PLoS ONE: Styrkelse af Radiation Følsomhed i Lung Cancer Cells af en Novel Small Molecule Inhibitor der er rettet mod β-Catenin /Tcf4 Interaktion

Abstrakt

Strålebehandling er en vigtig behandling valg for inoperabel avancerede humane lungekræft, og en kritisk adjuverende behandling til kirurgi. Imidlertid stråling som en lungekræft behandling stadig langt fra tilfredsstillende grundet problemer forbundet med stråling modstand i cancerceller og alvorlig cytotoksicitet til ikke-cancerceller, som opstår ved doser indgives typisk til patienter. Vi har for nylig identificeret en lovende ny inhibitor af β-catenin /Tcf4 interaktion, opkaldt BC-23 (C

21H

14ClN

3 O

4S), der fungerer som en potent celledød forstærker, når de anvendes i kombination med strålebehandling. Sekventiel eksponering af human p53-nul ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) H1299 celler til lave doser af røntgenstråling efterfulgt en time senere ved administration af minimalt cytotoksiske koncentrationer af BC-23, resulterede i en meget synergistisk induktion af klonale celledød (kombinationsindeks 1,0). Samtidig behandling med BC-23 ved lave koncentrationer inhiberer effektivt Wnt /β-catenin signalering og nedregulerer c-Myc og cyclin D1-ekspression. S fasen anholdelse og ROS generation er også involveret i en styrkelse af stråling effektivitet medieret af BC-23. BC-23 udgør derfor en lovende ny klasse af stråling forstærker

Henvisning:. Zhang Q, Gao M, luo G, Han X, Bao W, Cheng Y, et al. (2016) Styrkelse af Radiation Følsomhed i Lung Cancer Cells af en Novel Small Molecule Inhibitor der er rettet mod β-Catenin /Tcf4 Interaktion. PLoS ONE 11 (3): e0152407. doi: 10,1371 /journal.pone.0152407

Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA

Modtaget: 16 oktober, 2015; Accepteret: 14. marts 2016 Udgivet: 25 Mar 2016

Copyright: © 2016 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra Connolly Endowment /Hendricks Fund og LUNGevity Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på trods af nylige fremskridt i leveringen af ​​strålebehandling og kemoterapi for lokalt fremskreden lungekræft, de fleste patienter tilbagefald og bukke under for deres sygdom [1-3]. Dette kan skyldes for en stor del, at tilstedeværelsen af ​​lungekræft stamceller: en population af celler, der er i stand til selvfornyelse, proliferation og metastase og det viser mærkbar radioresistance [4-6]. Cisplatin og paclitaxol er de to lægemidler mest udbredte i patienter til at sensibilisere lungecancer celle til strålebehandling [7]. Men bivirkninger og resistens over for disse stoffer stadig er til stede barrierer for at forbedre deres terapeutiske indekser.

Ikke-småcellet lungekræft (NSCLCs) tegner sig for 85% af tilfældene menneskelige lungekræft [8]. Undersøgelser er i gang på flere nye klasser af små molekyler radiosensibilisatorer og deres stråling styrke effekter på NSCLCs og andre menneskelige kræftformer [9-12]. På nuværende tidspunkt er fortsat et kritisk behov for opdagelse og udvikling af nye stråling forstærkere, der viser høj effektivitet og lav toksicitet.

Afvigende aktiveringer af Wnt /β-catenin signalering, der resulterer i opregulering af selv- fornyelse og spredning af lungekræft celler, er afgørende for lungekræft tumorigenese, progression, og kemo- og radioresistance [13-15]. Wnt /beta-catenin pathway aktiveres i 75% af alle kliniske NSCLC testede tilfælde og spiller en kritisk rolle i celleproliferation og overlevelse [16, 17]. Denne vej er over-aktiveret i NSCLC og mange andre kræftformer grundet overekspression af Tcf4, Wnt1, og Wnt2 og fører til en forhøjet akkumulering af β-catenin i kerner [18-20]. β-catenin binder sig til medlemmer af Tcf /Lef familie, regulering af ekspressionen af ​​målgener såsom c-myc og cyklin D1 [21-23]. Inhibering af overekspressionen af ​​Wnt 1, Wnt 2, og β-catenin fører til

in vitro

NSCLC celleapoptose og formindsket

in vivo

tumormasse [20].

emerging beviser implicerer Wnt /β-catenin vej i radioresistance af kræftceller [22, 24]. Nuklear β-catenin og Tcf4 ophobninger eller Wnt /β-catenin pathway hyper-aktivering er vigtige årsager til radioresistance [25]. Silencing af Tcf4 bevirker en betydelig sensibilisering af kræftceller til lave doser af stråling [26]. En inhibitor af Wnt /β-catenin signalvej, GDK-100.017, er blevet rapporteret at forbedre radiosensitivitet af NSCLC-celler ved at blokere β-catenin-Tcf /Lef interaktion [24].

