PLoS ONE: Pathway-Specific Engineered Mouse allograft modeller Funktionelt rekapitulere Menneskelig serøs epithelial æggestokkene Cancer

Abstrakt

Den høje dødelighed fra ovariecancer kan tilskrives sene diagnose og mangel på effektiv behandling. Trods enorm indsats for at udvikle mere målrettede behandlinger, platinbaseret kemoterapi stadig standarden for pleje af patienter med ovariecancer, og modstanden sker i et højt tempo. En af de hastighedsbegrænsende faktorer til oversættelse af nye lægemiddelkandidater opdagelser til kliniske behandlinger har været manglen på egnede prækliniske kræftmodeller med høj prædiktiv værdi. Vi har tidligere genereret gensplejset mus (GEM) modeller baseret på forstyrrelse af

TP53

Rb

med eller uden

BRCA1

eller

BRCA2 Hoteller, som udvikler serøs epitelial ovariecancer (SEOC) ligner den menneskelige sygdom på histologiske og molekylære niveau. Her beskriver vi en tilpasning af disse GEM modeller til ortotopisk allotransplantater der ensartet udvikle svulster med kort ventetid og er ideelle til rutinemæssige prækliniske undersøgelser. Ovarietumorer mangelfulde i

BRCA1

reagerer på behandling med cisplatin og olaparib, et PARP-hæmmer, mens

BRCA1

-Wild typen tumorer er ikke-lydhøre over for behandling, den gentog de relative følsomheder observeret hos patienter. Disse musemodeller giver mulighed for evaluering af effektive lægemidler, herunder forudsigelse af differentierede reaktioner i

BRCA1

-Wild type og

BRCA1

deficiente tumorer og udvikling af relevante biomarkører.

Henvisning: Szabova L, Bupp S, Kamal M, Householder DB, Hernandez L, Schlömer JJ, et al. (2014) Pathway-Specifikke Engineered Mouse allograft modeller Funktionelt rekapitulere Menneskelig serøs epithelial kræft i æggestokkene. PLoS ONE 9 (4): e95649. doi: 10,1371 /journal.pone.0095649

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Modtaget: 10. februar, 2014 Accepteret: 28 mar 2014; Udgivet: 18 April, 2014

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Dette projekt er finansieret helt med føderale midler fra National Cancer Institute, National Institutes of Health, under kontrakt nummer HHSN261200800001E. Indholdet af denne publikation afspejler ikke nødvendigvis synspunkter eller politik Department of Health og Human Services, heller ikke nævner af firmanavne, kommercielle produkter, eller organisationer indebærer godkendelse af den amerikanske regering. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den anden mest almindelige gynækologisk kræft og den hyppigste årsag til gynækologisk cancer dødsfald i USA [1], med over 50% viser sig som serøs epitelial ovariecancer (SEOC). De fleste avancerede SEOCs har spredt sig ud over æggestokkene på tidspunktet for diagnosen, og deres ledelse involverer kirurgisk de-bulking, efterfulgt af kemoterapi med en kombination af platin og taxanlægemidler [2], [3]. Trods oprindeligt høje svarprocenter, de fleste patienter tilbagefald med en median progressionsfri overlevelse på 18 måneder [4], hvilket gør søgningen efter nye lægemidler tvingende.

I løbet af de sidste mange år er der gjort store fremskridt med at identificere adelsmærke genetiske læsioner forbundet med SEOC. Den Cancer Genome Atlas (TCGA) undersøgelse af en stor høj kvalitet SEOC kohorte viste, at mutationer i

TP53

domineret, der forekommer i mindst 96% af tumorer [5]. Ændringer i RB-netværket blev observeret i 67% af tilfældene, og omkring 20% ​​af tumorer havde kønsceller eller somatiske mutationer i

BRCA1 /2

med en ekstra 11% har mistet BRCA1 udtryk gennem epigenetisk inaktivering [5] .

