PLoS ONE: en høj grad af LINE-1 hypometylering er en unik funktion af tidlig debut Colorectal Cancer

Abstrakt

Målsætning

tidlig debut kolorektal cancer (CRC) repræsenterer en klinisk tydelig form for CRC, der er ofte forbundet med en dårlig prognose. Methylering niveauer af genomiske gentagelser såsom LINE-1 elementer er blevet anerkendt som uafhængige faktorer for øget dødelighed af kræft-relaterede. status methylering af LINE-1 elementer i tidlig debut CRC ikke tidligere er analyseret.

Design

Vi analyserede 343 CRC væv og 32 normale colon mucosa prøver, herunder 2 uafhængige kohorter af CRC diagnosticeret ≤50 år (n = 188), en gruppe af sporadisk CRC 50 år (MSS n = 89; MSI n = 46), og en gruppe af Lynch syndrom CRCs (n = 20). Tumor mismatch reparation proteinekspression, mikrosatellit ustabilitet status, LINE-1 og

MLH1

methylering, somatiske

BRAF

V600E mutation, og germlinie

MUTYH

mutationer blev evalueret.

Resultater

Mean LINE-1 methylering niveauer (± SD) i de fem studiegrupper var tidlig debut CRC, 56,6% (8,6); sporadisk MSI, 67,1% (5,5); sporadisk MSS, 65,1% (6,3); Lynch-syndrom, 66,3% (4.5) og normal slimhinde, 76,5% (1,5). Tidlig debut CRC havde signifikant lavere LINE-1 methylering end nogen anden gruppe (p 0,0001). Sammenlignet med patienter med 65% LINE-1 methylering i tumorer, dem med ≥65% LINE-1 methylering havde signifikant bedre samlet overlevelse (p = 0,026, log rank test)

Konklusioner

LINE-1 hypometylering udgør et potentielt vigtigt element i tidlig debut CRC, og foreslår en særskilt molekylær undertype. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at vurdere potentialet i LINE-1 methylering status som prognostisk biomarkør for unge med CRC

Henvisning:. Antelo M, Balaguer F, Shia J, Shen Y, Hur K, Moreira L, et al. (2012) en høj grad af LINE-1 hypometylering er en unik funktion af tidlig debut kolorektal cancer. PLoS ONE 7 (9): e45357. doi: 10,1371 /journal.pone.0045357

Redaktør: Anthony WI. Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Juli 2, 2012; Accepteret: August 15, 2012; Udgivet: September 25, 2012 |

Copyright: © Antelo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Den nuværende arbejde blev støttet af tilskud R01 CA72851 og CA129286 fra National Cancer Institute, National Institutes of Health; og midler fra Baylor Research Institute til CRB og AG. FB blev støttet af en bevilling fra Fundación Alfonso Martín Escudero og fra Instituto de Salud Carlos III (PI10 /00384). MA blev understøttet af en “Type I Postgraduate Scholarship” givet ved CONICET (nationale råd for videnskabelige og tekniske undersøgelser) afhængig af den argentinske Ministeriet for Videnskab og Teknologi. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en vigtig folkesundhedsproblem og repræsenterer den næsthyppigste kræft og den næststørste årsag kræft dødelighed i det meste af den udviklede verden. Hvert år en million mennesker udvikler CRC, og 40-50% af dem vil dø inden for 5 år efter diagnosen [1]. CRCs er meget heterogene både histopatologisk og på det molekylære og genetiske niveau. Det fremgår, at biologi og respons på behandlinger er lige så forskelligartet. Forståelse af de molekylære mekanismer i kolorektal carcinogenese er afgørende for udviklingen af ​​nye strategier for forebyggelse, diagnose, behandling og prognose. Selv CRC har været en stor fokus for grundforskning og klinisk forskning i løbet af de sidste 25 år, vi stadig mangler robuste biomarkører, der kan bruges til diagnosticering og behandling af CRC.

Den maksimale forekomst af CRC er mellem 60 -70 år; dog op til 10% af alle tilfælde forekommer før alder 50. Desuden seneste epidemiologiske studier tyder på, at forekomsten af ​​tidlig debut CRC er stigende, hvilket er en vigtig klinisk udfordring [2]. Tidlig debut CRC ofte præsenterer med avancerede stadie tumorer, som bidrager til en højere dødelighed [3]. Da de unge ikke er inkluderet i CRC screeningsprogrammer, der er et presserende behov for at forstå biologi tidlige debut tumorer, som kan lette tidligere påvisning og behandling af disse kræftformer.