Cancer stam- eller initierende celler der har forhøjede niveauer af nukleare β-catenin kan unddrage sig celledød normalt induceres ved stråling. Dette er delvist tilskrives virkningen af ​​β-catenin sammen med sine downstream gener, c-myc og cyclin D1, som medierer opregulering af selv-fornyelse og vedligeholdelse af stilken kræft /stamceller mod subletale eller dødelige stimuli [22, 27 ]. Inhibering af Wnt /β-catenin signalering reducerer c-myc og cyclin D1-niveauer, hvilket vil styrke den radiosensitivitet af cancerceller [24, 28, 29], men de præcise regulatoriske forhold mellem β-catenin, c-Myc, cyclin D1, reaktiv ilt arter (ROS), og cellecyklusstop /progression kræver yderligere afklaring. Alligevel den specifikke forstyrrelse af interaktionen mellem nuklear β-catenin og Tcf4 efter selektiv strålebehandling repræsenterer en særligt lovende strategi til forebyggelse af spredning og overlevelse af cancerceller. Denne strategi bevarer også den gavnlige funktion af β-catenin interaktioner med andre fysiologiske ligander [30].

I den foreliggende undersøgelse rapporterer vi på en ny og potent stråling forstærker, BC-23 (C

21H

14ClN

3 O

4S), der er rettet mod β-catenin /Tcf4 interaktion og signalering. Ved 3 uM, hvilket er en dosis, der forårsager lille cytotoksicitet, BC-23 behandling forårsager stærk synergistisk forøgelse af cancercelledød induceret af lave doser af stråling (dvs. et 2 log forøgelse af cancercelledød efter kombination med stråling). Nedregulering af c-myc-ekspression, opregulering af ROS produktion, og ophævelsen af ​​G2 /M arrest er de molekylære mekanismer bag den stråling-forøgende virkninger af BC-23. Denne rapport er den første til at beskrive overvindelsen af ​​radioresistance i humane NSCLC celler ved hjælp af en lille molekyle hæmmer af β-catenin /Tcf4. Disse data foreslog en potentiel nytte og anvendelse af dette stof til behandling af lungekræft.

Materialer og metoder

Reagenser og cellekultur

BC-23 (NSC45382) blev opnået fra NCI-databasen. ICRT14, N-acetyl cystein (NAC), og H

2DCFDA, blev købt fra Santa Cruz Biotechnology, Sigma-Aldrich, og Cayman Chemical hhv. H1299 og H1975-celler blev indkøbt fra ATCC. Cellerne blev dyrket og holdt i en befugtet 5% CO

2 atmosfære ved 37 ° C i RPMI1640 (Hyclone, Thermal Scientific) suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2 mM glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin.

Fluorescens polarisering-baserede kompetitiv binding assay

Fluorescens polarisering (FP) blev udført i henhold til vores tidligere rapporter, med mindre modifikationer [31]. Kort fortalt, 20 nM sporstof [FITC-mærket Tcf4

(8-30) probe] og 500 nM β-catenin blev blandet og inkuberet med /uden BC-23 i 100 pi PBS (indeholdende 0,01% Triton X-100). Efter 3 timers inkubation ved stuetemperatur blev FP-værdier optaget med en Synergy 2 mikropladelæser (BioTek) ved en excitation /emission på 485 /528nm.

TOP-flash Luciferase reportergenassay

H1299-celler ved 1 x 10

4 celler /brønd blev transficeret med nt /β-catenin reportergenet TOP-flash, huser Tcf4 bindingssteder for β-catenin og pRL-CMV Renilla-luciferase kontrol reporter vektor (Promega, E2261). Fire timer efter transfektion blev celler behandlet med forskellige koncentrationer af BC-23 eller ICRT14. Luciferaseaktiviteten blev bestemt 24 timer efter behandling under anvendelse af Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, E1910). TOP luciferaseaktivitet blev normaliseret ved kontrol pRL-CMV Renilla Luciferase aktivitet.

