PLoS ONE: Eksogen Tilsætning af arachidonsyre til Kultur Medier Forbedrer Funktionalitet af dendritiske celler til deres mulige anvendelse i Cancerimmunterapi

Abstrakt

Udviklingen af ​​dendritiske celle baserede vacciner er en lovende tilgang kræft immunterapi. For deres vellykkede anvendelse i klinikker, formering og funktionaliteten af ​​DC’er er afgørende. Vi tidligere etableret en to-trins fremgangsmåde til målestok af DC’er store fra navlestrengsblod afledt MNCs /CD34 + celler. Dette arbejde har til formål at forbedre deres funktionalitet baseret på følgende bemærkninger:

in vitro

genereret udviklingslandene kan være mindre effektiv i migration og andre funktionelle aktiviteter på grund af lavere eicosanoid niveauer. Produktion af eicosanoider ud fra arachidonsyre (AA) kan hæmmet på grund af undertrykkelse af enzymet phospholipase A2 med IL-4, et vigtigt cytokin der kræves for differentieringen af ​​DC’er. Vi antager, at exogen tilsætning af AA til dyrkningsmediet under DC generation kan resultere i DC’er med forbedret funktionalitet. DC’er blev dannet med og uden AA. De to DC-sæt blev sammenlignet med fænotypisk analyse, morfologi og funktionelle assays som antigen optagelse, MLR, CTL assay og

in vitro

in vivo

migration. Selv om der var ingen forskel mellem de to typer af DC’er i form af morfologi, fænotype og antigen optagelse, AA

+ DCs udviste en forbedret

in vitro

in vivo

migration, T celle stimulatorisk kapacitet, CTL-aktivitet og signifikant højere transkriptniveauer af COX-2. AA

+ DC’er viser også en gunstig Th1 cytokin profil end AA

– DC’er. Således tilsætning af AA til dyrkningsmedierne skævvridning DC’erne mod sekretion af mere IL-12 og mindre af IL-10 sammen med genoprettelse af eicosanoider niveauer i en COX-2-medierede pathway dermed forbedre funktionaliteten af ​​disse celler, der skal anvendes som en potent cellulær vaccine. Tilsammen vil disse resultater være nyttigt i bedre contriving af DC baserede vacciner til cancerimmunterapi

Henvisning:. Kumar J, Gurav R, Kale V, Limaye L (2014) Eksogen Tilsætning af arachidonsyre til Kultur medier Forbedrer Funktionalitet af dendritiske celler til deres mulige anvendelse i Cancerimmunterapi. PLoS ONE 9 (11): e111759. doi: 10,1371 /journal.pone.0111759

Redaktør: Thorbald van Hall, Leiden University Medical Center, Holland

Modtaget: 13 juni, 2014, Accepteret: September 30, 2014; Udgivet: November 4, 2014

Copyright: © 2014 Kumar et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Forfatterne bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for de supplerende oplysninger filer

Finansiering:. Projektet fik midler fra Institut for Bioteknologi (DBT), Indiens regering via tilskud nr. BT /PR13565 /MED /31/89/2010. JK fik sin stipendium fra Rådet for videnskabelig og industriel forskning (CSIR) Indien og fra DBT (PR- 4930/31). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Dendritiske celler (DCS) er mest effektive antigen-præsenterende celler (APC’er), som genkender univers af antigener og styre forskellige typer af reaktioner [1], [2]. Udviklingslandene er i stand til at opfange antigener, behandle dem, og præsentere dem med passende co-stimulering molekyler og initiere immunrespons [3], [4]. DC’er er ikke blot afgørende for induktionen af ​​både primære og sekundære T- og B-celle-medierede immunresponser, men er også vigtige for induktionen af ​​immunologisk tolerance. DC’er er i centrum af immunsystemet og modulering af immunresponset er vigtig i terapeutisk immunitet mod cancer [5]. Den unikke evne af DC’er i antigen-præsentation og regulering af immunrespons har gjort dem til et attraktivt hjælpestof i cancer immunterapi [6]. Fremskridt i den

in vitro

DC generation protokoller og bedre forståelse af DC biologi har resulteret i deres anvendelse som DC vacciner i klinikkerne. Siden sin første rapport i 1995, har et stort antal kliniske forsøg blevet udført for at evaluere DC-baserede vacciner mod mere end et dusin forskellige typer tumorer [7], [8], [9]. Klinisk anvendelse af DC’er kræver gentagen vaccination for at inducere relativt høje frekvenser af tumor antigen-specifikke cytotoksiske T-lymfocytter (CTL’er) og en komplet respons. Dette kræver et stort antal DC’er, genereret

ex vivo

[10].

