet i 0,1 M NaOH i 5 min for at denaturere den dobbeltstrengede immobiliserede ampliconer, efterfølgende skyllet med vand og tørret. Sekvenser af reportere og stabilisatorer sammen med hybridiseringstemperaturer er anført i tabel 1. I det første trin blev 0,5 pi stabilisatoren oligonukleotid blandet med 49,5 pi hybridiseringsbuffer (2 x SSC, 0,1% SDS, 0,2 mg /ml BSA) op til 1 uM slutkoncentration og spredes på plettede område af objektglasset. Objektglassene blev inkuberet ved 20 ° C i 30 minutter i Thermomixer Comfort (Eppendorf) hybridisering kammer, og derefter vasket ved stuetemperatur i en 4 x SSC buffer til fjernelse dækglasset. Denne første vasketrin blev fulgt af en kort vask (30 s) i en lav-salt buffer (0,2 x SSC). Derefter til påvisning af G12S, G12D, G12C, G12R, G13D KRAS-mutationer og for BRAF

V600E mutationer, reporter for vildtype og de muterede sekvenser og deres tilsvarende universelle oligonukleotider mærket med Cy3 og Cy5 henholdsvis blev blandet sammen i ækvimolære mængder (slutkoncentration 1 uM) og tilsat til hybridiseringsbuffer (2 x SSC, 0,1% SDS, 0,2 mg /ml BSA) (se figur 1 til assayet ordning). I tilfælde af G12A og G12V KRAS-mutationer var det nødvendigt at inkubere de amplikoner i to på hinanden følgende trin. I det første trin amplikonerne blev hybridiseret med reporteren komplementær til den muterede sekvens sammen med den tilsvarende universel oligonucleotid mærket med Cy5; derefter, efter en kort vask i 4 x SSC for at fjerne dækglasset, i den anden amplikonerne blev hybridiseret med reporteren komplementært til vild-type og dets tilsvarende universel oligonucleotid mærket med Cy3. Begge inkubationer varede i 1 time.

Endelig silicium objektglas blev fjernet fra hybridiseringskammeret og gennemvædet kortvarigt i 4 x SSC buffer til fjernelse dækglasset, vasket to gange i 5 minutter i 2 x SSC /0,1% SDS , forvarmet ved specifik hybridisering temperatur, derefter dyppet i rækkefølge i en opløsning 0,2 x SSC og 0,1 x SSC i 1 min ved stuetemperatur, tørret ved centrifugering ved 780 rpm i 3 minutter og scannes.

Billede scanning og dataanalyse

ProScanArray (Perkin Elmer, MA, USA) blev anvendt til at scanne de hybridiserede dias. Især en grøn laser (λ

ex 543 nm /λ

em 570 nm) til Cy3 farvestof og en rød laser (λ

ex 633 nm /λ

em 670 nm) for Cy5 farvestof blev anvendt. Den fotomultiplikator (PMT) rør forstærkning og laser magt ændret mellem fluorokromer og forskellige eksperimenter. 16-bit TIFF-billeder blev analyseret ved 5 um opløsning. Data intensiteter blev ekstraheret med scannersoftwaren og dataanalyse blev udført for hvert forsøg som beskrevet tidligere [25].

Konventionel og COLD-PCR-amplifikation efterfulgt af High Resolution Melting (HRM) og direkte sekventering

Konventionel PCR, COLD-PCR, HRM og sekventering protokoller er allerede blevet beskrevet [11], [26].

Resultater

1) Konventionel og COLD-PCR-amplifikation HRM og sekventering resultater

i første omgang alle de 75 prøver blev screenet for forskning af KRAS mutationer og BRAF

V600E af HRM og sekventering. I anden fase blev alle prøver (muteret og vild-type) forelægges for en komplet screening ved hjælp COLD-PCR-amplifikation efterfulgt af HRM og sekventering som allerede rapporteret [11].

Globalt 59 ud af 75 prøver indeholdt alternativt en mutation enten på KRAS hotspots eller BRAF

V600E variant, mens 16 blev klassificeret som vilde prøver type og inkluderet som negative kontroller. Det er vigtigt at bemærke, at i 9/59 muterede prøver blev identifikationen af ​​basesubstitutioner kun mulig gennem anvendelse af hurtig eller fuld COLD-PCR-protokoller, sandsynligvis på grund af de lavere procentdele af muterede alleler i udgangs- prøver. Disse prøver blev rammende indført i valideringsundersøgelsen at teste følsomheden af ​​den foreslåede platform. For en detaljeret beskrivelse af fordelingen af ​​KRAS og BRAF varianter i vores prøver se tabel 2.