I silico

virtuel screening

Vi forberedte receptor struktur fra en krystalstruktur β-catenin /TCF4 kompleks (PDB kode 1JPW) og udført en

i silico

virtuel screening ved hjælp Autodock4 som tidligere rapporteret [30].

Real-Time PCR

H1299 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af BC-23 i 16 timer. Totalt RNA blev isoleret under anvendelse af et RNeasy Kit (Qiagen). CDNA’et blev syntetiseret ved anvendelse af en høj kapacitet cDNA revers transkription Kit (Invitrogen). Real-time PCR blev udført på en LightCycler

® 480 System ved hjælp LightCycler

® 480 SYBR Green I Master (Roche). Tærsklen cyklus (C

t) værdier blev normaliseret til p-actin intern reference. Primerne anvendt i real time PCR var som følger: β-actin, fremadrettet 5′-AGAAAATCTGGCACCACACC-3 ‘; bagudrettet 5’-AGAGGCGTACAGGGATAGCA-3 ‘; c-myc, fremadrettet 5’-TCAAGAGGCGAACACACAAC-3 ‘; bagudrettet 5’-GGCCTTTTCATTGTTTTCCA-3 ‘; cyclin D1, frem 5’-AACTACCTGGACCGCTTCCT-3 ‘; bagudrettet 5’-GGGGATGGTCTCCTTCATCT-3 ‘.

Cytotoksicitetsassay

H1299 celler, udplades i 96-brønds plader med 1×10

3 celler /brønd blev behandlet med de ønskede koncentrationer af BC- 23 i 100 pi medium og inkuberet i 1 dag eller 3 dage. Cellelevedygtighed blev bestemt ved tilsætning af 20 pi CellTiter-blå (Promega, G8081) til hver brønd. Efter en 4 timers inkubation ved 37 ° C blev fluorescens bestemmes ved anvendelse af en Synergi 2 mikropladelæser (BioTek) ved en excitation /emission på 550 nm /600 nm.

klongenicitetsassayet Salg

H1299 celler blev bestrålet med 0-10 Gy stråling (RS-2000 Biologisk Research strålerøret, Rad Source). En time senere blev celler behandlet med DMSO eller 3 uM BC-23 og inkuberet i yderligere 24 timer. Cellerne blev derefter udsået i 6-brønds plader ved 500-2000 celler per brønd og inkuberet i 12 dage for at tillade kolonidannelse. Kolonier bestående af 50 eller flere celler blev talt under et mikroskop. Udpladningseffektiviteten (PE) blev beregnet ved at dividere antallet af kolonier af celleantallet podet. Den overlevende fraktion blev beregnet ved at dividere PE værdier af stråling grupper ved ordlyden af ​​de tilsvarende ikke-bestrålede grupper. blev bestemt effekten af ​​antioxidanten NAC på BC-23-induceret cytotoksicitet og inhibering af væksten i H1299-celler efter tilsætning af 1 mM NAC, sammen med forskellige koncentrationer af BC-23, til cellerne. Efter inkubation i 24 timer blev cytotoksicitet og kolonidannelse bestemt som beskrevet ovenfor.

Transient transfektion med CTNNB1 siRNA

H1299-celler blev udpladet i seks-brønds plader. Efter at have nået 50% til 60% konfluens blev cellerne transficeret med validerede human b-catenin (CTNNB1) siRNA eller negativ kontrol siRNA 1 (Ambion, Inc.) ved en slutkoncentration på 100 nM med JetPRIME reagens (POLYPLUS transfektion, NY USA ), i henhold til fabrikantens anvisninger. Efter en 24 timer transfektion blev cellerne delt i 2 grupper, en for western blots og den anden for stråling følsomhedsanalyse. Til Western blots, blev dyrkningsmediet erstattet med frisklavet medium, og cellerne blev inkuberet i yderligere 24 timer før tilberedningen protein. For stråling følsomhedsanalyse, blev cellerne behandlet med eller uden 6 Gy stråling. Efter bestråling blev cellerne behandlet med 3 uM BC-23 eller DMSO-vehikel og høstet ved 48 timer efter transfektion for klonogene assays.

