PLoS ONE: DNA-methylering Biomarkører Forudsige Progression-Free og samlet overlevelse af metastatisk renalcellecarcinom (mRCC) behandlet med Antiangiogenisk Therapies

Abstrakt

VEGF-målrettet terapi stiger både den progressionsfri (PFS) og samlet overlevelse (OS), i patienter med metastaseret nyrecellecancer (mRCC). Identifikation af molekylære fænotyper af RCC kunne forbedre risiko lagdeling og forudsigelsen af ​​det kliniske sygdomsforløb. Vi undersøgte, om gen-specifik DNA hypermethylering kan forudsige PFS og OS blandt patienter, der gennemgår anti-VEGF-baseret behandling. Primær tumorvæv fra 18 patienter, der fik målrettet terapi blev undersøgt retrospektivt ved hjælp kvantitativ methylering-specifikke PCR-analyse af

CST6

,

LAD1

, hsa-

miR

-124-3, og hsa-

miR-

9-1 CpG øer. PFS og OS blev analyseret for first-line og sekventielle antiangiogene terapier ved hjælp af log rang statistik. Følsomhed og specificitet blev bestemt til forudsigelse af første-linje-behandling fiasko. Hypermethylering af

CST6

og

LAD1

var forbundet med både en forkortet PFS (log rank p = 0,009 og p = 0,004) og OS (p = 0,011 og p = 0,043). Den mediane PFS observeret for høje og lave methylering grupper af

CST6

og

LAD1

var 2,0 vs.11.4 måneder.

LAD1

methylering havde en specificitet på 1,0 (95% CI 0,65 til 1,0) og en følsomhed på 0,73 (95% CI 0,43 til 0,90) til forudsigelse af første-linje-behandling.

CST6

og

LAD1

methylering er kandidat epigenetiske biomarkører, der viser hidtil uset samarbejde med PFS og OS samt specificitet for forudsigelse af respons på behandlingen. bør overvejes DNA methylering markører for den kommende evaluering af større patientkohorter i fremtidige undersøgelser

Henvisning:. Peters I, Dubrowinskaja N, Abbas M, Seidel C, Kogosov M, Scherer R, et al. (2014) DNA-methylering Biomarkører Forudsige Progression-Free og samlet overlevelse af metastatisk renalcellecarcinom (mRCC) behandlet med antiangiogeniske terapier. PLoS ONE 9 (3): e91440. doi: 10,1371 /journal.pone.0091440

Redaktør: Dong Zhang, Nanjing Medical University, Kina

Modtaget: 7. oktober, 2013; Accepteret: 11 Februar 2014; Udgivet: 14. marts 2014

Copyright: © 2014 Peters et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Nedsat celle kræft (RCC) er en af ​​de. top ti årsager til kræftdødsfald i industrielle lande [1]. Selvom seneste forbedringer i målrettet terapi har resulteret i forlænget overlevelse af patienter med metastatisk RCC (mRCC), det samlede resultat er stadig fattige [2], [3].

På grund af forskellige tilgængelige forbindelser og et stigende antal nye agenter påvirker molekylært målrettede strukturer, såsom vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) og pattedyr mål for rapamycin (mTOR) signalering [4] en optimal sekvens af målrettede behandlinger kan findes for patienter, hvilket potentielt kan øge overlevelsen med mRCC behandling. Selvom prognostiske modeller, såsom MSKCC (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) og Heng lave systemer, er blevet rapporteret til at være uafhængige prædiktorer af kliniske resultater, [5], [6] forskelsbehandling af resultater er stadig begrænsede. Tumor-specifikke biologisk baserede parametre er blevet foreslået for at forbedre disse spørgsmål [7].