BRCA1 og BRCA2 spiller vigtige roller i homolog rekombination (HR), og tab af enten protein fører til mangel i dobbeltstrenget DNA brud (DSB) reparation [6]. I HR-deficiente celler, der DSB’er repareret af fejlbehæftede mekanismer, som kan føre til genomisk ustabilitet. Kemisk inhibering af enkeltstrenget (ss) DNA break reparation i HR-deficiente celler kan føre til syntetisk letalitet på grund af den samtidige fravær af to DNA-reparationsveje [7], [8]. I klinikken, er poly (ADP) -ribose polymerase inhibitorer (PARPi) undergår evaluering som en metode til at udnytte syntetisk letalitet for terapeutisk intervention. PARP-1 er nødvendig for identifikation af ssDNA pauser (SSB) og rekruttering af reparations- proteiner til beskadigede steder [9]. Inhibering af denne proces i BRCA-deficiente celler fører til ophobning af DSBs, grundet sammenklappede replikationsforgreninger, og i sidste ende til celledød [10] – [12]. Baseret på disse resultater, har PARPi blevet testet i kliniske forsøg som en enkelt eller kombinationsterapier hos patienter med fremskredne faste tumorer [13] – [15]. For nylig, oralt aktiv PARPi, olaparib (AZD2281) viste klinisk antitumoraktivitet i BRCA-associeret æggestokkene og brystkræft [15] – [19].

Indtil nu kliniske forsøg med nye terapeutiske agenter har påberåbt sig prækliniske undersøgelser udført i cellelinier og immunkompromitterede cellelinje xenograftmodeller. Efterfølgende høje fejlrater i menneskelige forsøg tyder på behov for prækliniske modeller med bedre prædiktiv værdi [20]. Gensplejsede musemodeller (GEMMs) har vigtige fordele i forhold cellelinje xenograftmodeller, idet tumorerne er drevet af definerede genetiske begivenheder og opstår på grund af ophobning af yderligere stokastiske hændelser inden orglet af interesse og er derfor underlagt relevant mikromiljø og vært celle responser. Flere epitelial ovariecancer GEMMs der udvikler tumorer ligner human sygdom er blevet rapporteret [21] – [25]; dog har disse modeller ikke er blevet skræddersyet til effektiv brug i prækliniske studier, og kun få rekapitulere hele spektret af genetiske og biologiske funktioner i human SEOC.

Vi har tidligere rapporteret GEMMs der udvikler kræft i æggestokkene med den genetiske og biologiske karakteristika af humane SEOCs [26]. Målrettet til æggestokkene overflade epitel, ophævelsen af ​​RB tumor undertrykkelse (TS) indledte sygdom, og

TP53

aberration (missense mutation eller sletning) lettet sygdomsprogression til aggressiv peritoneal formidling og metastase. Ovarietumorer fra disse modeller, herunder de mangelfulde i enten

BRCA1

eller

BRCA2

, repræsenterer alle 4 transkriptionelle underklasser af menneskelig SEOC. Her vil vi udnytte disse modeller til at skabe ortotopisk immunkompetente transplantation modeller, og at generere synkroniserede kohorter af mus er egnede til prækliniske undersøgelser. For at bestemme, om disse modeller er medgørlig til brug i rutinemæssige undersøgelser af effekten, og hvis deres terapeutiske respons afspejler observerede resultater i humane forsøg, vi udførte en enkelt eller kombinationsbehandling med standard platinbaseret kemoterapi og olaparib. Som observeret hos patienter, behandling respons var afhængig af

BRCA1

status, hvilket viser nytten af ​​disse modeller i vurdering af potentialet effekt af nye behandlinger for kræft i æggestokkene.

Materiale og metoder

Eksperimentelle dyr

Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med dyr undersøgelse protokol godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for Frederick Nationallaboratoriet for Cancer Research og National Institutes of Health guide til Pleje og brug af forsøgsdyr. FNLCR er akkrediteret af AAALAC International og følger Public Health Service Politik for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Animal Care blev ydet i overensstemmelse med de procedurer, der er beskrevet i “Vejledning til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr” (National Research Council, 1996; National Academy Press, Washington, DC). Dyrene blev holdt i en barriere facilitet på FNLCR under HEPA filtrering i mikro isolator bure og fodret med autoklaveret laboratorium gnaver kost (LabDiet, St. Louis, MO). Alle dyreforsøg blev udført under bedøvelse under anvendelse af inhalation af 1-2,5% isofluran. Den endpoint for mus var ændring i generelle sundhed, specielt 20% krop vægttab, manglende evne til at spise, drikke, eller ambulate, foroverbøjet kropsholdning, åndedrætsbesvær eller tegn på hypotermi samt tegn på ascites med abdominal udspiling og håndgribelig tumor ca. 2 cm størrelse. Dyr, som udviste kliniske tegn, fast tumorvækst af 2 cm, eller blev moribunde inden maksimal ascites ekspansion (omtrentlig fordobling af bredden af ​​maven) blev straks aflivet ved CO2 inhalation.

