PLoS ONE: antistofrepertoiret i paraneoplastic cerebellare degeneration og småcellet lungecancer

abstrakt

Målet med denne undersøgelse er at fastslå, om patienter med paraneoplastisk cerebellar degeneration (PCD) og småcellet lungecancer (SCLC) har en specifik repertoire af antistoffer, hvis SOX1 antistoffer (SOX1-ab ) kan forudsige tilstedeværelsen af ​​SCLC, og hvis antistoffer mod celleoverfladeantigener forekommer i dette syndrom. Antistof-analyse blev udført under anvendelse immunohistokemi på rottehjerne, immunoblot med rekombinante antigener, screening af cDNA-ekspressionsbiblioteker, og immunmærkning af levende neuroner i 39 patienter med PCD og SCLC. VGCC-ab blev målt ved RIA, og SOX1-ab, Hu-ab, og ZIC4-ab ved immunoblot. Lambert-Eaton myastenic syndrom (Lambert) var til stede i 10 ud af 23 patienter med elektrofysiologiske undersøgelser. Mindst ét ​​antistof blev påvist i 72% af patienterne. De enkelte frekvenser var: 49% SOX1-ab, 44% VGCC-ab, 31% Hu-ab, og 13% ZIC4-ab. SOX1-ab forekom hos 76% af patienterne med VGCC-AB og 27% af dem uden VGCC-ab (p = 0,0036). SOX1-ab blev ikke fundet i 39 patienter med sporadisk sent debuterende cerebellar ataksi, 23 med cerebellar ataksi og glutaminsyredecarboxylase antistoffer, og 73 med andre end SCLC (31 uden onconeural antistoffer, 25 med Yo-ab, 17 PCD og kræftformer med Tr-ab). Fem patienter (13%) havde antistoffer mod ukendte neuronale celleoverfladeantigener men ingen af ​​dem forbedres med immunterapi. Et serum immunreagerer mod axon initial segment af neuroner og et andet serum mod ELKS1, et protein højt udtrykt i lillehjernen, der interagerer med beta4-underenheden af ​​VGCC. Som konklusion 72% af patienterne med PCD og SCLC havde et eller flere antistoffer, der indikerer tilstedeværelsen af ​​denne tumor. Hos disse patienter VGCC-ab og SOX1-ab forekomme tæt forbundet. SOX1-ab er prædiktorer for SCLC i ataksi patienter med en specificitet på 100% og følsomhed på 49%. I modsætning til limbiske encephalitis med SCLC, at antistoffer celle andre end VGCC-ab overfladeantigener, er sjældne og ikke forudsige respons på behandling

Henvisning:. Sabater L, Höftberger R, Boronat A, Saiz A, Dalmau J, Graus F (2013) antistofrepertoiret i paraneoplastic cerebellare degeneration og småcellet lungecancer. PLoS ONE 8 (3): e60438. doi: 10,1371 /journal.pone.0060438

Redaktør: Michael Platten, University Hospital of Heidelberg, Tyskland

Modtaget: November 8, 2012; Accepteret: 27 februar 2013; Udgivet: 25 marts 2013

Copyright: © 2013 Sabater et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse er delvist understøttet af Fondo de Investigaciones Sanitarias. Madrid. Spanien (#FIS PS09 /0193 FG), Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung, Østrig, Projekt J3230 (RH), og NIH RO1NS077851, NCI RO1CA089054, Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS, 11/01780), og Fundació la Marato de TV3 (JD). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dr. Dalmau har en forskningsbevilling fra Euroimmun, og modtager royalties fra patenter til brug af MA2 og NMDAR som autoantistof tests. Han har ingen finansielle konkurrerende interesser såsom ejerskab af aktier eller aktier, lønnet beskæftigelse eller rådgivning, bord medlemskab, rejselegater og honorarer for at tale eller deltagelse i møder, produkter i udvikling eller markedsførte produkter, eller gaver af enhver art etc. Forholdet mellem Dr. Dalmau med virksomheden Euroimmun ændrer ikke forfatterne, overholdelse af alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. Ingen af ​​de andre bidragydere har nogen interessekonflikter.