De fleste RCCS har klar celle (ccRCC) histologi og udviser funktionel inaktivering af von Hippel-Lindau (

VHL

) -gen skyldes mutationer eller epigenetisk inaktivering i ca. 80% af tumorer [8], [9]. Men den progressionsfri (PFS) og samlet overlevelse (OS) af patienterne med mRCC er uafhængige af tabet af

VHL

funktion [10]. I modsætning hertil blod-baseret analyse af enkelte nukleotid polymorfier (SNP) potentielt påvirker sunitinib målgener og ligander identificeret to polymorfier i

VEGFR3 Hoteller, som er forbundet med PFS, men ikke OS, af patienter, der målrettet terapi [11 ]. Måling af serum kulsyreanhydrase IX (CA9) protein niveauer i metastatiske ccRCC patienter afslørede signifikant nedsat OS blandt patienter med højere CA9 serumkoncentrationer [12]. En individuel fordel af vævs- eller blod-baserede målinger for patienter, der gennemgår terapi er mærkbar, men nøjagtigheden, følsomhed og specificitet af disse metoder er endnu ikke blevet indberettet eller valideret [13].

Selvom store patientkohorter har været udsat for exom hele mutationsanalyser, kun et begrænset antal andre end gener

VHL

polybromo 1 (

PBRM1

) er blevet identificeret til at have mutationer i RCC, og de fleste med lav frekvens [14]. Derfor er den begrænsede antal hyppigt muterede gener reducerer sandsynligheden for at identificere mutation-baserede prædiktorer med passende følsomhed og specificitet. DNA methylering af CpG øer (CGI’er) i et betydeligt antal regulatoriske eller tumorsuppressorgener er blevet identificeret som en funktionel surrogat af mutationer og er blevet rapporteret til at være en hyppig begivenhed i RCC [15]. Desuden funktionelt tab af

VHL

er fundet, at associere med en udvidelse af udseende epigenetiske ændringer [16], og alle de anden-hyppige mutationer er relateret til ændret kromatin /histon stabilisering eller ændring, mekanismer knyttet til CGI methylering og genekspression [17]. Derfor er den hyppige påvisning af epigenetiske ændringer i RCC adskiller RCC tumor biologi og giver kandidater til nye diagnostiske, prognostiske eller prædiktive markører [18]. CGI-methylering i adskillige gener er allerede blevet identificeret som mulige prognosticators uafhængigt af klinisk-patologiske parametre [19] – [21]. Men epigenetiske biomarkører forudsige det kliniske forløb af MRCC patienter udsat for målrettet terapi, har, til vores bedste viden, ikke blevet rapporteret.

Vi antager, at CGI methylering er relateret til respons på behandlingen, samt som overlevelsen af ​​MRCC patienter, der gennemgår antiangiogenisk terapi. Vi undersøgte fire kandidatgener, hvoraf tre, cystatin E /M (

CST6

) og mikro RNA-gener

miR-9-1

miR-124-3,

blev identificeret for nylig med tumor-specifikke CGI hypermethylering og en mulig sammenhæng med prognosen for RCC patienter [19], [21], [22]. Den Ladinin 1 (

LAD1

) genet blev identificeret for nylig ved vores gruppe som en ny kandidat methylering markør i RCC viser univariat association med negative klinisk-patologiske parametre som tumor kvalitet, lymfeknude metastaser, status for særskilte metastaser og fremskreden sygdom (upublicerede data).

LAD1

koder en forankring filament protein, en komponent af basalmembranen, der sandsynligvis bidrager til stabiliteten af ​​epitel-mesenkymale interaktion [23].

den foreliggende undersøgelse undersøgt, om en DNA-methylering mærke kan forudsige respons målrettet antiangiogenisk terapi af MRCC patienterne og beskriver identifikation af to DNA methylering markører i

CST6

og

LAD1

CGI’er som kandidat epigenetiske prædiktorer for PFS og OS af MRCC patienter, der gennemgår målrettet terapi.

Materialer og metoder

etik Erklæring

informeret samtykke blev opnået fra hver patient, og de lokale etik udvalg (Etik Udvalg Prof. HD Tröger, Hannover Medical School, Carl-Neuberg-Str. 1, Hannover, Tyskland; Study_No: 1213-2011) specifikt godkendt denne undersøgelse. Patienterne er aftalt i en skriftlig form for udnyttelse af vævsprøve til grundforskning. En skriftlig redegørelse for vores etik udvalg til denne undersøgelse blev opnået.