Protein ekstraktion og western blot-analyse

Cellerne blev opsamlet og lyseret i lysisbuffer (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% natriumdodecylsulfat (SDS), 1% deoxycholsyre, 2 mM orthovanadat, 100 mM NaF, 1% Triton X-100, 0,5 mM phenylmethylsulfonylfluorid) indeholdende en proteasehæmmer og phosphatase inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich). Proteinindhold blev kvantificeret ved BCA-metoden. Proteinprøver (20 ug) blev elektroforesebehandlet i 10% SDS polyacrylamidgeler og overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Bedford, MA, USA). Membranerne blev blokeret og inkuberet natten over ved 4 ℃ med et monoklonalt kanin-anti-β-catenin (1: 1000, Cell Signaling Technology, MA, USA) primært antistof, eller med et monoklonalt muse-anti-β-actin (1: 2000, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) primært antistof som en loading kontrol. Efter vask blev blottene inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med tilsvarende peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundære antistoffer (1: 5000; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA), visualiseret med ECL-opløsning (Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce, Rockford, IL, USA) og eksponeret under anvendelse af ChemiDoc ™ MP System (Bio-Rad).

Cellecyklusanalyse

H1299-celler blev udpladet i 6-brønds plader og bestrålet med 4 Gy stråling. En time senere blev celler behandlet med 5 pM BC-23 og inkuberet i 24 timer. Efter vasket med PBS blev cellerne fikseret i 70% kold ethanol i 15 minutter ved -20 ° C, og derefter rehydratiseret i PBS i yderligere 15 minutter. Cellepellets blev resuspenderet og farvet med 3 uM propidiumiodid (PI, Life Technologies, P3566) i 0,5 ml puffer (100 mM Tris, pH = 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM CaCI

2, 0,5 mM MgC

2, 0,1% Nonidet P-40) med 1 ug /ml RNase A. cellerne blev inkuberet i 40 minutter ved stuetemperatur. Flowcytometrisk analyse blev udført med en excitationsbølgelængde på 488 nm og emissionsbølgelængde på 576 nm. Cell cyklus blev analyseret ved hjælp FlowJo (version 9.7.5) analyse software.

Bestemmelse af ROS produktion

generation af ROS blev bestemt ved anvendelse af H

2DCFDA-baserede assay, ifølge metoderne publiceret tidligere [32, 33]. Kort beskrevet blev H1299 celler udpladet i plader med 96 brønde ved 2,5 x 10

4 celler /brønd og dyrket i 24 timer. Efter to gange vask med PBS blev cellerne inkuberet med 20 pM H

2DCFDA (Cayman Chemical) ved 37 ° C i 45 minutter og derefter behandlet med BC-23, stråling, eller en kombination af BC-23 plus stråling. Fluorescensintensiteten (excitation /emission = 485/535 nm) blev registreret i 2 timer ved hjælp af en Synergy H1 mikropladelæser (BioTek).

Statistisk analyse

En statistisk analyse blev udført ved hjælp af One -vejs ANOVA efterfulgt af Tukey Multiple Sammenligning Test (Prism 5,0, GraphPad Software).

P

værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Gennemsnitlige værdier blev udtrykt som middelværdi ± S.D. De kombinerede anticancer effekter af BC-23 og røntgenstråling blev bestemt ved anvendelse Chou og Talalay metode: CI (kombinationsindeks) = [(D)

1 /(Dx)

1] + [(D)

2 /(Dx)

2] + (D)

1 (D)

2 /(Dx)

1 (Dx)

2, hvor (D)

1 og (D)

2 repræsenterer doserne af behandling 1 (BC-23) og 2 (stråling), der producerer x effekt, når de anvendes i kombination, (Dx)

1 og (Dx)

2 er de doser af behandlinger 1 og 2, der producerer den samme x virkning, når de anvendes alene.