DC’er kan genereres fra CD34

+ celler ved hjælp af en et trin eller en totrins kultur systemer . I den første type af kultur-system CD34 er

+ celler dyrket med en kombination af vækstfaktorer, hvor i de er direkte differentieres som dendritiske celler [11], [12], [13]. På den anden side, i to trin dyrkningssystemet CD34

+ celler først ekspanderes i stor målestok som DC-forstadier. Disse udvidede celler yderligere differentieres DCs [14], [15], [16], [17]. På trods af den fulde forståelse af den komplekse DC-medieret regulering af værten leukocyt reaktioner,

in vitro

genereret udviklingslandene kan ikke repræsentere hvad der svarer til vandrende DC

in vivo

, hvilket begrænser deres anvendelse som magiske kugler at forbedre præcisionen og effektiviteten i cancerimmunterapi. Nyere eksperimentelt bevis viser, at human monocyt-afledte DC (MoDC) kan hæmmes i deres evne til at migrere som respons på inflammatoriske samt homeostatiske kemotaksiner [18]. Tidligere rapporter viser, at IL-4, som er et vigtigt cytokin efter

in vitro

DC generation, inhiberer mange af de nedstrøms veje af arachidonsyre (AA) metabolisme resulterer i forringet produktion af eicosanoider og blodpladeaktiverende faktor ( PAF). Prostaglandin E

2 (PGE

2) er et medlem af den eicosanoid familie af iltet AA derivater. Det første skridt i PGE

2 biosyntese er udgivelsen af ​​AA fra membranphospholipider ved phospholipaser såsom phospholipase A2 (PLA

2). Eftersom eicosanoider og PAF er kendt for at spille en vigtig rolle i processer som leukocyt migration, naturlige dræberceller celle aktivering, og type 2 T hjælper celle differentieringer, kan mangel på biosyntesen af ​​disse faktorer være ansvarlige for de observerede handicap MoDCs [19] .

Vi tidligere etableret en to-trins plast adhærens fremgangsmåde til målestok store af DC’er afledt af både navlestrengsblod CD34 + celler [17] og MNC’er (Mononukleare celler) [20]. De DC’er genereret af vores fremgangsmåde har en moden fænotype og er funktionelt aktivt. Men en af ​​de cytokiner, der anvendes til at generere DC’er fra vores metode er IL-4 og som nævnt ovenfor IL-4 kan påvirke frigivelsen af ​​arachidonsyre fra membrane.We hypotese, at exogen tilsætning af AA til vore kulturer under differentieringen trin kan hjælpe i yderligere forbedring funktioner udviklingslandene. Begrundelsen for tilsætning af eksogent AA var, at det kan blive omdannet til prostaglandiner i en cyclooxygenaser-1 (COX-1) og cyclooxygenaser-2 (COX-2) afhængig måde. For at kontrollere denne hypotese, i nærværende undersøgelse testede vi effekten af ​​AA tilføjelse på

in vitro

DC generation. Vores data viste, at faktisk AA

+ DC’er er overlegne i funktioner som forbedret

in vitro

in vivo

migration, T-celle stimulerende kapacitet, antigen optagelse, CTL-aktivitet, betydeligt højere udskrift niveauer af COX-2 og en gunstig Th1 cytokin end AA

– DC’er. Således vores resultater tage os et skridt tættere på at generere lindre form af DC baseret cancervaccine.

Materialer og metoder

Cytokiner

De rekombinante humane cytokiner, der anvendes til undersøgelsen var fms lignende tyrosinkinase 3 ligand (Flt-3L), thrombopoietin (TPO), stamcellefaktor (SCF), interleukin-4 (IL-4), granulocyt monocyt -colony faktor (GM-CSF), tumornekrosefaktor-α (TNF-α), CD40 ligand og kemokinligand-19 (CCL-19). Alle rekombinante humane cytokiner blev købt fra Peprotech Asien, Revohot Israel

Antistoffer

Antistofferne bruges til flowcytometri var muse-anti menneskelige mAbs:. CD1a, CD34, CD11c, CD40, CD8 APC mærkede ; CD14, CD20, CD33, CD58, CD80, CD83, CD86, HLA-A2, mærkede CD45RA-PE; CD3, CD54, HLA-DR, HLA-ABC-FITC mærkede, anti murine CD 45.1 -PB mærkes og CCR-7 (oprenset antihuman rotte mAb). Alle monoklonale antistoffer og respektive isotypekontroller anvendt til undersøgelsen, blev indkøbt fra BD Pharmingen (San Diego, CA).