Selvom tidlig debut CRC rejser muligheden for en arvelig risikofaktor, de kendte ikke-polypose arvelige CRC syndromer (Lynch syndrom og

MUTYH

associeret CRC) repræsenterer ikke mere end 15-20% af tilfældene i denne gruppe [4], [5] [6]. Lynch syndrom tegner sig for omkring 3% af alle CRC tilfælde, og er forårsaget af germlinie mutationer af DNA mismatch repair (MMR) gener (

MLH1, MSH2, MSH6

PMS2

) [7 ]. Det er kendetegnet ved tidlig debut cancere opstår i de colorectum og andre organer, og der er adskillige strategier og algoritmer til at forudsige tilstedeværelsen af ​​en kimlinie mutation i et af de MMR-gener [8], [9], [10], [11]. Biallele mutationer i

MUTYH

gen (et medlem af basen excision reparationssystem) tegner sig for 1% af alle CRC, og normalt forårsager en svækket form af polypose, selvom 30% af disse patienter kan manifestere sig som en non-polypose CRC [12] .Identifying personer med germline mutationer, der disponerer for CRC har betydelige konsekvenser for den kliniske behandling af de ramte personer og for deres pårørende.

de resterende 75-80% af tidlig debut CRC repræsenterer en anden gruppe, hvor den genetiske ætiologi er endnu ikke blevet opdaget. I modsætning til CRC på ældre individer, er tidlig debut CRC ofte kendetegnet ved mere fremskredent stadium, distal placering (især i endetarmen), mucinøse og dårligt differentierede tumorer med signetring celler, og en dårligere prognose [4], [13], [14]. Hovedparten af ​​disse cancere viser ikke mikrosatellit instabilitet (MSI), men snarere er mikrosatellit stabile (MSS). Den molekylære basis for de biologiske og adfærdsmæssige forskelle i tidlig debut CRC er uklar.

Genom-dækkende DNA hypometylering er en hyppig epigenetiske ændring, der er en tidlig begivenhed i CRC og er blevet forbundet med aktivering af visse proto -oncogenes (dvs. MET) [15] og tilstedeværelsen af ​​kromosomal ustabilitet [16], [17]. Global DNA hypometylering kan måles indirekte ved at vurdere status for methylering af lange afbrudt nukleotid element-1 (LINE-1) gentagelsessekvenser [18]. Den pyrosekventering assay for LINE-1 methylering har vist sig at være kvantitativ, robust og reproducerbar [19]. Graden af ​​LINE-1 hypometylering er blevet anerkendt som en uafhængig faktor for øget kræft dødelighed og den samlede dødelighed i CRC patienter [20]. Selvom det er blevet foreslået, at LINE-1 hypometylering er associeret med CRC hos yngre patienter [21], den specifikke sammenhæng mellem methylering status LINE-1 elementer og tidlig debut CRC er ikke blevet yderligere analyseret.

Formålet med dette studie var at karakterisere den kliniske, histologiske og molekylære træk ved en stor gruppe af tidlig debut CRCs i forbindelse med status for methylering af LINE-1-elementer. Vores resultater viser, at LINE-1 hypometylering i disse tumorer udgør en unik og specifik funktion, som antyder en særskilt molekylær undertype i disse kolorektale neoplasmer. Vores resultater tyder på, at status LINE-1 methylering kunne bruges som en prognostisk biomarkør for unge med CRC.

Patienter og metoder

Etik Statement

Undersøgelsen blev godkendt af de Institutional Review Boards (IRB) for hver deltagende center, herunder Hospital of Gastroenterology “Dr. C. B. Udaondo “, Buenos Aires, Argentina, Baylor University Medical Center, Dallas, TX og Epicolon konsortiet. Et skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter.