Detaljeret musestamme information og generering af adenoviralt inducerede SEOC modeller har tidligere [26] blevet beskrevet. Beige nøgen [Cr: NIH-bg-nu-XID], atymiske nøgen [athymiske ncr-nu /nu] og FVB [FVB /NCR] hunmus blev opnået fra Animal Production Program, FNLCR eller fra Jackson Laboratories [FVB /NJ ].

ortotopisk tumor transplantation

for at udføre ortotopisk tumor transplantation, lænden af ​​FVB hunner (5-8 uger gamle) blev barberet, dyrene blev bedøvet, og huden blev aseptisk forberedt til operation . En lateral langsgående hud incision blev foretaget i flanken region overliggende højre æggestok og en anden mindre snit blev lavet i bughinden. Det eksponerede æggestok, med det omgivende fedt pad, blev blotlagt og et lille donor tumor fragment (ca. 2 mm) blev indsat under bursa gennem en lille kirurgisk tåre. Ovarierne blev erstattet tilbage i bughulen blev bughinden syet, og huden lukkes med metalclips.

Cellekulturer

Menneskelig ovariecancer cellelinie HeyA8 var en gave fra Dr. Elise Kohn , NCI, og blev oprindeligt beskrevet i [27]; linier 1A9 og cisplatin-resistente 1A9CP80 var gaver fra Dr. Tito Fojo (NCI), og blev afledt som i [28], [29];

BRCA1

mutant linje UWB1.289 blev opnået fra ATCC (Manassas, VA). Alle ovarie linjer blev dyrket i RPMI (Life Technologies, Grand Island, NY) med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Pittsburg, PA) og standard antibiotika; 1A9CP80 celle medium blev suppleret med 80 mM cisplatin (Tocris, Bristol, UK). En detaljeret procedure for etablering af murine æggestokkene kræftceller findes i data S1.

In vitro

cytotoksicitetsassays

levedygtighed vedlagte ovariecancerceller blev vurderet ved hjælp af XTT som beskrevet [30]. Kort beskrevet blev celler podet i 96-brønds plader ved en densitet på 1-2,000 celler /50 pi /brønd og inkuberet i 24 timer. Cisplatin (Tocris, Bristol, UK) og olaparib (AZD2281, Selleck Chemicals, Houston, TX) fremstilles i dimethylsulfoxid (DMSO) lagre og anvendes på belagte celler fra frisklavet arbejdsopløsninger serielt fortyndet i medium. Celler blev genopfyldes med friske lægemidler efter 3 dage og var fast besluttet levedygtigheden efter 7 dage ved at inkubere kulturer med XTT og måle absorbansen ved hjælp Tecan F200 pladelæser (Research Triangle Park, NC). Celledensitet i behandlede brønde blev udtrykt som procent af kontrol. Eksperimenter inkluderet tredobbelte prøver og blev gentaget mindst tre gange. IC50-værdier (koncentrationer, der producerer tab af levedygtighed i 50% af cellerne) blev beregnet ved lineær regression.