Introduktion

purkinjecelle er en af ​​de mest almindelige mål for immunresponset, at nogle patienter med cancer opbygget mod antigener deles af tumor og nervesystemet [1]. Død Purkinje celler resulterer i en pancerebellar syndrom kaldet paraneoplastisk cerebellar degeneration (PCD) [1]. Småcellet lungecancer (SCLC) er en af ​​de mest almindelige tumorer, som associerer med PCD [2]. Mens mange patienter ( 80%) med andre paraneoplastic neurologiske syndromer og SCLC harbour Hu antistoffer (Hu-ab), hyppigheden af ​​Hu-ab i PCD er lav (23%) [3]. Ca. 40% af PCD patienter med SCLC har antistoffer mod spændingsafhængige calcium kanaler (VGCC), og nogle også til stede kliniske eller neurofysiologisk tegn på Lambert-Eaton syndrom (Lambert) [3]. Op til 60% af patienter med Lambert og SCLC har SOX1-ab, en serologisk markør for SCLC [4].

På grund af den hyppige sammenslutning af PCD med SCLC, og undertiden med Lambert, begrundet vi, at bestemmelsen af SOX1-ab kunne også være nyttigt at forudsige, om patienter med mistænkt PCD har en underliggende SCLC. Endvidere patienter med limbisk encephalitis og SCLC men uden onconeural antistoffer ofte har antistoffer mod neuronale overfladereceptorer, hvis dette paradigme også gælder for PCD er ukendt [5].

I den foreliggende undersøgelse analyserede vi antistofrepertoiret i en serie af patienter med PCD og SCLC med fokus på hyppigheden af ​​SOX1-ab og tilstedeværelsen af ​​nye antistoffer til neuronale celleoverfladeantigener.

Metoder

patienter

Vi valgte fra vores database, patienter med diagnosen PCD og SCLC. Vi udtrykkeligt udelukket patienter, der præsenteres med ataksi men hurtigt udviklede symptomer ud over cerebellare dysfunktion. Disse patienter blev anset for at have paraneoplastisk encephalomyelitis, som i modsætning til PCD næsten altid associerer med Hu-ab [6]. Den neurologiske handicap blev bedømt ved den modificerede Rankin skala som beskrevet [6], [7]. Den kliniske oplysninger blev indhentet fra formularer udfyldes af de henvisende neurologer og telefoninterviews.

standardprotokol Godkendelser, Registreringer og Patient Samtykke

Serum og CSF prøver, der anvendes i undersøgelsen er deponeret i indsamling af biologiske prøver navnet “neuroinmunología” registreret i biobanken af ​​Institut d ‘Investigació Biomedica August Pi i Sunyer (IDIBAPS), Barcelona, ​​Spanien. I betragtning af, at mange patienter var døde på det tidspunkt, undersøgelsen blev udført, og undersøgelsen er helt anonym, så ingen prøve kan identificeres til en bestemt patient, blev det accepteret at give afkald på specifikke skriftligt informeret samtykke fra patienterne eller pårørende af Comité Etic d’investigació Clínica (CEIC) i Hospital Clinic. håndteringen, Animal blev godkendt af den lokale etiske komité (99/1 Barcelona Universitet) og Generalitat de Catalunya (1094-1099), i overensstemmelse med direktiv 86/609 /EU af Europa-Kommissionen. Undersøgelsen som forklaret blev godkendt af CEIC af Hospital Clinic.

Påvisning af anti-neuronale antistoffer

Serum og CSF, når de foreligger, blev evalueret for tilstedeværelse af onconeural (Hu, Yo, Ri, CV2, amphiphysin, MA2, Tr), anti-neuropil (NMDAR, Ampar, GABA

BR, CASPR2, LGI1, mGluR1 og mGluR5) eller eventuelle nye antistoffer ved immunhistokemi på frosne snit af paraformaldehyd-perfunderet eller post-fast rottecerebellum som rapporteret [8]. Onconeural antistof positivitet blev bekræftet ved en kommerciel immunoblot (Ravo Diagnostika GmbH, Freiburg, Tyskland) og anti neurofile antistoffer ved en cellebaseret assay ved anvendelse af HEK293-celler transficeret med de passende plasmider, som tidligere beskrevet [9]. Antistoffer mod subunit β4 og γ2 af VGCC blev påvist ved immunofluorescens på HEK293-celler transficeret med de plasmider (MC201619 og SC312948; Origene, Rockville, Maryland, USA). Antistoffer mod P /Q typen VGCC blev målt ved et kommercielt radioimmunoassay (DLD Diagnostica GmbH, Hamburg, Tyskland). SOX1-ab og ZIC4-ab blev bestemt ved anvendelse nitrocellulosefiltre med blandede fagplakker (50% af plaques fra positive kloner og 50% fra irrelevante kloner). Filtre blev skåret i stykker, hver inkuberes med forskellige patients sera (fortynding 1:1000) og udviklet af en avidin-biotin immunoperoxidaseteknik som beskrevet [4].