Patient Karakteristika og behandlingsregimer

klinisk-patologisk data svarende væv, og opfølgende data, herunder PFS og OS af patienter med mRCC som blev behandlet med første-line VEGF-målrettet terapi blev indsamlet mellem november 2005 og oktober 2011 i klinikken of Hematology og Institut for urologi og Urologic onkologi ved Hannover Medical School (tabel 1). Den MSKCC score eller ECOG performance status var ikke tilgængelig. Patienterne fik følgende behandlingsregimer i første linje indstilling: sunitinib (n = 12, 67%), sorafenib (n = 4, 22%), axitinib (n = 1, 5,5%), og bevacizumab (n = 1, 5,5%).

PFS blev defineret som tiden fra begyndelsen af ​​den første dag i systemisk terapi til påvisning af en progressiv begivenhed i henhold til RECIST 1.1 kriterierne på en computer tomografi (CT) scanning [ ,,,0],24]. OS blev defineret som perioden fra den første dag i systemisk terapi indtil patientens død eller censureret i sidste opfølgning. Endestationen “ikke kunne vurderes” i tabel 1 beskriver patienter med en PFS 2 måneder på grund af en tidlig ophør af behandlingen forårsaget af toksicitet eller tidlig død, før den første anbefalede CT-scanning efter behandlingen blev påbegyndt. Den oprindelige TNM klassifikation af primære tumorer blev evalueret i henhold til Union for International Cancer Control 2002 klassifikationen [25]. Patient opfølgning inkluderet op til tre sekvens ændringer i terapi regime.

Udtrykkene’prognostic` og’predictivè blev anvendt i overensstemmelse med definitionen af ​​National Cancer Institute [26].

vævsprøver, Isolation og Bisulfite Konvertering af tumor DNA

Uafhængig styring af histopatologi, tumor indhold af rutinemæssige patologiske prøver celle, og udvælgelsen af ​​vævs- områder for væv udvinding blev bestemt ved patologen. Efterfølgende blev cylindre 1,5 mm i længde og 2 mm i højden udstanset fra formalinfikserede og paraffinindlejrede (FFPE) vævsblokke under anvendelse af en 18 Charrière core stempel og udsættes for DNA-isolering. Genomisk DNA blev ekstraheret ved hjælp af den automatiserede Magna Pure LC 2,0-system og Magna Pure LC DNA isolation kit II – væv (Roche Diagnostics Deutschland, Roche Applied Science, Mannheim, Tyskland). Kvaliteten af ​​ekstraheret DNA blev vurderet ved anvendelse af spektrofotometri, gelelektroforese og kvantitativ PCR, som karakteriserede udbytte, renhed og kvalitet af nedbrydning af isoleret DNA. Omdannelse med bisulfit af DNA blev udført under anvendelse af EZ DNA-methylering-Gold Kit (Zymo Research Corporation, Irvine CA, USA) og 1 ug isoleret DNA. Fuldt methyleret og omdannet DNA, såvel som ikke-methylerede bisulfit omdannede DNA kontroller, blev anvendt som tidligere rapporteret [21].

Kvantitativ Methylering-realtids-PCR-analyse

Kvantitativ realtid fluorimetriske 5 ‘exonuklease PCR (qMSP) analyser blev udført for at kvantificere CGI methylering niveauer af

CST6, LAD1,

HSA

-miR-124-3,

hsa-

miR- 9-1

. Methylering analyse af HSA

-miR-124-3

blev udført som tidligere [21] beskrevne. qMSP systemer blev etableret for

CST6, LAD1,

hsa-

miR-9-1

hjælp Beacon Designer software (PREMIER Biosoft, Palo Alto CA, USA). Basen positioner undersøgte CGI sites for

CST6, LAD1,

HSA

-miR-124-3,

hsa-

miR-9-1

er vist i tabel 2. basen positioner refererer til USCS Genome Browser [27]. De qMSP systemer blev karakteriseret som beskrevet for HSA

-miR-124-3

methylering målinger [21]. Duplikere realtid PCR’er blev udført på en ABI 7900HT (Life Technologies, Foster City, USA) i 384-brønds plader som tidligere [21] beskrevne. Eksperimentatorer blev blindet til den histopatologiske og kliniske status af prøverne. Relative methylering niveauer blev beregnet som en analog til ΔΔCt metode ved at normalisere forskellen i CGI methylering bestemt ved påvisning i realtid og uafhængige målinger intern kontrol til den tilsvarende forskel i fuldt methylerede DNA kontrolprøver som tidligere beskrevet [21], [28 ].