Andre anvendte reagenser

Arachidonsyre syre- (katalog nr. Er A3555) fra Sigma Aldrich, en vævskultur testet produkt fra svinelever. Renheden af ​​produktet var ≥99% som analyseret ved kapillar gaskromatografi

Ficoll Hypaque-Histopaque (densitet 1,007 g /ml).; Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -mærket dextran (40 kDa); Wright Stain, Giemsa Stain, Lipopolysaccharid, DMEM (Dulbeccos modificerede Eagle-medium) og IMDM (Iscove Modified Dulbeccos Medium) alle var fra Sigma Aldrich; ELISA-kit (BD OptEIA); Heparin fra SRL Pvt. Limited, Mumbai; Hydroxyethylstivelse (HES), Rosette september for T-celle isolation (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada); [

3H] thymidin (240 GBq /milli muldvarp, BRIT, Navi Mumbai, Indien); Dimethylsulfoxid (MP biomedicinsk, Ohio, USA); Dynal kit til mRNA isolation (Dynal ASA, Oslo Norge).

Indsamling og behandling af navlestrengsblod Prøver

Navlestrengsblod (CB) prøver blev indhentet fra de lokale hospitaler i henhold til den institutionelle review board [Institutionel etiske komité (IEC) og Institutional udvalg for Stamcelleforskning (IC-SCRT)] -godkendte etiske retningslinjer, som er i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen. blev opnået en forudgående informeret skriftligt samtykke fra moderen. Proceduren for godkendelse blev godkendt af IC-SCRT. De hårde kopier af de underskrevne samtykkeerklæringer er nummererede og arkiveres med os. Prøverne blev indsamlet i sterile beholdere, der indeholder konserveringsmiddel-fri heparin (40 IE heparin /ml blod) i almindelig IMDM. Prøverne blev bragt til laboratoriet på isposer og blev forarbejdet til isolering mononukleære celler (MNC’er).

Isolering af MNC

navlestrengsblod MNC’er blev separeret ved Ficoll- hypaque gradient centrifugering. Cellerne ved interfasen blev opsamlet og vasket til fjernelse af Ficoll-hypaque. Kerneholdige celletal (Crystal violet farvning) blev taget, og de multinationale selskaber blev brugt til DC generation.

Isolering af T-celler fra perifert blod

Perifert blod blev opsamlet fra raske donorer efter institutionel revision bestyrelse. [Institutionel etiske komité (IEC) og Institutional udvalg for Stamcelleforskning (IC-SCRT)] -godkendte etiske retningslinjer, som er i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen. blev opnået en forudgående informeret skriftligt samtykke fra rask donor. Proceduren for godkendelse blev godkendt af IC-SCRT. De hårde kopier af de underskrevne samtykkeerklæringer er nummererede og arkiveres med os. T-celler blev isoleret fra blod ved hjælp af negativ selektion kit (Rosette Sep) som pr fremstilling instruktion (Stem Cell Technologies). Efter Ficoll- hypaque gradient centrifugering celler ved interfasen af ​​Ficoll og mellemstore blev indsamlet, vasket derefter anvendt i forsøgene.

In vitro

Generation og Kultur af DC’er

Udvidelse kulturer og plast vedhæftning.

multinationale selskaber (friske eller frosne) blev udvidet i 3 uger, så beriget med CD14 + celler af plast vedhæftning og efterfølgende differentieret som tidligere beskrevet [17], [20]. Kort fortalt, efter 21 dages ekspansion blev cellerne vasket og podet med en densitet på 3 × 10

5 celler /brønd i seks-brønds plade indeholdende 2 ml IMDM suppleret med 1% autologt plasma. Cellerne blev holdt i 1,5 time ved 37 ° C i 5% CO

2 inkubator og det ikke-klæbende og de løst adhærerende celler blev fjernet ved vask med IMDM. De adhærerende celler blev anvendt til DC generation

Differentiering af DC’er fra forstadier i tilstedeværelse af AA (AA

+ DC’er) og fravær af AA (AA

– DCS)..