Prækliniske studier i mus

For

in vivo

undersøgelser, cisplatin (Tocris , Bristol, UK) blev rekonstitueret i sterilt 0,9% saltvandsopløsning og injiceres intraperitonealt, og olaparib (AZD2281, Selleck Chemicals, Houston, TX) blev indgivet oralt i køretøjet [PBS indeholdende 10% DMSO (Sigma, St. Luis, MO) og 10% (2-hydroxypropyl) cyclodextrin (Sigma, St. Luis, MO)]. For de farmakodynamiske undersøgelser mus med etablerede ortotopisk ovarietumorer (-0,5 cm i diameter) blev behandlet med: 1) cisplatin (5 mg /kg), n = 3; 2; 3 og 3 for linje 29.255; 32233; 39.877 og 30200; henholdsvis 2) olaparib (50 mg /kg), n = 1; 3; 2 og 3 for linje 29.255; 32233; 39.877 og 30200; henholdsvis 3) cisplatin (5 mg /kg) efterfulgt af olaparib (50 mg /kg) 1 time senere, n = 3; 2; 2 og 2 for linje 29.255; 32233; 39.877 og 30200; henholdsvis eller 4) køretøj, n = 2; 2; 2 og 1 for linje 29.255; 32233; 39.877 og 30200; henholdsvis på dag 1. gruppe 2 og 4 har fået et andet dosis af olaparib og gruppe 4 en anden dosis af køretøj 24 timer senere. Alle dyr blev aflivet på dag 2, to timer efter sidste dosering. Tumorvæv blev opsamlet og PAR-niveauer blev målt ved anvendelse af HT PARP

in vivo

Farmakodynamiske Assay II (Trevigen, Gaithersburg, MD). Tumorlysater blev fremstillet i overensstemmelse med producentens anvisninger og 2 pg af de samlede proteiner blev analyseret.

For effekt- og langsigtet behandling undersøgelser dyr med palpable tumorer (-0,5 cm i diameter) blev afbildet og randomiseret i 4 behandlingsgrupper, som beskrevet ovenfor, baseret på tumorvolumen at opnå omtrent samme fordeling af volumener i alle grupper. Cisplatin blev indgivet intraperitonealt en gang om ugen. Olaparib og vehikel blev administreret oralt i 5 på hinanden følgende dage om ugen. Dyr i effektstudier blev behandlet i 2 eller 3 uger, afbildet at bestemme ændringer i tumor volumen og aflivet 2 timer efter dosering olaparib /køretøj. Dyr i længerevarende dosering studie blev behandlet i op til 10 uger, og filmede hver anden uge ved hjælp af ultralyd (US) at bestemme tumor mængder. De blev monitoreret efter ophør af behandling for tumorudvikling og blev aflivet én gang døende på grund af tumorbyrde. Tumorvæv blev opsamlet til histologisk analyse og immunhistokemisk (IHC).

genekspressionsprofilering

genekspressionsprofilering og sammenligning af murine og humane datasæt blev udført som tidligere beskrevet [26]. Data for genekspression analyse af murine primær og afledt ortotopisk SEOC tumorer er offentligt tilgængelige på Gene Expression Omnibus database under tiltrædelsen nummer GSE51927.

Data S1 indeholder materiale og metoder til etablering af murine primære tumorcellelinier, celle implantationer, billedbehandling og tumor volumen målinger, væv indsamling, patologisk og IHC analyse, kvantitativ analyse af IHC pletter, immunfluorescensfarvning af humane og murine celler og kvantitativ PCR-analyse af

BRCA1

status.

Resultater

Transplant modeller bevarer biologiske og genetiske træk af primære SEOCs

GEM SEOC modeller blev induceret ved injektion af en adenoviral Cre vektoren i æggestokkene bursa af mus huser forskellige kombinationer af Cre-afhængige alleler. Som beskrevet tidligere [26], da RB-TS-funktion blev inaktiveret via udtryk for

TgK18

T121

allel og blev kombineret med

TP53

sletning eller missense mutation (

p53

R172H

), cancere udviklet i løbet af 8-12 måneder at producere høj kvalitet metastatisk sygdom. Tab af

BRCA1

eller

2

kombineret med RB-TS inaktivering resulterede ikke i sygdomsprogression ud over jeg stadie uden samtidig TP53 aberration, og ikke mærkbart påvirke biologi sygdomsprogression, når det kombineres med forstyrrelse af

Rb

TP53

. Men

BRCA1

eller

BRCA2

status klart påvirkninger visse terapeutiske resultater i mennesker; derfor var det vigtigt at fastholde modeller både med og uden vildtype

BRCA1

til prækliniske undersøgelser.

de novo

SEOC modeller er fremragende til at forstå sygdommen ætiologi og for biomarkør opdagelse, men de udviser en lang latenstid til fremskreden sygdom, hvilket gør timingen af ​​kohorten produktion til prækliniske studier udfordrende. Derudover, på grund af tilstedeværelsen af ​​p53

R172H allel (a null allel før rekombination), kan SEOC GEM modeller udvikle tumorer uden for æggestokken såsom lymfomer og sarkomer [26], hvilket reducerer forudsigelig kohortestørrelse. Disse funktioner gør modellerne sub-optimale for prækliniske terapeutiske undersøgelser.