Statistisk Analyse af Survival

Kaplan-Meier-kurver blev brugt til at præsentere relative overlevelse i PFS og OS analyser efter dichotomization af tumorer i høje og lave methylering fænotyper. Den mediane overlevelse og tilsvarende 95% konfidensintervaller (CIS) blev rapporteret. Forskelle i PFS og OS blev testet ved hjælp af log-rank statistik og median overlevelse nøgletal beregnet.

P

-værdier 0,05 blev anset for signifikante. For at muliggøre en sammenligning med litteraturen, blev univariate Cox regressionsanalyser udført for at estimere hazard ratio (timer). For at beregne sensitivitet og specificitet for manglende terapi blev en PFS afskæringsværdi på 6 måneder, der anvendes til dichotomization [29] i terapi respondere og non-respondere.

zonekort og modtager opererer karakteristiske kurver blev konstrueret ved hjælp af heatmap2 og ROCR funktion i R-pakken (version 2.11.0.1) med en standard klyngedannelse algoritme og gplot pakke [30].

Resultater

Bimodal Fordeling af relative methylering Niveauer i CGI’er af kandidatgener

Kvantitative methylering analyser af CGI’er af

CST6

,

LAD1

, hsa-

miR-124-3,

hsa-

miR -9-1

afslørede tilstedeværelsen af ​​en bimodal fordeling af relative methylering værdier (figur 1A og D; data ikke vist for hsa-

miR-124-3

hsa-

miR-9 -1

). Påføring af en enkelt cutoff på 0,02% (svarende til -8,75 i LN-skala, der anvendes til Kernel density plots i figur 1A og D) til relativ methylering, høj og lav methylerede epigenotypes blev ensartet kendetegnet for alle de analyserede gener og anvendes til konsekvent dichotomization i overlevelse analyser.

A og D. istribution af de relative methylering værdier

CST6 Hotel (A) og

LAD1

(D) i MRCC-patienter. En cutoff værdi præsenteres for dichotomization. B og E. Kaplan-Meier afbildninger af progressionsfri overlevelse MRCC patienter dikotomiseret af høj og lav methylering af

CST6

(B) og

LAD1

(E). C og F Kaplan-Meier-kurver over den samlede overlevelse MRCC patienter dikotomiseret af høj og lav methylering af

CST6

(C) og

LAD1

(F).

analyse af PFS

Kaplan-Meier og log rank analyse af PFS i høje og lave methylerede tumorer viste en signifikant forskel for både

CST6

og

LAD1

. Høj methylering var forbundet med en median overlevelse på 2,0 måneder, sammenlignet med 11,4 måneder hos patienter med lav methylering (p = 0,009 og p = 0,004, tabel 3A). I modsætning hertil hverken

miR-124-3

heller

miR-9-1

viste en statistisk sammenhæng med PFS (p = 0,339 og p = 0,319).

analyse af OS

Kaplan-Meier analyse og log rank statistik viste, at høj methylering af

CST6

og

LAD1

var forbundet med nedsat OS. En median OS på 22,9 og 3,4 måneder (p = 0,011, tabel 3B) blev opnået for lav og høj

CST6

methylering hhv. En median OS på 16,4 og 3,4 måneder (p = 0,043, tabel 3B) blev opnået for lav og høj

LAD1

methylering.