precursor cellepopulationer blev inddelt i to sæt. Celler blev induceret til at differentiere som DC’er ved dyrkning deraf i GM-CSF (50 ng /ml) og IL-4 (30 ng /ml) i 3 dage, på dag 3

rd GM-CSF (50 ng /ml) plus TNF-α (30 ng /ml) blev sat til kulturer og længere opretholdes i 4 dage i IMDM suppleret med 5% autologt plasma. For at vurdere virkningen af ​​AA, blev ét sæt holdes kulturen med 100 pM af AA foruden ovennævnte betingelser. På dag 7 blev cellerne underkastet modning med en kombination af TNF-α, lipopolysaccharid, og CD40L, i en koncentration på 100 ng /ml hver, i 48 timer. Det eksperimentelle design er afbildet i form af et rutediagram Fig. S1. I alle eksperimenter udviklingslandene genereret uden AA blev betragtet som kontrol sæt og med AA blev betragtet som test sæt

Morfologisk analyse:.. Wrights og Giemsa farvning

De klæbede celler i kultur-plader blev fastsat i methanol i 10 minutter ved stuetemperatur og farvet med Wright og Giemsa Stain. Observationer blev foretaget under omvendt mikroskop og billeder blev taget (Olympus IX70)

Fænotypisk Analyse: Flowcytometri

Modne AA

+ og AA

– udviklingslandene blev vasket og suspenderet.. ved 2 × 10

5 celler i 100 pi kold phosphatpufret saltopløsning (PBS) og farvning blev udført som pr den beskrevne protokol [17], [20]. For CCR-7-farvning blev celler inkuberet med primære efterfulgt af sekundære og tertiære antistoffer i 25 minutter hver. Celler blev vasket to gange, efter hver antistofinkubationer og endelig resuspenderet i 1% paraformaldehyd. Celler blev analyseret på et flowcytometer (FACS Canto II fra BD Pharmingen- San Jose, California). Cellerester blev fjernet fra analysen ved anvendelse af en gate på fremadrettet og sideværts scatters, og de totale celler blev analyseret. Data blev analyseret og histogram overlays blev fremstillet ved anvendelse af computersoftware FACS Diva og Cell Quest Pro (vinke Dickinson San Jose Californien), hhv.

Funktionel karakterisering

Endocytose assay med FITC-dextran.

Umodne DC’er høstet på dag 5 blev inkuberet med FITC-dextran (20 ug /ml), enten ved + 4 ° C (internalisering kontrol) eller ved + 37 ° C, i 30 og 60 minutter. Cellerne blev derefter vasket tre gange med kold PBS indeholdende 0,01% natriumazid og 1% BSA. Cellerne blev re suspenderet i 1% paraformaldehyd og blev erhvervet på et flowcytometer (Canto II, BD).

kemotaksis.

Den kemotaksi af

in vitro

genererede DCs mod CCL-19 blev vurderet i 24-brønds cellekulturplader med BD Falcon

™ cellekultur 0,8 um skær. 500 pi IMDM med eller uden rhCCL-19 (slutkoncentration, 500 ng /ml) blev tilsat til det nederste kammer som pr beskrevne protokol [17], [20]. For at kontrollere specificiteten af ​​kemokinreceptoren (CCR) interaktion i nogle eksperimenter udviklingslandene blev forbehandlet med CCR-7 blokerende antistof i 1 time i 1 × PBS og derefter deres vandring mod CCL -19 blev undersøgt som beskrevet ovenfor. De migrerede celler blev farvet med trypanblåt, og levedygtige celler blev talt under anvendelse hæmocytometer. Resultaterne udtrykkes som det gennemsnitlige antal migrerende celler ± standardafvigelse (SD).

Blandet leukocytreaktion (MLR).

Allogene T-celler blev fordelt med 10

5 celler pr godt ind rundbundede 96-brønds mikroplader (Greiner Bio-One) og blev dyrket sammen i nærværelse af graduerede antal bestrålede DC’er (2500 rad, CO kilde) i 200 pi medium indeholdende 10% puljet navlestrengsblod AB + plasma. Thymidininkorporering blev målt på dag 3 efter en 18-timers puls med [

3H] thymidin (1 uCi /brønd) ved anvendelse af standardprocedurer [17], [20].

Cytokine måling.

Supernatanter fra

in vitro

genererede DC kulturer blev indsamlet på 48 timer efter tilsætning af modning stimuli og blev holdt frosset ved -20 ° C. Supernatanterne blev efterfølgende undersøgt for cytokin-indhold (IL-10 og IL-12 p70) ved ELISA under anvendelse af et ELISA-kit i henhold til fabrikantens anvisninger. Mængden af ​​interleukiner stede i supernatanterne blev beregnet ved standardkurve metode.