2) Optimering af silicium slide analyse

Vild type kontrolprøver og rekonstitueret heterozygot kontrol prøver (genereret af korrekt blande plasmid-DNA indeholdende vildtype og muterede sekvenser af alle 7 KRAS-mutationer og af BRAF

V600E variant) blev anvendt til at teste assay specificitet. Efter optimering af temperatur og hybridisering tid, blev en korrekt identifikation af alle genotyper opnået. Et eksempel er vist i figur 2 og 3, hvor et hybridiseringsforsøg for G12R KRAS og BRAF

V600E mutation er vist henholdsvis. I det optimerede system for alle de analyserede mutationer kunne vi bevis for: i) fluorescerende signaler var høje, ii) ingen krydshybridisering blev opnået, selv for varianter, der påvirker de samme eller tilstødende nukleotidpositioner (Figur 2D) og iii) en god reproducerbarhed fra plet til plet (vist ved fejlsøjler) blev fundet.

(A) microarray scanning af Cy3 fluorescens signal svarende til vildtype-allelen. Steder i kolonne 1,2,3,4 repræsenterer amino-modificerede oligonukleotid mærket med Cy3 bruges som referencepunkter pletter. (B) scanning af Cy5 fluorescens signal svarende til den muterede allel. (C) microarray spotting ordning. vægt: vildtype kontrolprøver Het 1, Het2 og Het3: heterozygote prøver til G12A kontrol, G12C, G12R, G12S, G12V, G13D; G12D KRAS-mutationer; lys grå firkanter repræsenterer amino-modificerede oligonukleotid mærket med Cy3 bruges som referencepunkter pletter. (D) normaliseret relative fluorescens intensitet efter hybridisering af kendte kontrolprøver med reporterne komplementære til G12R variation. Barer er gennemsnittet af intensiteten af ​​de 6 replikater af hver prøve. Fejlsøjlerne er de standardafvigelser af fluorescensintensiteten af ​​hver prøve.

(A) Cy3 fluorescens signal svarende til vildtype-allelen. Steder i kolonne 1,2,3,4 repræsenterer amino-modificerede oligonukleotid mærket med Cy3 bruges som referencepunkter pletter. (B) Cy5 fluorescens signal svarende til den muterede allel. (C) microarray spotting ordning. vægt: vildtype kontrolprøver Het 1, Het2 og Het3: heterozygote kontrolprøver mut: homozygot mutant kontrolprøve; lys grå firkanter repræsenterer amino-modificerede oligonukleotid mærket med Cy3 bruges som referencepunkter pletter. (D) normaliseret relative fluorescensintensitet efter hybridisering af kendte kontrolprøver med journalisterne komplementære til V600E BRAF variation. Barer er gennemsnittet af intensiteten af ​​de 6 replikater af hver prøve. Fejlsøjlerne er standardafvigelser af fluorescens intensiteten af ​​hver prøve.

3) Følsomhed for analysen

følsomhed for analysen i kræsne forskellige andele af muterede alleler blev evalueret på serielle fortyndinger (6%, 3%, 1,6%, 0,8%, 0,4%, 0,2%, 0,1%, 0,05%, 0,02%, 0,01% muterede /vildtype) af muterede DNA belejligt blandet med vildtype skriv DNA. Især brugte vi CCRF-CEM cellelinje som reference for KRAS mutation p.G12D (heterozygot), den humane kolorektal carcinom cellelinie SW620 (bruges som reference for KRAS-mutation pG12V, homozygot), og den menneskelige melanom cellelinjer A375 (anvendt som kilden til homozygot BRAF

V600E DNA). Den humane brystcancer-cellelinie MCF-7 blev anvendt som vildtype for både KRAS og BRAF gener. For alle de andre KRAS mutationer vi brugte mutant-bærende plasmider genereret.

detektionsgrænse foreslåede metode var anderledes for de 7 KRAS testede mutationer og for V600E BRAF mutation. Navnlig har microarray systemet kunnet påvise et minimum på ca. 0,01% af muterede alleler i en baggrund af vildtype-DNA for G13D mutationen, ca. 0,025% af muteret allel for G12R mutationen, 0,05% for G12C-mutationen , 0,1% for G12D mutationen, 0,2% for V600E BRAF mutation, 0,4% for G12A og G12S mutationer og 0,8% for G12V henholdsvis. I figur bliver vist 4 to eksempler på de resultater, der er opnået for G13D KRAS mutation og for BRAF

V600E mutation.

grænse for G13D mutation (A) Detektion og V600E BRAF mutation (B) . vægt: vildtype kontrolprøver Het 1, Het2 og Het3: heterozygote kontrolprøver tal fra 1 til 10: seriefortyndinger, 1 = 6%, 2 = 3%, 3 = 1,6%, 4 = 0,8%, 5 = 0,4%, 6 = 0,2%, 7 = 0,1%, 8 = 0,05%, 9 = 0,02%, 10 = 0,01% hhv. Barer er gennemsnittet af intensiteten af ​​de 6 replikater af hver prøve. Fejlsøjlerne er standardafvigelser af fluorescens intensiteten af ​​hver prøve.