For at tilpasse disse modeller for effektive prækliniske værktøjer bevare SEOC stromale egenskaber og immunocompetency, vi optimeret ortotopisk transplantation af tumor fragmenter fra primære GEM-afledte SEOCs i æggestokkene bursa af modtagende mus (fig. 1A). Af 35 primære tumorer, blev 17 tumorer med succes overført til syngene modtagende mus (tabel 1). Take sats i passage en varierede fra 20 til 100% mellem forskellige tumor linier med markante forskelle i take rate mellem

BRCA1

null (

TgK18G

T121

tg /+ /BRCA1

Δ /Δ /p53

Δ /Δ)

BRCA1

vildtype

(TgK18G

T121

tg /+ /p53

Δ /Δ)

tumorer (95% ± 5,0 vs. 64,5% ± 5,6, p 0,01). For begge genotyper blev latenstiden for udvikling til slutstadiet væsentligt afkortet fra 9,95 ± 1,29 til 2,12 ± 0,61 måneder i forhold til de novo model (tabel 1). Efterfølgende

in vivo

overførselsteknikker yderligere forkortede ventetid og ofte forbedrede take satser (tabel 1). Vi har også observeret forskelle i latenstid mellem passerede tumorer i

TgK18G

T121

tg /+ /BRCA1

Δ /Δ /p53

Δ /Δ

v

s TgK18G

T121

tg /+ /p53

Δ /Δ

genotyper i den første (P1) (2,8 ± 0,2 måneder vs 3,6 ± 0,1 måneder, p 0,01) og anden (P2) passage (1,8 ± 0,1 måneder vs 2,7 ± 0,2 måneder, p 0,01). Notatet vi forsøgte også at etablere ortotopisk allotransplantat modeller med celler dyrket fra primære tumorer eller ascites. Mens sådanne kulturer kunne let etableres

in vitro

og viste sig nyttig til evaluering af narkotika cytotoksicitet (se nedenfor), ortotopisk implantation

in vivo

var langt mindre succes med effektivt oprettelse tumorer med kræves troskab sammenlignet med direkte transplantation af tumorvæv i syngene modtagere (data S1).

A blev allograft modeller af SEOC genereret ved transplantation af en æggestokkene tumor fragmenter fra

de novo

modeller af SEOC under bursae af syngeniske immunokompetente mus. Primære ovariekarcinom-cellelinier blev frembragt samtidigt. Den ventetid for tumor udvikling i ortotopisk modeller Forkortet væsentligt i forhold til ventetid for

de novo

model. B, H 0,01 og 18,2 ± 1,4 vs 10,4 ± 1,2, p 0,05, henholdsvis for lægemidler). er vist den gennemsnitlige og standardafvigelse.

For sammenlignende cytotoksicitetsassays, mus primære SEOC cellelinier, huser enten vildtype

BRCA1

eller deletionsmutanten, blev dyrket. Som tidligere rapporteret [31],

BRCA1

deficiente celler vokser dårligt i kultur. Således fordi Cre-medieret rekombination in vivo er ikke 100%, er der en stærk

in vitro

selektion for celler med utilstrækkelig

BRCA1

deletion i cellelinier afledt fra overvejende

BRCA1

mangelfulde tumorer [31]. Ud af 32 cellelinjer screenet, fire cellelinier, opretholdes den laveste

BRCA1

ekspressionsniveauer (under 20%) i forhold til

BRCA1

vildtype linjer blev valgt til at repræsentere

BRCA1

-deficiency (fig. 2C). Disse niveauer af

BRCA1

var sammenlignelige med deres forældre tumorer (Fig. 2 D).