Patienter

Vi analyserede 343 CRC’er fra forskellige klinik-patologiske grupper, og 32 normale colon mucosa prøver. Vi inkluderede en kohorte af 118 tilbagevirkende kraft rekrutterede CRC patienter ≤ 50 år set på Onkologisk afdeling den argentinske Public Hospital of Gastroenterology mellem 1993 og 2009. Patienter med kolorektal polypose eller inflammatorisk tarmsygdom blev udelukket. Demografiske og klinik-patologiske træk blev indsamlet fra hver enkelt patients sygehistorie, og familie historie af kræft i første og anden grads slægtninge blev opnået ved personlig samtale. Den mediane follow-up tid var 39 måneder (interval, 1.5-195 måneder). For LINE-1 methylering analyser, som en validering gruppe, inkluderet vi en tidligere beskrevet kohorte af 70 patienter med CRC diagnosticeret ≤ 50 år behandlet på to spanske centre (Hospital Clinic i Barcelona og Hospital Donostia) mellem 1995-2007 [4 ]. Vi inkluderede også et populationsbaseret kohorte af sporadiske CRC’er 50 år rekrutteret i Spanien (Epicolon I undersøgelse) [9] kategoriseret efter tilstedeværelsen af ​​MSI ( “sporadisk MSI” på grund af somatiske

MLH1

promotor hypermethylering [n = 46], og “sporadisk MSS” [n = 89]); og en gruppe af Lynch syndrom CRC’er rekrutteret ved Baylor University Medical Center (n = 20). Vi analyserede histologisk normal colon mucosa fra 32 personer, der gennemgår colon kirurgi for andre end kræft årsager (dvs. diverticulosis) ansættes i den Hospital Clinic i Barcelona, ​​Spanien.

DNA Isolation

Genomisk DNA fra hver patient blev ekstraheret fra formalin-fikserede paraffin-indlejrede (FFPE) Mikrodissekterede tumorvæv ved hjælp af QIAamp Tissue Kit (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrig) ifølge producentens anvisninger. Perifert blod-DNA blev ekstraheret under anvendelse af QiaAmpDNA blod Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrig). For rektal tumorer, hvor kemo-strålebehandling blev administreret, blev analyseret vævsprøver forbehandling.

Tumor Uoverensstemmelse Repair Protein Expression

En blok af FFPE tumorvæv blev valgt pr sag og immunfarvning blev udført anvendelse af standardprotokoller. De følgende muse monoklonale antistoffer blev anvendt: anti-MLH1 (klon G168-728, fortyndet 1:250, PharMingen, San Diego, CA), anti-MSH2 (klon FE11, fortyndet 1:50, Oncogene ResearchProducts, Cambridge, MA), anti-MSH6 (klon GRBP.P1 /2.d4, fortyndet 1:200; Serotec Inc., Raleigh, NC) og anti-PMS2 (klon A16-4, fortyndet 1:200, BD PharMingen, San Diego, CA). En tumor blev anset negativ for proteinekspression, hvis den neoplastiske epitel manglede nuklear farvning, mens ikke neoplastiske epithelceller eller stromaceller bevaret normal ekspression af dette protein.

Tumor mikrosatelitter ustabilitet Analyse

MSI analyse blev udført under anvendelse fem mononukleotid repeat mikrosatellit mål (BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24 og NR-27) i et pentaplex PCR-system. Primersekvenser har tidligere [22] blevet beskrevet. Tumorer med ustabilitet på ≥3 disse markører blev klassificeret som mikrosatellit ustabil (MSI), og dem viser ustabilitet på ≤2 markører som mikrosatellit stabil (MSS). Forskerne scoring immunfarvning blev blindet til MSI resultater, og vice versa.

methylering Analyser

DNA blev modificeret med natrium-bisulfit bruge EZ Methvlerinq Gold Kit (Zymo Research, Orange, CA) . Methylering af LINE-1-sekvenser og promotoren for

MLH1

blev analyseret ved kvantitativ bisulfit pyrosekventering som tidligere [23] beskrevet. Primere er detaljeret i tabel S1.

Kimcellelinje MUTYH Gene Mutation Analyse

Alle patienter blev screenet for de to mest udbredte

MUTYH

mutationer i den hvide befolkning (p.G393D og p .Y176C) ved pyrosekventering. Primere er vist i tabel S1. I heterozygote for nogen af ​​disse mutationer, den kodende region og exon-intron-grænserne for

MUTYH

gen blev screenet ved SSCP med sekventering af unormale band skift, som tidligere beskrevet [12].