In vitro

CTL (cytotoksisk T-lymfocytter) assay

Udarbejdelse af cellelysat.

MCF-7 er en HLA-A2-begrænsede cellelinie og blev anvendt som målcellelinie i CTL assayet. Lyse af MCF-7-celler blev udført ved gentagne fryse optøning derefter efterfulgt af lydbehandling. Efter filtersterilisering protein estimering blev udført, og lysatet blev opbevaret ved -80 ° C for antigen pulsering på DCS.

Generering af effektorceller og CTL-assayet.

HLA-A2 positive ledning blod MNC’er blev anvendt til frembringelse DC’er. Umodne DC’er blev inkuberet med lysat af MCF-7 ved en slutkoncentration på 100 ug /ml protein sammen med KLH (Keyhole limpet hemocyanin) 25 ug /ml i 48 timer som modning stimuli i dyrkningsmediet for cross præsentation af tumorantigen til autologe naive T-celler. For kontrolgruppe af DC’er, modningen stimuli bestående af 100 ng /ml af hver af LPS, CD40L og TNF-α. De autologe naive T-celler blev opnået ved at sortere for CD3, CD8, og CD45RA-positive celler på FACS ARIA (BD). De naive T-celler blev co dyrket med MCF-7 lysat pulserede DC’er, der blev genereret fra den samme UCB prøve med eller uden AA. DC-T-celle-co kultur blev opretholdt i 3 uger med tilsætning af cytokiner IL-2 (0,1 ug /ml) og IL-7 (5 ug /ml) og ugentlig re stimulation med frisk antigen pulserede DC’er at generere effektor Cytotoksisk dræberceller . CTL’er således genereret fra LPS pulseret og lysat pulseret AA

+ DC’er /AA

– DC’er blev co dyrket med målcellerne MCF-7 i 18 timer. Celler blev derefter vasket med almindelig papir og derefter pulseret med [3H] thymidin i 8 timer. Procent drab på MCF-7 blev beregnet ved P-JAM assay [21], [22] ved hjælp af formulering% drab = CPM [Target alene – Target + Killer]. X 100 /CPM Target Alone

RT PCR-analyse

mRNA blev isoleret fra AA

+ DC’er og AA

– DC’er ved hjælp Dynabeads mRNA DIRECT kit i henhold til fabrikantens anvisninger. De eluerede mRNA blev revers transkriberet til cDNA ved anvendelse af revers transkriptase (Sigma Aldrich) og oligo-dT-primere (Invitrogen), som pr instruktionerne og PCR blev udført med specifikke primere. Den termiske cyklus blev anvendt, var (95 ° C i 2 min, 95 ° C i 45 sekunder, annealing (ifølge forskellige gener) i 45 sekunder, forlængelse 72 ° C i 2 min) i 35 cykler og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 5 minutter. Primersekvenserne anvendes, er beskrevet i fig. S2.

Homing af modne DC’er i NOD-SCID-mus

NOD /LtSZ-scid /SCID-mus blev opnået fra Jackson Laboratories og blev opdrættet i dyret facilitet i vores institut. Undersøgelsen blev udført overholde institutionens retningslinjer for dyrehold og er blevet godkendt af IAEC-NCC’erne /CPCSEA (Institutionel dyr komité-NCC’erne /udvalg til brug ved kontrol og tilsyn med dyreforsøg Godkendelsesnr:. IACUC-Institutional Animal Pleje og brug Udvalg, EAF-Experimental Animal Facility /2004 /B-71). Animal procedurer, som omfatter intravenøs infusion blev udført under anæstesi. Mus på 4-6 ugers alderen blev udsat for sub dødelig dosis på 300 rad kroppens samlede bestråling fra en

60Co kilde (Gamma Afdeling 5000, BRIT, Navi Mumbai, Indien). 10

6 AA

+ DC’er og AA

– DC’er blev infunderet gennem halevenen i sub letalt bestrålede mus (n = 43; infusion af AA

+ DC’er – 20 mus, AA

– DC’er – 20 mus og PBS – 3 mus). Mus blev aflivet efter 18 timer til at vurdere målsøgning af humane DC’er i knoglemarven. Homed celler blev identificeret som DC ved farvning med humant CD11 c mAb. Murin CD 45.1 mAb blev brugt til at ophæve tilstedeværelse celler murin oprindelse