BRCA1

mangel blev også bekræftet af funktionel analyse, hvor bestrålede celler var ude af stand til at rekruttere RAD51 til de steder, hvor DSBs (fig. S2).

BRCA1

deficiente cellelinier (39.647, 60.580, 60577 og 82394, alle

TgK18G

T121

tg /+ /p53

Δ /Δ /BRCA1

Δ /Δ

genotype) var ca. 2 gange mere følsomme over for cisplatin end

BRCA1

-Wild typen linjer (R5810 og R5838, både

TgK18G

T121

tg /+ /p53

Δ /Δ

genotype. figur 2E-F). Tilsvarende behandling med olaparib udviste større styrke i

BRCA1

deficiente end

BRCA1

-Wild typen cellelinjer (fig. 2 G-H). Vores resultater viser, at disse cellelinjer kopiere relative følsomhed humane tumorer, hvor

BRCA

mutationer findes oftere i platin-følsomme end platin-resistent sygdom [32], [33].

ortotopisk transplantation modeller rekapitulere

BRCA

-relaterede forskelsbehandling respons observeret hos patienter

Ideelt til effektiv brug af præklinisk model i udvikling af menneskelige lægemidler og behandlingsmetoder-associerede biomarkører, forudsigelighed af kendte menneskelige reaktioner bør etableres. Til dette formål har vi evalueret reaktioner i

BRCA1

deficiente og -Wild typen SEOC modeller til cisplatin og olaparib. For det første at fastlægge en optimal doseringsplan, vi undersøgte tumor vækstkinetik via seriel magnetisk resonans (MR) billeddannelse (fig. S3). Recipientdyrene udviklede små ovarietumorer af 70 til 80 mm

3 (-0,5 cm i diameter) med 21 til 28 dage efter implantation (s. I.) Efterfulgt af hurtig tumorvækst. Dyrene blev døende på grund af store ovarietumorer og ascites med 40 til 60 dage p.i. For undersøgelser af effekten blev behandlingen påbegyndt når en lille ( 80 mm

3). Tumormassen havde udviklet med henblik på at efterligne patienter med residual tumor byrde efter de-bulking kirurgi (. Studiedesign afbildet i figur 3A)

A, Skema dosering regime og billedbehandling i undersøgelser af effekten. B, Inhibering af PAR-dannelse i tumorlysater behandlet med olaparib for 2 (C). er vist den gennemsnitlige og standardafvigelse. D, repræsentant MR-billeder før og efter 2 ugers behandling med køretøjet, olaparib, cisplatin eller en kombination af olaparib og cisplatin vises. Skala søjle repræsenterer 1 cm. Hvide pile peger på tumorerne, grønne pile peger på kontralaterale æggestokke. MR baseret kvantificering af tumor volumen ændringer udtrykt som RTV efter 2 uger (E) og 3 uger (F) behandlingsregime. Statistiske forskelle mellem grupper blev analyseret ved envejs ANOVA og Tukey multiple sammenligninger test. Hvert punkt repræsenterer et dyr. V; køretøj, O; olaparib, C; cisplatin, O + C; olaparib og cisplatin.

For at bestemme in vivo-aktivitet og mål modulering af olaparib i ortotopisk model, vi analyseret for PAR niveauer i behandlede tumorer. Tumorlysater fra alle dyr, der modtager olaparib behandlingen var stærkt reduceret PAR niveauer efter kortvarig (28 timer; p 0,01 for linje 32233, s 0,001 for linje 30200) og lang sigt (to uger; p 0,01 for linje 29.255 og 30200, s 0,0001 for linje 39.877) dosering sammenlignet med mus behandlet med køretøj eller cisplatin (fig 3B, C), hvilket indikerer, at tumor udsættelse for olaparib var tilstrækkeligt for PARP hæmning.. Som forventet var der ingen forskel i PAR niveauer mellem

BRCA1

deficiente og vildtype tumorer, i overensstemmelse med PAR dannelse forekommende opstrøms af BRCA1, uafhængig af staten HR reparation mekanisme.