Somatisk BRAF V600Emutation analyse

BRAF

V600E mutationsanalyse blev udført ved pyrosekventering. PCR og sekventering primere er vist i tabel S1.

Statistical Analysis

Kvantitative variabler blev sammenlignet ved anvendelse af Students test. Kvalitative variabler blev sammenlignet under anvendelse af enten Chi Square eller Fishers test efter behov. For foreninger med MMR-mangel og LINE-1 methylering (behandlet som en binær variabel) blev udført en multivariat analyse ved hjælp af en trinvis baglæns logistisk regression for at vurdere de uafhængige foreninger. Mann Whitney-test blev anvendt til at sammenligne LINE-1-værdier. Samlet overlevelse i forbindelse med klinik-patologiske og molekylære variabler (tumor stadie, MMR-mangel, tumor placering, familie historie CRC, tumor differentiering, mucinøs komponent, tumor infiltrerende lymfocytter og LINE-1 methylering) blev beregnet af Kaplan-Meier-metoden (log rank test). En to sidet p-værdi på 0,05 blev betragtet som signifikant. SPSS v17 software blev anvendt til statistisk analyse.

Resultater

Patientens Kendetegn

Vi rekrutteret 118 patienter med tidlig debut CRC. Klinisk-patologiske træk er vist i tabel 1. Den gennemsnitlige alder ved diagnose var 37 år (standardafvigelse (SD), 8,25), og 61 (51,7%) patienter var kvinder. I 34 (28,8%) tumoren var proximalt til milten bøjning 35 (29,6%) var i den distale colon, og 49 (41,6%) var i endetarmen. Ved præsentation, 22 (18,6%) patienter havde 1-10 synkrone adenomer; 18 præsenteret med 1-5 adenomer og 4 patienter havde 6-10 adenomer. Tre tilfælde (2,5%) havde en synkron tumor (2 CRC og en neuroendokrine tumor i tillægget), og 5 (4,2%) udviklede en metachronous tumor under opfølgning (4 CRC og en urothelial karcinom). De fleste tilfælde (77; 65,3%) blev diagnosticeret på fremskredne stadier (III-IV). Dårligt differentierede tumorer blev set i 15 (13,1%) patienter, 41 (34,7%) havde mucinøse funktioner og 65 (55%) havde patologiske træk, der tyder på MSI fænotype, med en eller flere af følgende: signet ring celler, Crohn’s- ligesom lymfocytisk reaktion, tumorinfiltrerende lymfocytter, medullær vækstmønster eller anaplastisk funktioner. Mere end 85% (n = 100) af patienterne havde oplevet mavesmerter før diagnosen, 83 (70%) præsenteret med en ændring i afføringsvaner, 71 (60%) havde rektal blødning og vægttab, 34 (29%) havde jernmangel, 18 (15,5%), præsenteret med tarmobstruktion, og 6 (5%) med perforering. Den gennemsnitlige forsinkelse mellem første symptomer og CRC diagnosen var 6,5 ± 5 måneder. Femten patienter (12,7%) havde en familie historie CRC eller en anden Lynch-syndrom-associeret neoplasma i første eller anden grad slægtninge. Tre patienter mødte Amsterdam I kriterierne, 3 patienter mødte Amsterdam II kriterier, 4 patienter havde en første grads slægtning med CRC, 3 patienter havde to eller flere anden grads slægtninge med CRC, og 2 patienter havde en anden grad i forhold med CRC.

Salg

Kimcellelinje MUTYH Gene Mutation Analyse

biallele MUTYH mutationer blev fundet i 1/91 MMR-dygtige tilfælde (1,1%) (). Denne enkelt tilfælde var en 29-årig patient med en stadium III endetarmskræft og 2 synkrone adenomer. To søskende til denne patient havde en historie af svækket polypose og CRC (én præsenteret med 30 adenomer og den anden med 8 adenomer og en

in situ

karcinom i coecum); i begge søskende var blevet udført samlede colektomier. Endelig har vi identificeret to p.G393D heterozygote patienter, der havde ingen specifikke klinisk-patologiske træk (tabel S2).

fejlparringsreparationsmangel Analyse

MMR-mangel blev evalueret ved MSI analyse og immunhistokemi, og blev defineret ved tilstedeværelsen af ​​MSI i en tumor, og /eller tab af ekspression i nogen af ​​MMR-proteiner. Tyve syv (22,9%) tumorer blev klassificeret som MMR mangelfuld, og 25 af disse viste tab af protein-ekspression (8 for MLH1 /PMS2, 1 for isolerede MLH1, 4 for isolerede PMS2, 11 for MSH2 /MSH6, og 1 for isolerede MSH6 ). Klinisk-patologiske træk af patienter med MMR-mangel er sammenfattet i tabel 2.