Analyse af sensitivitet og specificitet

For at bestemme følsomhed og specificitet af

CST6

og

LAD1

methylering analyser til forudsigelse af first-line behandling fiasko, blev methylering værdier dikotomiseret i lave og høje methylering fænotyper ved hjælp af den samme cutoff på 0,02%, som angivet over. PFS værdier blev dikotomiseret anvendelse af en afskæring på 6 måneder, en parameter, der tidligere blev foreslået bedre skelne mellem terapi respondere og non-respondere [29]. Høj methylering af

LAD1

og

CST6

var karakteristisk for mislykkedes terapi (figur 2A). I tilfælde af

LAD1,

alle otte patienter med forhøjet methylering var non-respondere. Specificiteten var 1,0 (95% CI 0,65 til 1,0) og følsomhed 0,73 (95% CI 0,43-0,90) til påvisning af svigt behandling med

LAD1

methylering (tabel 4), mens specificiteten var 0,86 (95 % CI 0,49-0,97) og følsomhed 0,82 (95% CI 0,52-0,95) for

CST6

methylering (tabel 4).

A. Heat kort over normaliserede relative methylering værdier (naturlig logaritme) påvist i

LAD1

,

CST6

,

miR-9-1,

miR-124-3

CGI’er for hver patient. Lav til høj methylering værdier kodet som violet (lav) til røde (høje) nuancer. De stiplede og fuldt optrukne linier beskriver median og individuelle methylering værdier hhv. Patientnumre givet på venstre svarer til nummereringen vist i tabel 1. Terapi respons (0) og manglende behandling (1) er angivet for hver patient til højre. Især alle patienterne (nr. 1-8), der udviser høj methylering af

LAD1

og 9 af 10 patienter (nr. 1-9, 14) udviser høj methylering (rød farvet) af

CST6

var en del af den ikke-responder (1) gruppe. B. Modtageren opererer egenskaber (ROC) kurver illustrerede diskrimination af methylering målinger og arealet under kurven (AUC) viser, at selv med vores lille patient kohorte, et robust resultat for rigtigheden af ​​begge methylering markører (AUC

CST6

= 0,88 og kan påvises AUC

LAD1

= 0,90). Følsomheden (sand positiv rate) er afsat mod en-specificitet (falsk positiv rate).

Diskussion

De kliniske resultater af patienter med mRCC har forbedret siden VEGF målrettede behandlinger og mTOR-hæmmere blev stillet til rådighed [2], [3]. stratificering af patienter, som bruger biomarkører, kan imidlertid tillade en bedre forståelse af lægemiddelresistens og identificere en optimeret patient-specifikke sekvens af antiangiogene terapier, forbedre individuel overlevelse [7]. Desuden kan minimeres bivirkninger af anti-VEGF-baserede regimer, såsom diarré, udslæt, hand-foot syndrome, hypertension og asteni, som ofte alvorligt forringer livskvaliteten under behandlingen.

Vi fandt at DNA hypermethylering af

CST6

og

LAD1

i primær RCC tumorvæv er signifikant associeret med PFS for patienter, der får anti-VEGF-baserede medicin som en første-linje-behandling og også OS af patienter sekventielt behandlet med anti-VEGF målrettede lægemidler og mTOR-hæmmere i anden og tredje linie behandling. Vores methylering markører forudsagde terapi fiasko med høj specificitet og god følsomhed.

Så vidt vi ved, disse resultater er uden fortilfælde i flere henseender, da tidligere undersøgelser ikke var væv baserede og enten gav ingen signifikant sammenhæng med terapi svar [12] eller rapporteres kun begrænset statistisk styrke [11]. Mens serum målinger af CA9 niveauer afslørede ingen signifikante forskelle mellem terapi respondere og non-respondere [12] analyse af genetiske varianter, eventuelt i samspil med sunitinib vej, identificeret to

VEGFR3

SNPs at være forbundet med terapi respons og PFS, men ikke med OS [11]. Denne undersøgelse viser, at de enkelte biologiske variabler kan påvirke respons på behandlingen. På den anden side, vores methylering baseret kandidat prædiktorer går ud over målingen af ​​genvarianter i flere vigtige aspekter. Først, den potentielle

LAD1

og

CST6

DNA methylering baseret markører blev målt i tumorceller, og som direkte udviser tumor egenskaber, som kan repræsentere førere af resistens og biologisk aggressivitet. Hypermethylering af

CST6

og

LAD1

udstillet prognostisk og prædiktiv værdi i vores undersøgelse og er en formodet biomarkør for patient udvælgelse. Baseret på de kliniske resultater i vores undersøgelse, vil forskellige terapeutiske strategier for hypermethyleret tumorer være påkrævet. Efter netværket af epigenetiske ændringer og biologiske adfærd har været untangled, kan identificeres yderligere nye mål for terapeutiske indgreb.