Resultater Salg

BC-23 inhiberer bindingen mellem β-catenin og Tcf4 og Wnt /β-catenin signalering

Vi bestemmes direkte hæmmende effekter af udvalgte forbindelser på interaktionen mellem β-catenin og Tcf4 bruge vores nyligt udviklet celle-fri kompetitiv binding assay baseret på fluorescens polarisering (FP). Blandt de testede forbindelser, BC-23 udviste kraftig aktivitet (IC

50 værdi på 1,7 uM) mod binding mellem β-catenin og et FITC-mærket Tcf4

(8-30) probe (figur 1). BC-21, som blev rapporteret af vores gruppe som en inhibitor af Wnt /β-catenin pathway, blev anvendt som en positiv kontrol i FP-assays. BC-21 behandling hæmmede de β-catenin /Tcf-4 interaktioner med en IC

50 værdi på 5 uM [31]. Luciferase-baserede top (huser TCF /LEF bindingssted) reporter assay (anvendt til at teste den inhibitoriske virkning af BC-23 på den transkriptionelle aktivitet af Wnt /β-catenin pathway i β-catenin overudtrykkende cancerceller) viste, at BC- 23 dosisafhængigt inhiberede TOP-luciferaseaktivitet i H1299-celler, med en IC

50 værdi på 2,3 uM (fig 2). Dette antyder endvidere, at BC-23 målrettet interaktionen mellem β-catenin og Tcf4 og inhiberede deres medieret transkriptionel aktivitet. Vi bruges pRL Renilla-luciferase reporter som en intern kontrol til assayet og ICRT14 (en inhibitor af β-catenin-responsive transkription) som en positiv kontrol. ICRT14 ved 1 uM inhiberede 38% af TOP-luciferaseaktivitet.

En blanding af 500 nM β-catenin og 20 nM FITC-Tcf4

(8-30) inkuberet i fravær eller nærvær af det angivne koncentrationer af BC-23. Fluorescenspolarisering (FP) værdier blev registreret efter 3 timer. Den relative binding blev beregnet som (MP

T-MP

f) /(MP

C-MP

f) × 100. Punkterne repræsenterer middelværdi ± S.D. af 3 uafhængige forsøg.

H1299 celler blev co-transficeret med reporter TOP-flash og kontrol- Renilla plasmider. Fire timer efter transfektion blev celler behandlet med forskellige koncentrationer af BC-23 i 24 timer. TOP luciferaseaktiviteter blev bestemt og normaliseret til Renilla luciferase-aktiviteter. BC-23 udviste dosisafhængig hæmmende aktivitet på TOP luciferase i H1299 celler, med en IC

50 værdi på 2,3 uM. Søjlerne repræsenterer gennemsnit ± S.D. af 3 uafhængige forsøg.

BC-23 blokerer strukturelle samspil af β-catenin med Tcf4

Vi har analyseret bindende kropsbygning af BC-23 og β-catenin hjælp molekylær docking ( fig 3A). Interaktionen af ​​Tcf4 Asp16 med β-catenin Lys435 er kritisk for deres binding. Vores krystalstruktur analyse viste, at Asp16 af Tcf4 dannet en hydrogenbinding med β-catenin Lys435, mens Glu17 af Tcf4, som var tilstødende til Asp16, dannede en saltbro med Lys508. Som vist i fig 3B, BC-23 besat en stilling på Asp16 og Glu17, danner en hydrogenbinding med Asn430 sidekæden med afstand på 3,08 Å. Dette formentlig blokerer interaktionen mellem Tcf4 og β-catenin via Asp16 af Tcf4. Desuden β-catenin Lys508 dannede anden hydrogenbinding med oxygenatomet i naphthoquinon gruppen af ​​BC-23 med en afstand på 2,90 Å. Den naphthoquinon gruppe af BC-23 undergik også hydrofobe interaktioner med de alifatiske dele af β-catenin Pro505. Dette ville blokere interaktionen af ​​β-catenin med Tcf4 Glu17.

De bindende modeller blev genereret af Autodock og PyMOL.

BC-23 betydeligt forbedrer stråling-induceret klonogenisk celledød i H1299 NSCLC celler

H1299-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af BC-23 i 24-72 timer. Ved afslutningen af ​​hver behandling blev cellelevedygtighed bestemt ved CellTiter Blå assayet. BC-23 alene udviste moderat cytotoksicitet mod H1299 celler, med IC

50 værdier på 7,6 og 4,5 uM i 1 dag og 3 dages behandlinger, (fig 4A). Imidlertid sekventiel behandling af H1299-celler med 2-10 Gy stråling og 3 uM BC-23 resulterede i en 2-log stigning i klonogene død H1299 celler sammenlignet med 10 Gy stråling alene (Fig 4B). Indekset for kombination til klonogenisk celledød var mindre end 1. Denne signifikant forøgelse af klonogenisk celledød i H1299-celler ved kombinationen af ​​BC-23 og strålebehandlinger indikerer en stråling-fremmende virkning af BC-23.