4) Blind validering

Validering blev udført i en blindet måde ved at analysere 75 prøver fra forsøgspersoner enten positiv eller vildtype for KRAS og BRAF-mutationer, tidligere karakteriserede ved HRM og direkte sekventering. Som et eksempel er microarray resultaterne for G12C KRAS mutation og for BRAF

V600E mutation for frosne væv vist i figur 5 og 6, henholdsvis. Desuden i figur vises 7 og 8 de microarray resultater for G12R KRAS mutation og for BRAF

V600E mutation i FFPE prøver hhv. Systemet var meget specifik tildele den korrekte genotype til alle prøver. Blind validering viste fuldstændig overensstemmelse mellem resultater (Tabel 2) med den forventede undtagelse af prøver N.31 og N.40, bærer p.G13C og p.V14I KRAS varianter, som udtrykkeligt blev indført for at teste specificiteten af ​​den nyudviklede prober (se tabel 2).

(A) Cy5 fluorescens signal svarende til den muterede allel. (B) spotting ordning. vægt: vildtype kontrolprøver Het 1, Het2 og Het3: heterozygote prøver til G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G13D, G12V KRAS-mutationer kontrol; tal fra 1 til 60: tres forskellige faste tumor DNA-prøver. Grå markører repræsenterer prøverne positive for G12C mutation; lys grå firkanter repræsenterer en amino-modificeret oligonucleotid mærket med Cy3 bruges som referencepunkter pletter. (C) HRM analyse af prøve nummer 30 (nummer 2) sammenlignet med smeltende profiler af kontrolprøver (vildtype reference = nummer 1; muteret reference = nummer 3) efter amplifikation ved kold-PCR: smelteegenskaber er tankevækkende for tilstedeværelsen af muterede DNA i prøven. (D) direkte sekventering analyse af prøve nummer 30 indsendes til COLD-PCR-amplifikation protokol: elektroferogrammet bekræfter tilstedeværelsen af ​​muterede DNA (G12C) i prøven

(A) Cy3 fluorescens signal svarende til. vildtype-allelen. Steder i kolonne 1,2,3,4 repræsenterer amino-modificerede oligonukleotid mærket med Cy3 bruges som referencepunkter pletter. (B) Cy5 fluorescens signal svarende til den muterede allel. (C) spotting ordning. vægt: vildtype kontrolprøver BRAF het1, Het2 og Het3: heterozygote kontrolprøver mut: homozygot mutant kontrolprøve; tal fra 1 til 60: tres forskellige solide tumorer prøver. Grå markører repræsenterer prøverne positive for BRAF mutation; lysegrå kvadrater repræsenterer en amino-modificeret oligonucleotid mærket med Cy3 anvendt som referencestoffer pletter.

(A) Cy3 fluorescens signal svarende til vildtype-allelen. Steder i kolonne 1,2,3,4 repræsenterer amino-modificerede oligonukleotid mærket med Cy3 bruges som referencepunkter pletter. (B) Cy5 fluorescens signal svarende til den muterede allel. (C) spotting ordning. vægt: vildtype kontrolprøver het: heterozygote prøver til kontrol G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13D, KRAS-mutationer; tal fra 1 til 15: femten forskellige FFPE fast tumor DNA-prøver. Grå markører repræsenterer prøverne positive for G12R mutation; lys grå firkanter repræsenterer en amino-modificeret oligonucleotid mærket med Cy3 bruges som referencepunkter pletter. (D) Relativ fluorescensintensitet til detektering af systemets følsomhed evalueret for G12R mutation. vægt: vildtype kontrolprøver het: heterozygote kontrolprøver tal fra 1 til 15: FFPE prøver. Barer er gennemsnittet af intensiteten af ​​de 6 replikater af hver prøve. Fejlsøjlerne er de standardafvigelser af fluorescensintensiteten af ​​hver prøve.

(A) Cy3 fluorescens signal svarende til vildtype-allelen. Steder i kolonne 1,2,3,4 repræsenterer amino-modificerede oligonukleotid mærket med Cy3 bruges som referencepunkter pletter. (B) Cy5 fluorescens signal svarende til den muterede allel. (C) spotting ordning. vægt: vildtype kontrolprøver BRAF het1, Het2: heterozygot kontrolprøver BRAF mut1, Mut2: homozygot mutant kontrolprøve; tal fra 1 til 15: femten forskellige FFPE fast tumor DNA-prøver. Grå markører repræsenterer prøverne positive for BRAF mutation; lys grå firkanter repræsenterer en amino-modificeret oligonucleotid mærket med Cy3 bruges som referencepunkter pletter. (D) Relativ fluorescensintensitet til detektering af systemets følsomhed evalueret for V600E BRAF mutation. vægt: vildtype kontrolprøver het: heterozygote kontrolprøver tal fra 1 til 15: FFPE prøver. Barer er gennemsnittet af intensiteten af ​​de 6 replikater af hver prøve. Fejlsøjlerne er standardafvigelser af fluorescens intensiteten af ​​hver prøve.

Diskussion

Sensitivitet og specificitet er grundlæggende kendetegn for enhver diagnostisk metode. Meget følsomme analyser, i stand til at påvise små mængder af stoffet, der undersøges, kan åbne nye muligheder i flere kliniske anvendelser. Især identifikationen af ​​minority muterede alleler i et overskud af vildtype-alleler, der repræsenterer et fælles problem i analysen af ​​cancer DNA, er teknisk meget udfordrende, og kræver anvendelse af meget følsomme teknikker.

Inden for dette