Statistisk analyse

Forskellige variabler af AA

+ udviklingslandene og AA

-. DCs blev sammenlignet. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Sigma Stat (Version-2,03) og grafer blev fremstillet ved anvendelse af Sigma Plot software (version 10) (Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA) og GraphPad Prism 5 Software (San Diego, Californien, USA). Statistiske analyser af forskelle mellem de to grupper blev udført ved anvendelse af en t-test. Sandsynlighed værdi: p ≤ 0,05 (*), P≤0.01 (**) P≤0.001 (***) blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Morfologisk og fænotypisk karakterisering af udviklingslandenes

AA

+ udviklingslandene og AA

– udviklingslandene viser lignende morfologi

DC forstadier genereret efter 21 dages udvidelse af multinationale selskaber blev beriget af plast vedhæftning metode og yderligere differentieret som udviklingslandene [20].. Der var marginal forskel i det absolutte antal af DC’er der frembringes af de to metoder fra samme antal startpopulationen (ca. 3 x 10

7 AA

+ DC’er og 2,5 × 10

7 AA

– DC pr 10

7 input multinationale selskaber). Morfologi AA

+ DC og AA

– DCs var sammenlignelige. Det blev konstateret, at DC’er fra både sættene udviste den karakteristiske tilslørede morfologi og DC klynger; Fig. S3. Fasekontrast billeder viste typiske adhærente umodne DC’er, i begge sættene [S-3 (A)]. Efter tilsætning af modningen stimuli blev observeret typiske adhærente DC klynger i både kulturerne [S-3 (B)]. Wright-Giemsa farvning af modne vedhæftende celler viser tilstedeværelse af udviklingslandenes med dendritter i de to sæt [S-3 (C)]

AA

+ DC’er og AA

-. Udviklingslandene viser lignende DC fænotype.

In vitro

genererede DCs blev farvet for et panel af DC specifikke og DC tilknyttede markører og analyseret på flowcytometeret. Fig. 1A afbilder flowcytometrisk profil en repræsentativ prøve med procent positive celler og MFI-værdier i parentes. AA

+ DC’er og AA

– DC’er viste en høj og en tilsvarende procentdel af celler, der udtrykker forskellige costimulerende molekyler som CD40, CD80, CD86, DC-associeret integrin CD11c, adhæsionsmolekyler såsom CD54 og CD58, MHC klasse II-molekyler ligesom HLA ABC og HLA DR. Fig. 1B og 1C viser den fænotypiske profil med hensyn til procent positivitet og MFI henholdsvis tre prøver (gennemsnit ± SD, n = 3). Ekspressionen af ​​myeloid herkomst specifik markør CD 33 blev fundet signifikant højere på AA

+ DC’er (67,4%) sammenlignet med AA

– DC’er (38,7%) Fig. 1B. MFI-værdier af adhæsionsmolekyle CD 58 blev fundet signifikant højere på AA

+ DC’er (1423) sammenlignet med AA

– DC’er (1048) Fig. 1C. Tilsammen

AA

+ DC’er og AA – udviklingslandene viser lignende morfologi og typiske interstitiel DC fænotype

(A) FACS histogram profil af et repræsentativt forsøg.. Fyldte histogrammer viser isotypekontrol og åbne dem viser den specifikke fænotype med respektive MFI-værdier i parentes. (B) Det ses, at fuldt modne DC’er blev genereret, og der var ikke meget forskel i ekspressionsniveauerne af forskellige overflademarkører, undtagen CD33 (myeloid afstamning) var højere i AA

+ DC-apparater (gennemsnit ± SD, n = 3, p ≤ 0,05 *). (C) Søjlediagram for DC specifikke og associerede markører i form af MFI, for CD 58 (adhæsionsmolekyle) blev fundet forskellen signifikant højere (middelværdi ± SD, n = 3, p ≤ 0,05 *). (D) Receptor medieret antigen optagelse af AA

+ DC’er og AA

– DC’er: Dextran-FITC optagelse ved DC’er (n = 3, gennemsnit ± SD). Styringen værdi (optagelse ved 4 ° C) fratrækkes den respektive test værdi (optagelse ved 37 ° C).