EN. H1299-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af BC-23 alene i 1 (○) og 3 (•) dage. Cellelevedygtighed blev bestemt ved CellTiter Blå assayet. B. Sekventiel eksponering af H1299-celler til 2-10 Gy stråling, efterfulgt 1 time senere ved behandling med 3 uM BC-23 (■), dramatisk forøget induktion af klonogene celledød sammenlignet med strålebehandling alene (●). Hvert punkt repræsenterer gennemsnitsværdierne af tre separate forsøg.

kombinere BC-23 med stråling øger ROS generation i H1299 celler

Graden af ​​den samlede oxidativt stress blev bestemt ved at overvåge ROS hjælp H

2DCFDA. Vi undersøgte de intracellulære niveauer af ROS genereret over tid. ROS-niveauer ved 2 timer efter behandling var 2 gange højere i celler behandlet med den kombinerede indgivelse af 10 Gy stråling og 3 uM BC-23 end i celler fik enten behandling alene (fig 5A). Den potentielle rolle af ROS i BC-23-medieret celledrab og inhibering af kolonidannelse blev yderligere testet ved anvendelse af NAC (en antioxidant) til at fjerne den ROS i cellerne. NAC afskaffet signifikant cytotoksiske og vækst-hæmmende virkninger af BC-23 i H1299 celler (Fig 5B-5D).

A. Kombinere 3 pM BC-23 med 10 Gy stråling (x) dramatisk forøget ROS-generering, i forhold til de enkelte behandlinger alene: vehikelkontrol (●), 3 pM BC-23 (■) og 10 Gy stråling (▲). Hver værdi er middelværdien ± SD af tre separate forsøg. B-D, ROS-afhængige cytotoksiske virkninger af BC-23. NAC dæmper celledød medieret af eksponering af H1299-celler til de angivne koncentrationer af BC-23 i cytotoksicitet (B) og colongenic assays (C, repræsentative retter af klonogene assays og D, analyser af procentdelen af ​​overlevende celler). *, P. 0,05 versus kontrol

BC-23 inducerer S fasen anholdelse i H1299 celler

cellecyklusstop på S og G2 /M faser er en vigtig mekanisme, der forårsager celledøden set som respons på behandling med en kombination af stråling og anticancerlægemidler, herunder wnt /p-catenin pathway hæmmere. En 24 h behandling med 5 uM BC-23 alene signifikant forøget procentdelen af ​​celler (45%) i S-fasen, når der sammenlignes med kontrolceller (25%). Behandling med en kombination af 4 Gy stråling og 5 pM BC-23 resulterede i en lignende procentdel af H1299 celler i S-fasen, men cellerne blev også blokeret ved G2 /M-fasen af ​​strålebehandling (figur 6).

H1299 celler blev behandlet med vehikelkontrol (A), 5 uM BC-23 (B), 4 Gy stråling (C) og 4 Gy stråling plus 5 uM BC-23 (D). Procentdelen af ​​celler i hver fase af cellecyklussen blev bestemt ved propidiumiodid (PI) farvning og FACS-analyse. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

BC-23 nedregulerer ekspressionen af ​​c-myc og cyclin D1 og β-catenin knockdown af CTNNB1 siRNA signifikant blokeret strålingssensibiliserende virkning af BC-23