Næsten alle tilfælde af MSI haft tab af protein-ekspression; to tilfælde med MSI bevaret normal ekspression af alle fire proteiner. Ligeledes 1 tilfælde med tab af MSH6 udtryk og et tilfælde med tab af PMS2 var MSS. Den sidste patient var en 24-årig kvinde, der havde CRC i en alder 15, en urotelial karcinom i en alder af 23, en metachronous CRC i en alder af 24, og endelig en mediastinal B-celle lymfom. Hendes CRC prøve viste tab af ekspression af PMS2 i tumorceller og i normale colon omgivende væv, hvilket fører til en formodet diagnose af konstitutionelle MMR-mangel syndrom grundet bi-allele PMS2 mutationer.

Som vist i tabel 1, i forhold til MFR-dygtige tumorer, MMR-mangelfulde tumorer var mere tilbøjelige til at blive placeret i den proksimale colon (59,3%

vs

. 19,8%, p = 0,0001), til at være mucinøs (63%

vs

. 26,4%, p = 0,0001), at have tumor infiltrerer lymfocytter (59,3%

vs.

11,5%, p = 0,0001), og for at have MSI-suggestive patologi (81,5%

vs

. 47,2%, p = 0,002). MMR-mangel tumorer var også mere tilbøjelige til at blive diagnosticeret med en lavere stadie (trin I-II:. 51,9%

vs

29,7%, p = 0,03), og til at have mindre tumor recidiv eller progression (22,2%

vs

. 44%, p = 0,042). Multivariate analyse viste, at uafhængige variabler forbundet med MMR-mangel var: proksimal placering (OR = 3,86 [95% CI: 1,32-11,32]; p = 0,013), mucinous features (OR = 3,38 [95% CI: 1,16-9,84]; p = 0,025) og tilstedeværelse af tumorinfiltrerende lymfocytter (OR = 8,8 [95% CI: 2,93-26,31]; p = 0,0001). Selv om der var nogen forskel i en alder af CRC diagnose mellem de 2 grupper, chancen for at få et MMR-mangel tumor var større blandt yngre patienter (12-30 år: 8/27, 29,6%; 31-40 år: 9 /45, 20%, 41-50 år:. 10/46, 21,7%)

Somatic

BRAF

mutation var til stede i en MMR-mangel tumor (tabel 2). Denne sag var en 49-årig mand med en MSI tumor i coecum, som viste tab af MLH1 og PMS2 proteinekspression. Denne sag viste høj grad af

MLH1

promotor methylering (88%) og blev derfor sandsynligvis forbundet med CpG ø methylator fænotype (CIMP) [24]. I resten af ​​

MLH1

deficiente tumorer, formentlig bærere af

MLH1

kimlinie mutationer, 4 viste meget lave niveauer af methylering (interval 1-2%), og de andre 4 viste mellemliggende niveauer (range, 25-51%).

LINE-1 methylering Analyse

Vi brugte den kvantitative bisulfit pyrosekventering metode til at bestemme status methylering af LINE-1 repetitive sekvenser i CRCs. Den gennemsnitlige methylering i CRCs var 59,97% (standardafvigelse 6,57), som fulgte en normal fordeling (fig S1). Klinisk-patologiske træk forbundet med LINE-1 methylering er vist i tabel 3. En signifikant forskel i LINE-1 methylering status blev fundet efter tumor placering, med lavere niveauer af methylering i distal i forhold til proksimale tumorer (59.02%

vs .

62,3%, p = 0,015). Desuden blev en tendens til lavere niveauer af methylering fundet hos kvinder (58,87%

vs

. 60,93, p = 0,092) og i ikke-mucinøse tumorer (59,24%

vs.