Om forskellen i epigenetiske vævs- og genetiske blod-baserede målinger tegner sig for både epigenetiske markører er relateret til PFS og OS af MRCC patienter er et interessant spørgsmål. Genvarianter blev kun forbundet med PFS, et surrogat endpoint for overlevelse målinger i mRCC der har eventuelle begrænsninger [31]. Så vidt vi ved, er et væv-baseret molekylær markør er ikke tidligere blevet associeret med OS. Fra et statistisk synspunkt, vores epigenetisk undersøgelse leveret højere HRs i overlevelse analyser og forudsat en mere afbalanceret klassificering i respondere og non-respondere end den undersøgelse, som Garcia-Donas et al. [11], og derfor tilsammen bidrager til en højere magt med denne undersøgelse. I betragtning af at et meget mindre kohorte patient var tilgængelig for vores målinger, vores resultater viser, at en stærk virkning muligvis er blevet identificeret. Desuden i betragtning af at der kan anvendes et stigende antal midler til behandling af mRCC kunne fremtidig identifikation af en optimal terapi regimen lettes ved epigenetiske markører, der tillader en god udskillelse af patienter i respondere og non-respondere.

Interessant, methylering niveauer af alle kandidat markører klart henfaldet til let skelnelige høje og lave methylering grupper, hvilket eliminerer behovet for at vilkårligt definere cutoff point for dichotomization. Derfor fandtes stort set ingen overlapning mellem respondenter og ikke-respondenter i denne undersøgelse. Således vores

LAD1

og

CST6

methylering analyser givet høje særlige forhold 1,0 og 0,86 til påvisning af fiasko terapi, hvilket understreger den mulige relevans af disse markører i mRCC.

Dette undersøgelsen kan også besvare, om DNA-methylering-baserede prognosticators repræsenterer passende indikatorer for sygdom. Begge

miR-9-1

miR-124-3

[21], [22] mislykkedes som prædiktorer fordi ingen sammenhæng blev fundet med PFS eller OS af patienter, der gennemgår terapi. Dette resultat kan forklares med, at MRCC patienter generelt står over for en dårlig prognose, og mange tumorer udviser høj methylering for

mir

gener som forventes for kandidat prognosticators.

uafhængighed fra kliniske eller laboratorieparametre kunne ikke bestemmes i nærværende undersøgelse, fordi de lave tal prøve forhindrede multivariat analyse. Tilsvarende kunne de relevante spørgsmål, om markører kombineres for at optimere forudsigelseskraft eller om markører udviser overflødige oplysninger kan kun besvares i fremtidige undersøgelser ved brug af forstørrede undersøgelse kohorter.

Men de observerede kliniske parametre for HRs patient resultat var lavere med begrænset nøjagtighed /diskriminerende magt. Vores resultater kræver bekræftelse i en uafhængig validering undersøgelse, herunder overvejelse af kliniske scoringssystemer som konfoundere.

Som konklusion, vores undersøgelse identificeret

LAD1

og

CST6

CGI methylering som to epigenetiske markører, der er forbundet med PFS og OS af MRCC patienter, der gennemgår antiangiogenisk terapi. Vi har også vist potentiale til at forbedre den molekylære forudsigelse af respons på behandlingen. Vores resultater understreger yderligere den opfattelse, at epigenetisk ændrede RCCS eksisterer, og nye specifikke strategier kan være nødvendigt at behandle patienter med sådanne tumorer.

Tak

Vi takker Margrit Hepke og Christel Reese til teknisk bistand.