Funktionel karakterisering af udviklingslandenes

Evnen til endocytose af AA

+ DC’er var højere sammenlignet med AA

-. DC’er

Umodne DC’er er karakteriseret ved evnen af ​​antigenoptagelse ved hjælp af forskellige mekanismer. Vi analyserede evnen af ​​

in vitro Salg genereret DC’er for deres receptor-medieret antigen optagelse ved måling af FITC mærkede dextran optagelse. AA

+ DC’er og AA

– DCs var lige effektive i receptor-medieret optagelse på 30 minutter og 60 minutter tidsintervaller testet. AA

+ udviklingslandene udstillet højt og sammenlignelige FITC-dextran optagelse i forhold til AA

– DCs Fig. 1D (middelværdi ± SD, n = 3).

In vitro

genererede DCs udstillet mere optagelse på 60 min interval i forhold til 30 min, der viser, at de er funktionelt aktive og udviser en øget optagelse med øget tid.

Forbedret

in vitro

kemotaksi af AA

+ DC’er mod CCL19.

migration af DC’er mod en chemokin gradient er en vigtig funktionel egenskab, fordi der i de immunterapi protokollerne, skal være i stand til migration fra injektionsstedet mod lymfeknuder, hvor de interagerer med T-cellerne og initierer immunreaktionen. Fig. 2A viser, at cellerne suspenderet i IMDM tilsat til det øvre kammer i brønd ved 0 timer. Ingen spontane migrering blev observeret i brøndene efter 3 timer, hvor CCL-19 ikke blev tilsat (Fig. 2B). Mere antal AA

+ DCs (figur 2D.) Migrerede mod CCL-19 i forhold til AA

– DCs (figur 2C.), Og forskellen var statistisk signifikant (* p ≤ 0,05, ** p≤0.01 n = 3;. figur 2E). Migration mod CCL19 er hovedsagelig fordi udviklingslandene udtrykker CCR7 receptor. Når vi farves udviklingslandenes af de to sæt for CCR-7-receptor antistof, AA

+ DC’er og AA

-. DCs viste 93,25% og 91,89% positive celler henholdsvis sammen med MFI-værdier i parentes (Fig 2F ). Mean MFI-værdier på 3 prøver til AA

– DCs var 821 ± 156 og AA

+ DCs var 1089 ± 392. Således begge sæt udstillet højt og sammenligneligt CCR7 udtryk. Specificiteten af ​​CCR7-CCL19 receptor ligand reaktion blev yderligere bekræftet ved at blokere receptoren med CCR-7 blokerer Ab og derefter teste migrerende evne. Som det ses i fig. 2G var der en signifikant reduktion i migrering af celler forbehandlet med blokerende antistof i de to kulturer. Migrationen af ​​testcellerne var igen signifikant højere end kontrol celler. Disse data viste, at tilsætning af AA under differentiering trin i udviklingslandene forbedrer deres vandrende evne.

Efter 3 timer (B) Ingen spontan migration blev observeret i brøndene, hvor CCL-19 ikke blev tilsat. Mindre nej. AA

– DCs (C) migrerede mod CCL-19 end AA

+ DCs (D). (E) AA

+ DC’er viste statistisk effektiv vandring mod CCL-19 sammenlignet med AA

– DC’er (n = 3, gennemsnit ± SD). (F) FACS histogram profil af et repræsentativt forsøg, der viser ekspression af kemokinreceptor CCR-7 sammen med MFI-værdier i parentes. Fyldte histogrammer viser isotypekontrol og åbne dem viser den specifikke fænotype. (G) Blokering med CCR-7 Ab medfører væsentlig reduktion i migrering af både AA

+ DC’er og AA

– DC’er (n = 3, gennemsnit ± SD). [P ≤ 0,05 (*), P≤0.01 (**) P≤0.001 (***)].

AA

+ DC’er, udstillet overlegen T-celle stimulerende funktion.

DC’er er karakteriseret ved deres evne til at stimulere allogene T-celler . Denne evne blev vurderet ved MLR. MLR blev udført ved at blande AA

+ DC’er og AA

– DC’er med allogene T-celler fra perifert blod i forskellige forhold. Triplikater blev taget for hver afprøvet koncentration. Proliferation af T-celler blev målt ved thymidinoptagelse assay som beskrevet i fremgangsmåder. Data fra fig. 3 (gennemsnit ± SD, n = 3) viser, at AA

+ DC’er har højere allostimulerende kapacitet. Forskellene var statistisk signifikante ved fire ud af seks DC: T-celle-forhold testet. På 1:10 ratio, thymidin i AA

+ var højere end AA

-. Sæt

AA

+ DCs viste bedre T-celle stimulation end AA

– DC forskelle var signifikante ved fire ud af seks DC: T-celle testede nøgletal (* p ≤ 0,05, ** P≤0.01). Repræsentative data fra tre uafhængige forsøg er vist. TdR = thymidin.