61,41% , p = 0,096). Ingen forskelle i LINE-1 methylering status blev fundet for nogen af ​​de andre klinik-patologiske funktioner.

Vi sammenlignede derefter LINE-1 methylering niveauer i denne serie med en anden uafhængig kohorte af patienter med CRC diagnosticeret på 50 år rekrutteret i Spanien [4], 2 grupper af patienter med sporadisk CRC diagnosticeret 50 år gamle kategoriseret ved tilstedeværelsen eller fraværet af MSI (MSI, n = 46; gennemsnitsalder: 70,2 + 13.9 år gamle, og MSS, n = 89; gennemsnitsalder: 70,6 ± 11,4 år gamle), en gruppe af Lynch syndrom CRCs (n = 20), og normal colon mucosa fra individer uden tumorer (n = 32) (figur 1 og tabel 4 ). Klinisk-patologiske træk fra begge kohorter af tidlig debuterende CRC’er er afbildet i tabel S3. Begge kohorter var ens med hensyn til placering af tumor og tumor patologiske funktioner. Som forventet, de gennemsnitlige LINE-1 methylering niveauer i normal colon mucosa var højere end i tumorvæv for alle grupper. LINE-1 methylering niveauer i tidlig debut CRC’er var 59,9% (SD, 6,5) og 51,1% (SD, 9.2) for den argentinske og den spanske årgange, hhv. Det gennemsnitlige methylering niveauet i den kombinerede kohorte af tidlig debut CRC’er (n = 185) var 56,6% (SD, 8.6). Interessant, tumor LINE-1 methylering niveauer i de to uafhængige kohorter af tidlig debut CRC var betydeligt lavere end hos ældre debuterende CRC’er og Lynch syndrom tumorer (tabel 4), hvilket tyder på, at dette repræsenterer en unik feature i denne undergruppe af tumorer (p 0,0001 for alle sammenligninger). LINE-1 hypometylering niveauer var ens i ældre-debut sporadiske MSI tumorer (67,1%, SD 5.5), Lynch syndrom CRC’er (66,3%, SD 4.5), og sporadiske MSS tumorer (65,1%, SD 6.3).

Bisulfite pyrosekventering af LINE-1 i kolorektale væv; Normal slimhinde (n = 32), tidlig debut CRC fra Argentina (n = 116), tidlig debut CRC fra Spanien (n = 70), ældre debut CRC med mikrosatellit stabilitet (MSS n = 89), ældre debut CRC med mikrosatellit instabilitet (MSI) i forbindelse med

MLH1

promotor hypermethylering (n = 46) og Lynch-syndrom CRC’er (n = 20) .Den sorte vandrette bjælke angiver det gennemsnitlige methylering niveau.

Survival Analyser

opfølgning var tilgængelige på alle 118 patienter, der spænder fra 1,5 til 195 måneder, med et gennemsnit på 39 måneder. Det 3-årige overlevelsesrate for alle 118 patienter i denne serie var 84,7%; 46 patienter (39%) recidiverende eller havde sygdomsprogression, 22 (18,6%) døde, og 3 patienter blev tabt for opfølgning. Avanceret tumor fase var signifikant associeret med en dårligere 3-års samlet overlevelse (trin I-II: 92,9% vs. trin III-IV: 82,9%; p = 0,046, log rank test) og der blev observeret en tendens til bedre overlevelse hos patienter med mucinøse tumorer (95,1% vs. 82,9%; p = 0,077, log rank test) eller med tumorinfiltrerende lymfocytter (96,2% vs. 85,2%; p = 0,16, henholdsvis; log rank test). Patienter med MFR-mangelfulde tumorer viste en tendens til en bedre 3-års samlet overlevelse (96,3%

vs

83,5%. P = 0,1, log rank).