Vi vurderede effekten af ​​olaparib, cisplatin og deres kombination i

BRCA1

deficiente modeller efter to ugers behandling (fig. 3D, E) ved at måle relative tumorvolumener (RTV), de ændringer tumor volumen fra baseline (præ-dosering) til slutpunkt som bestemt ved MRI. Hvert punkt i grafen repræsenterer en individuel mus. Alle 13 vehikelbehandlede dyr fra 2 uafhængige tumormodeller udviste hurtig vækst tumor inden for 2 uger, med 3 dyr ofres før dag 14 på grund af svigtende helbred er forbundet med tumorvækst (fig. 3D, E). Behandling med olaparib resulterede i beskeden reduktion af tumorvækst i

BRCA1

deficiente 30200 tumor model og i betydelig reduktion i model 39.877 (p 0,01). Men i begge tilfælde reduktionen i RTV var dybere, når de behandles med cisplatin (p 0,001) og kombinationen af ​​cisplatin og olaparib sammenlignet med olaparib alene (p 0,01) (. Fig 3D, E)

for at undersøge om respons på behandlingen var afhængig af

BRCA1

status, vi udførte en 3-ugers behandling undersøgelse af

BRCA1

deficiente model 30200 og en

BRCA1

– vildtype model 29255. Seks af 9 vehikelbehandlede mus fra begge linjer blev døende før dag 21. Cisplatin mono- eller kombinationsbehandling var lige så effektivt på 3 og 2 ugers tidspunkter. Men udvidet behandling af

BRCA1

deficiente tumorer med olaparib resulterede i større reduktion tumor i forhold til vehikelbehandlede tumorer (2,037 ± 0,282 RTV vs 5,598 ± 2,296 RTV, s 0,01) på 3 i forhold til 2-ugers behandling (3,008 ± 0,509 vs. 3,710 ± 1,325 RTV, ns), hvilket antyder, at en tærskel på DNA-skader er påkrævet for optimal styrke. I modsætning hertil

BRCA1

-Wild typen tumor model reagerede ikke på olaparib trods PARP hæmning i tumorer, hvilket indikerer vigtigheden af ​​beskadigede HR reparation olaparib effekt (fig. 3B, F). Cisplatin terapi var lige så ineffektiv i

Brca1-

vildtype tumorer (fig. 3F).

BRCA1

genotype-specifikke reaktioner på platin narkotika samt olaparib er også blevet dokumenteret i patienter [34] – [37], derfor ortotopisk model er et nyttigt værktøj til at undersøge disse differentierede svarene og forudsige mulige resultater.

Histopatologiske ændringer som følge af olaparib og cisplatin behandling afspejler forskelle observeret i tumor volumen

for at vurdere effekten af ​​lægemiddelbehandling på celleniveau, H & E-farvede tumor sektioner blev analyseret for histologiske forandringer (fig. 4aa-l). I begge

BRCA1

deficiente modeller, behandling med olaparib resulterede i mindre differentieret SEOC med øget nuklear størrelse og pleomorphism forhold til brønden til moderat differentieret papillære strukturer i æggestokkene tumorer i vehikelbehandlede mus (fig. 4A en , b). I modsætning hertil cisplatin-monoterapi havde en mere dybtgående virkning på tumorhistologi (fig. 4ac), der producerer dårligt differentieret papillær SEOC eller udifferentieret carcinom med en stigning i tumor stroma, nekrotisk foci, og apoptotiske celler med en høj grad af nuklear pleiomorphism og tilstedeværelsen af atypiske flerkernede tumor kæmpeceller. Behandling af

BRCA1

deficiente modeller med kombination af cisplatin og olaparib resulterede i histologi meget lig den for cisplatin alene-behandlede tumorer (fig. 4AD). I modsætning hertil blev der minimal narkotikabehandlingstjenester virkninger observeret i

BRCA1

-Wild typen tumor model indikerer en samlet konkordans af histopatologiske og tumor volumen ændringer efter narkotikabehandling (fig. S4).

A, et eksempel på histologi og IHC af

TgK18G

T121

tg /+ /BRCA1

Δ /Δ /p53

Δ /Δ

tumorer behandlet med cisplatin og /eller olaparib (et -l). Tumorlinie 39.877 var følsom over for lægemiddelbehandling, hvilket resulterede i nedsat proliferation (Ki67) (A e-h) og forøget DNA-skade (γ-H2AX) (A i-l).