Vi har udført yderligere tests om virkningerne af BC-23 på Wnt /β-catenin /Tcf4 signalvejen ved at bestemme dens virkninger på ekspressionen af ​​c-myc og cyklin D1, som er to vigtige specifikke målgener af p-catenin /Tcf4 signalering. Efter en 16 h behandling med 20 og 40 uM BC-23, mRNA ekspressionsniveauer af c-Myc og cyclin D1 blev væsentligt reduceret i H1229 celler (Fig 7). Vi undersøgte ekspressionen af ​​andre gener (fx β-actin), som ikke var relateret til regulering ved p-catenin /Tcf4 interaktion og deres udtryk var ikke berørt af BC-23. De tærskel cyklus værdier i figur 7 blev normaliseret til β-actin intern reference. Disse data er et yderligere bevis på, at BC-23 nedregulerer både cyclin D1 og c-myc, som er overudtrykt i mange cancerceller, herunder H1229 celler. Vi har også brugt CTNNB1 siRNA at reducere β-catenin-ekspression i H1299 celler for at bestemme, om strålingssensibiliserende virkning af BC-23 afhænger af β-catenin pathway. Fig 8A viser, at CTNNB1 siRNA signifikant reducerede β-catenin-ekspression sammenlignet med kontrol-siRNA. Silencing af komponenterne i Wnt /β-catenin pathway er kendt for at øge radiosensitivitet af cancerceller. Som forventet knockdown af β-catenin med CTNNB1 siRNA signifikant forøgede radiosensitivitet af H1299-celler, hvorimod transfektion med kontrol siRNA ikke ændrede radiosensitivitet sammenlignet med 6 Gy stråling alene, som vist i fig 8B. BC-23 forøgede radiosensitivitet af H1299-celler behandlet med kontrol siRNA. Men nedregulering af β-catenin-ekspression med CTNNB1 siRNA blokeret strålingssensibiliserende virkning af BC-23 sammenlignet med kontrolgruppen siRNA gruppen, hvilket antyder, at den strålingssensibiliserende virkning af BC-23 afhænger i det mindste delvis på Wnt /β- catenin pathway.

H1299-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af BC-23. Total RNA og cDNA blev fremstillet efter en 16 h behandling. CDNA’et blev wuantified af real-time PCR og normaliseret mod en vehikelkontrol. BC-23 behandling inhiberede signifikant ekspression af både Wnt /β-catenin målgener c-myc og cyclin D1 på mRNA-niveauet. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. *, P 0,05 og **, p. 0,01 versus kontrol

De H1299 celler blev behandlet med CTNNB1 eller med kontrol siRNA. Protein blev fremstillet ud fra en del af cellerne Til Western-blotting og de resterende celler blev anvendt til radiosensitivitet assays med 6 Gy stråling med /uden BC-23. A, CTNNB1 siRNA reducerede β-catenin-ekspression betydeligt. B, CTNNB1 siRNA signifikant blokeret strålingssensibiliserende virkning af BC-23. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. ****, S 0,001 versus kontrol; ###, P 0,001 versus 6 Gy + kontrol siRNA; , p 0,01 versus 6 Gy + kontrol siRNA + BC-23

Diskussion

Vi bestemmes direkte hæmmende effekter af udvalgte forbindelser fra NCI om samspillet mellem. β-catenin og Tcf4 bruge vores nyligt udviklet celle-fri kompetitiv binding assay baseret på FP [31]. Blandt de testede forbindelser, BC-23 udviste kraftig aktivitet (en IC

50 værdi på 1,7 uM) mod interaktionen mellem β-catenin og et FITC-mærket Tcf4

(8-30) probe (figur 1). Vi anvendte også et cellebaseret TOP (huser Tef /Lef-bindingssted) luciferase assay for at teste virkningen af ​​BC-23 på transkriptionel aktivitet af Wnt /β-catenin pathway. BC-23 dosisafhængigt inhiberede TOP aktivering i H1299-celler, med en IC

50 værdi på 2,3 uM (fig 2). Disse data antyder, at BC-23 er rettet mod den β-catenin /Tcf4 interaktion. Analyse af bindende konformation af BC-23 ved molekylær docking afslørede, at BC-23 besat en stilling på Asp16 og Glu17 af Tcf4, danner to hydrogenbindinger med Asn430 og Lys508 og hydrofobe interaktioner med Pro505 af β-catenin (fig 3B). Dette indikerede, at BC-23 blokerer interaktionen mellem Tcf4 og β-catenin i Asp16 og Glu17 i Tcf4. (Fig 3A 3B)

Vi testede potentialet i BC-23 til at fungere som en stråling forstærker for NSCLC H1299 celler. Høje niveauer af nukleare β-catenin er blevet fundet i mange humane lunge cancerceller [16]. Tilstedeværelsen af ​​lungekræft stamceller (LCSCs), der er i stand til selv-fornyelse, spredning og metastaser kan give tumor resistens mod stråling [4-6]. Vi antager, at administrationen af ​​BC-23 kan måske forbedre virkningen af ​​strålebehandling på lungekræft celler gennem hæmning af β-catenin /Tcf4 interaktion og signalering. Vi først bestemmes cytotoksicitet BC-23 alene i H1299 celler ved CellTiter-Blå analysen. BC-23 alene udviste moderat cytotoksicitet mod H1299 celler, med IC