Dernæst vi evaluerede effekt af LINE-1 hypometylering på den samlede overlevelse CRC patienter. Med det formål at identificere en cut-off værdi på LINE-1, der kunne skelne en gruppe af patienter med dårligere prognose blev flere cut-offs startende fra det laveste niveau af LINE-1 methylering evalueret. Vi fandt, at i sammenligning med patienter med 65% LINE-1 methylering, dem med ≥65% LINE-1 methylering havde signifikant bedre samlet overlevelse (83,5% vs. 100%; p = 0,026, log rank test, p = 0,039 , Fishers eksakte test, figur 2). Sammenligning af klinisk-patological og molekylære karakteristika ved patienter i henhold til niveauet af LINE-1 methylering er vist i tabel 5. Interessant tumorer med LINE-1 methylering ≥65% var hyppigere mucinøs (60,9% vs. 24,5%, p = 0,003 ) og de patienter havde højere frekvens af synkrone eller metachronous tumorer (13% vs. 2,2%, p = 0,054). Multivariat analyse viste mucinous tumorer som den eneste variabel forbundet med tumoren med LINE-1≥65% (OR = 4,32 (95% CI: 1,65-11,34); p = 0,003), uafhængigt af MMR-mangel status

Lodrette aksemærker

angiver censurerede hændelser. Den grønne linje repræsenterer overlevelse i CRC’er med LINE-1 hypometylering 65% (n = 92) og den blå linje repræsenterer LINE-1 methylering ≥65% (n = 23). p-værdi for log rank og Fishers eksakte test vises.

Diskussion

Flere undersøgelser har antydet, at tidlig debut CRC udgør en biologisk særskilt sygdom, der er ofte forbundet med fremskredent stadium, distale tumorer, og dårlig prognose. Vi og andre har vist, at de kendte arvelige kræft syndromer kun forklare en mindre del af tidlig debut CRC sager [2], [4], [5], [13]; følgelig den patogene mekanisme i de fleste tilfælde forbliver ukendt. I denne undersøgelse sigter vi for at opnå yderligere indsigt i patogenesen af ​​tidlig debut CRC ved at vurdere klinik-patologiske og molekylære funktioner i 118 patienter med tidlig debut CRC. De mest interessante og nye resultat, vi observerede, er, at LINE-1 hypometylering udgør en unik feature i tidlig debut CRC patienter. LINE-1 hypometylering er en surrogatmarkør for hele genomet hypometylering og er forbundet med forøget kromosomale ustabilitet [16], [17]; derfor kan denne konstatering hjælpe med at forklare nogle af de biologiske mekanismer bag tidlig debut CRC. Desuden fandt vi, at hyppigheden af ​​MMR-mangel i denne kohorte er ca. 20%, hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter, der prægede disse bestande [4], [5], [6]. Endelig fandt vi, at

MUTYH

mangel udgør ~ 1% af MFR-dygtige CRCs. Dette arbejde og tidligere arbejde hjælp udelukke en række mulige forklaringer på tidlig debut CRC.

Kræft er en kompleks sygdom, der opstår som følge af både genetiske og epigenetiske ændringer. Menneskelig CRC’er ofte vise ændringer i DNA-methylering, og det har været kendt i årtier, at genom-dækkende hypometylering er en konsekvent biokemisk karakteristik af humane kolorektale tumorer [16], [17], [25]. Hos mus DNA hypometylering er tilstrækkelig til at inducere T-celle-lymfomer [26]. Genom-dækkende hypometylering spiller en forårsagende rolle i kræft gennem forskellige mekanismer: genomisk ustabilitet, transkriptionel aktivering af proto-onkogener, aktivering af endogene retrovirus og transposoner, og induktion af inflammatoriske mediatorer. Alle disse mekanismer er blevet associeret med DNA hypometylering, dårlig prognose og tumor aggressivitet [26], [27], [28], [29], [30], [31]. Gentagne nukleotid elementer, herunder lange afbrudt nukleotid elementer-1 (dvs. LINE-1) indeholder talrige CpG sites, og tidligere undersøgelser har fastslået, at niveauet af LINE-1 methylering er en nøjagtig indikator for cellulær 5-methylcytosin indhold [18], som afspejler global DNA-methylering. I de senere år er det blevet foreslået, at LINE-1 methylering kan identificere forskellige molekylære undertyper af CRC. CIMP og MSI er omvendt forbundet med DNA hypometylering, tyder på, at genomisk hypometylering repræsenterer en alternativ vej for CRC progression, og kan afspejle en fundamentalt anderledes sygdom proces [32], [33]. Desuden har LINE-1 hypometylering blevet associeret med dårligere overlevelse blandt patienter med CRC, og repræsenterer en selvstændig faktor for øget kræft dødelighed og den samlede dødelighed [20]. Derfor er vigtigt evaluering af tumoral LINE-1 methylering og dets korrelation med kliniske og patologiske træk at bestemme den potentielle kliniske værdi af denne biomarkør.