Cytokine Profil af AA + DC’er er mere gunstige for adoptiv immunterapi.

IL-12 ikke kun signaler til udvikling af effektorfunktioner i T-celler, men også programmer for celler til at overleve som funktionelle hukommelsesceller [23].

In vitro

genererede DC’er var stand til at udskille et højt niveau af IL-12 p70 og et lavt niveau af IL-10. AA

+ DC’er viste en bedre IL-12 p70-sekretion profil sammenlignet med AA

– DC’er (. Figur 4). AA

– DC’er på anden side havde et højere niveau af IL-10-sekretion sammenlignet med den for AA

+ DC’er (n = 3). Forholdet IL12 /IL10 var højere i AA

+ DC’er som vist i fig. S4. Disse observationer antyder, at AA

+ DC’er har en bedre Th1 gunstig cytokinprofil i forhold til AA

– DC’er, hvilket gør dem et bedre valg for klinisk anvendelse Salg

Resultaterne viser, at DC’er genereres af begge. dyrkningsbetingelser var i stand til sekretion af IL-12 p70 og IL-10. (A) AA

+ DCs viste en bedre IL-12 p70 sekretion i forhold til AA

– DC’er. (B) På lignende måde AA

+ DC’er har lavt niveau af IL-10-sekretion profil sammenlignet med AA

– DC’er. Dataene i tre uafhængige prøver er vist (n = 3, gennemsnit ± SD). [P ≤ 0,05 (*), P≤0.01 (**) P≤0.001 (***)].

AA

+ udviklingslandene demonstrerer højere

in vitro

CTL-aktivitet

5A afbilder CTL data fra en repræsentativ prøve. Det ses tydeligt, at AA

+ DC’er er mere effektive til effektorfunktion af T-celler dvs. bevirke drab af MCF-7-celler i CTL-assayet sammenlignet med AA

– DC’er. Drabet er betydeligt højere ved fire forhold af effektor target cellekoncentrationer. De to andre prøver viste også lignende tendens (fig. S5). CTL’er afledt fra AA

+ DC’er udviste en forbedret effektorfunktion dvs. forbedret samlet drab sammenlignet med CTL’er afledt fra AA

– DC’er. For den negative kontrol sæt, AA

+ DC’er og AA

– DC’er sæt blev modnet med LPS, TNF-α og CD40L [20]. Den således frembragte CTL’er var ikke effektivt dræber målet MCF-7-cellelinje. Ingen drab blev set i en af ​​disse sæt (data ikke vist). Som en yderligere negativ kontrol for target specificitet, CTL opnået fra MCF-7 lysat primet DCs blev brugt i CTL assay mod H1299 cellelinie, men ingen dræbende effekt blev set i disse sæt samt (CPM værdier for thymidin i tilfælde af kontrol var 12649,33 ± 30,73 SD. for pulserende og unpulsed gruppe på højeste mål til T-celle-forhold var 12405,66 ± 36,35 SD og 12537,33 ± 27,47 SD henholdsvis).

(A) CTL data fra et repræsentativt eksemplar dvs drab på målet ( MCF-7) celler ved CTL’er genereret af AA

+ DC’er /AA

– DC’er pulseret med MCF-7-cellelysat. CTL’er afledt fra AA

+ DC’er udviste en forbedret effektorfunktion dvs. forbedret samlet drab sammenlignet med CTL’er afledt fra AA

– DC’er. Drabet er betydeligt højere ved fire forhold af effektor target cellekoncentrationer. (* P ≤ 0,05, ** P≤0.01, *** P≤0.001). (B) Genekspressionsprofil af tre centrale enzymer forbundet med AA pathway sammen med husholdning genet GAPDH. Der er en betydelig opregulering af udskrift niveau af centrale enzym COX-2 i udviklingslandene dyrket i tilstedeværelse af AA.

De mRNA niveauer af vigtige enzymer involveret i AA stofskifte er højere i AA

+ DC’er

Transcript niveauer af tre enzymer associeret med arachidonsyre vej, såsom COX-1, COX-2, PLA

2, blev detekteret ved RT-PCR udført som pr standardmetoder. Gelbilleder af RT-PCR er vist i fig. 5B. Fig.