50 værdier på 7,6 og 4,5 uM i 1 dag og 3 dages behandlinger henholdsvis som vist i fig 4A. Behandling af H1975-celler (en p53 vildtype NSCLC) med BC-23 til 1 og 3 dage resulterede i IC

50 værdier for BC-23 på 7,9 og 5,2 uM, som var værdier er sammenlignelige med dem opnået for H1299-celler . Dette antyder, at den cytotoksiske virkning af BC-23 er uafhængig af p53. Sekventiel behandling af cellerne med 2 til 10 Gy stråling, efterfulgt 1 time senere ved administration af 3 uM BC-23, signifikant forøget strålingen-medieret klonogenisk celledræbende virkning i H1299 celler (Fig 4B). BC-23, i kombination med 10 Gy stråling, forårsagede en 2-log stigning i klonogene død H1299 celler sammenlignet med 10 Gy stråling alene.

De potentielle mekanismer, hvormed BC-23 forbedrer død NSCLC celler udsat for stråling blev yderligere undersøgt ved at analysere cellecyklussen og ROS-produktion i H1299-celler behandlet med BC-23 og stråling, alene eller i kombination. Tidligere undersøgelse antyder, at Wnt /β-catenin signalvejen spiller en rolle i reguleringen af ​​cellecyklus og nucleus-lokaliserede β-catenin-TCF komplekse stigninger i S-G

2 [34, 35]. aktivering β-catenin er forbundet med overlevelse af celler med beskadiget DNA (forårsaget af ROS) og med DNA reparere fejl [36]. BC-23, alene eller kombineret med stråling, standset H1299 celler i S-fasen (figur 6), sammenlignet med vehikelkontrollen og stråling alene. Den kombinerede behandling af BC23 og stråling S fasen og en samtidig strålingsinduceret G2 /M cellecyklus blok. Disse resultater antyder, at der opstår forsinkelser i cellecyklus overgang eller /og i DNA dobbeltstrengsbrud forarbejdning i H1299 celler efter samtidig behandling med BC-23 og stråling. Forsinkelsen i DNA-syntese forårsaget af BC-23 kan forværre overlevelse af celler, der undergår G

2 /M anholdelse (Fig 6) forårsaget af udsættelse for stråling, og det resulterende ROS (Fig 5). BC-23 signifikant induceret ROS-generering i H1299 celler i en dosis-afhængig måde (figur 5A). Den potentielle rolle af ROS i BC-23-medieret celledrab og klonogenisk celledød blev yderligere bekræftet ved anvendelse antioxidanten NAC til at fjerne den ROS i cellerne. NAC behandling signifikant afskaffet den cytotoksiske virkning af BC-23 i både cytotoksicitet og koloniassays (Fig 5B-5D). Den øgede ROS induceret af BC, 23 kan yderligere hæmme β-catenin /Tcf4 vej, fordi ROS negativt modulere Wnt /β-catenin signal vej gennem nedregulering af β-catenin [37].

Vi opnåede yderligere bekræftelse af den specifikke effekt af BC-23 på Wnt /β-catenin /Tcf4 signalering ved at undersøge mRNA-ekspression af c-Myc og cyclin D1, to kritiske nedstrøms gener af Wnt /β-catenin pathway. blev observeret signifikant inhibering af ekspressionen af ​​både c-Myc og cyclin D1 i H1299-celler efter en 16 h behandling med 20 og 40 uM BC-23 (figur 7). Yderligere bevis blev tilvejebragt af den iagttagelse, at CTNNB1 siRNA reducerede β-catenin-ekspression og væsentligt blokeret strålingssensibiliserende virkning af BC-23 i H1299 celler (Fig 8). Samlet set ligand- og pathway-specifikke cellefri og cellebaserede assays, samt

in silico

molekylære docking resultater, viste, at BC-23 er en ny inhibitor af β-catenin /Tcf4 at specifikt rettet mod β-catenin /Tcf4 interaktion og hæmmer deres transkriptionelle aktivitet [38].

Konklusion

Vi har identificeret og karakteriseret en ny lille molekyle BC-23, der er rettet mod samspillet mellem β- catenin /Tcf4 og hæmmer deres transkriptionsaktivitet. BC-23 nedregulerer to vigtige Wnt /β-catenin pathway-gener: c-Myc og cyclin D1.