Vi anvendte en kvantitativ pyrosekventering assay for LINE-1 methylering, som er en robust, nøjagtig og reproducerbar metode til præcist at kvantificere dette i individuelle tumorer [18]. Sammenlignet med ældre debuterende kolorektale tumorer, fandt vi signifikant lavere niveauer af LINE-1 methylering i tidlig debut CRCs. Denne observation blev valideret i et uafhængigt sæt tidlig debut CRC patienter, styrke styrken af ​​vores konklusioner. Desuden fandt vi, at LINE-1 hypometylering var forbundet med distale tumorer og dårligere prognose. Selv om der er ingen tidligere undersøgelser, der har specifikt undersøgt LINE-1 methylering i tidlig debut CRC patienter, en nylig undersøgelse foreslået en sammenhæng mellem større LINE-1 hypometylering i CRC og tidligere debut af kræft ( 60 år) [21] . Samlet tyder disse fund tilstedeværelsen af ​​en særskilt undertype af CRC med en unik patogen mekanisme [4], [13]. Da graden af ​​LINE-1 hypometylering er en prognostisk markør i CRC og vores data viser, at LINE-1 hypometylering er et karakteristisk træk ved tidlig debut CRC, denne undersøgelse giver en ny og hidtil ukendt forklaring på nogle af de biologiske forskelle (tumor placering, prognose og patologiske træk) er involveret i tidlig debut CRCs. Disse resultater giver mulighed for at forbedre vores forståelse af mekanismen bag tidlig debut CRC. I denne forbindelse er vi ved at undersøge, om LINE-1 hypometylering forårsager direkte transkriptionel reaktivering af visse proto-onkogener i denne indstilling, en unik funktion, der kan hjælpe med at forklare den aggressive kliniske adfærd tidlig debut CRC. Derudover vores resultater giver anledning til den hypotese, at LINE-1 hypometylering i perifert blod også kan evalueres som en prognose markør i den tidlige debut CRC’er.

Lynch syndrom er den hyppigste arvelige årsag til CRC, og tegner sig for ca. 1-3% af alle CRC’er [7]. Det er en autosomal dominant tilstand forårsaget af germlinie mutationer i DNA MMR gener (

MLH1, MSH2, MSH6, PMS2

), og

MSH2

MLH1

konto for ~ 90% af identificerbare familier. Dette syndrom har et gen-afhængig variabel penetrans for CRC og endometrisk carcinom, og en forøget risiko for forskellige andre extracolonic tumorer. Diagnosen Lynch syndrom er traditionelt blevet baseret på tumor MMR-mangel analyse, når der er mistanke denne sygdom [10], [11], men den endelige diagnose er etableret ved at finde en skadelig kimcellelinje mutation i et DNA MMR-gen. Men afsløre Lynch syndrom er en særlig udfordring i mangel af en pålidelig familie historie. Af denne grund er blevet foreslået universel screening med tumor MMR-mangel analyse [34], [35]. Vi har tidligere vist, at MFR-mangel tegner sig for op til 20% af tidlige debut CRC sager [4], [5]. Vi fandt også, at mønsteret af MMR-mangel i tidlig debut CRC patienter er ikke identisk med den for alle Lynch syndrom tilfælde, og er kendetegnet ved en øget hyppighed af MSH6 og PMS2 mangel. En anden diagnostisk udfordring er MSH6-mangelfulde CRC, da disse kan blive savnet, hvis screeningen algoritmen afhænger udelukkende på MSI test og omfatter ikke MMR immunhistokemi [22]. I den foreliggende undersøgelse, vi evaluerede MMR status i en argentinsk population af tidlig debut CRC ved at analysere både MSI og immunhistokemi af de fire MFR proteiner. Tyve syv (22,9%) tumorer blev klassificeret som MMR mangelfuld. MSH2 og MLH1 mangel tegnede sig for hovedparten af ​​tilfældene, dog op til 20% skyldtes enten MSH6 eller PMS2 mangel. En ud af 9 MLH1-mangel sager havde en

BRAF

mutation, der typisk er forbundet med

MLH1

promotor hypermethylering.