For at bekræfte specificiteten af ​​SOX1-ab i diagnose af PCD forbundet med SCLC, SOX1-ab blev også analyseret i serum fra 31 patienter med PCD og forskellige cancertyper, bortset SCLC, som ikke huser onconeural antistoffer, som kunne bekræfte diagnosen PCD, 25 med PCD, bryst- eller kræft i æggestokkene, og Yo-ab, 17 med PCD, Hodgkin sygdom, og Tr-ab, 39 patienter med sporadisk sent debuterende cerebellar ataksi, og 23 med cerebellar ataksi og glutaminsyredecarboxylase antistoffer.

Primær cellekultur og in vivo immunocytokemi

hippocampusneuroner blev opnået fra E18 Wistar rotteembryoer. Celler blev enzymatisk og mekanisk forstyrret og resuspenderet i neurobasalt medium tilsat B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) [9]. Granulære cellekulturer blev fremstillet fra dissekeret cerebella af 8 dage gamle Wistar-rotter og behandlet lige så hippocampale neuroner, men ved anvendelse Neurobasal-Et medium indeholdende 25 mM KCl og suppleret med B27 [10]. Celler blev udpladet i poly-L-lysin præ-coatede P24 plader og 10 uM cytosin-D-arabinofuranosid (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) blev tilsat til kulturerne 20 timer efter udpladning, for at forhindre proliferation af ikke neuronale celler.

I immunocytokemi forsøg prøver (01:05 CSF fortynding og 1:200 serumfortynding) blev inkuberet på levende neuroner i 1 time og derefter fikseret med 4% paraformaldehyd og permeabiliseret med 0,3% Triton TX -100. Farvning med anti-MAP2-antistof blev udført for at bekræfte den neuronale specificitet af de positive celler. Passende fluorescerende sekundære antistoffer blev anvendt, og de dækglas blev monteret med Vectashield med DAPI montering medier (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) og visualiseret med en Axio Imager M2 ZEISS mikroskop.

Screening af cDNA-ekspressionsbiblioteker

Uni-ZAP XR biblioteker fra menneskelig cerebellum og human føtal hjerne (Stratagene, La Jolla, CA) blev immunoscreened med 10 PCD SCLC sera (4 patienter med SOX1-ab og VGCC-ab, 4 seronegative, 1 med VGCC- ab og en med SOX1-ab), der anvender teknikker tidligere rapporteret [4]. Kort beskrevet immunoscreening af cDNA-biblioteket med sera (fortynding 1:1000) blev udført for at nå isolerede positive plaques. Fagkloner blev subklonet i pBluescript-plasmidet under anvendelse af in vivo udskæring fag redning protokol (Stratagene, La Jolla, CA). Plasmid-DNA blev oprenset med QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Santa Clarita, CA), og sekventeret med DNA sequencer ABI 377 (Applied Biosystems, Foster City, CA) under anvendelse af Big Dye terminator klar mix (Applied Biosystems). Positive kloner blev sekventeret på begge strenge. Det menneskelige genom BLAST program (NCBI, NIH, Bethesda, MD) blev anvendt til at søge efter homologier.

Statistisk analyse

Sammenhængen mellem SOX1-ab og VGCC-ab blev analyseret i en beredskabsplan bord og den tosidede Fisher eksakte test blev anvendt.

Resultater

patienter

Vi identificerede 39 patienter med PCD og SCLC. Median alder af patienterne var 64 år (spændvidde: 47 til 85 år) og 34 var mænd. PCD antedated diagnosen SCLC i 36 patienter med en median tid på 2 måneder (interval: 0,5 til 42 måneder). På tidspunktet for PCD diagnosen havde 10 patienter Lambert-Eaton syndrom og 13 ikke (bekræftet af mindst normale sammensatte muskel handling potentialer i elektromyografi (EMG) undersøgelser [11]). Resten af ​​de 16 patienter, henviste ikke symptomer på Lambert men ingen EMG studier blev gjort. Tyve syv patienter fik mindst en fuld kursus (intravenøs immunoglobuliner eller steroider eller begge) af immunterapi (6 patienter), kemoterapi (14) eller begge (7). Ingen forbedring eller stabilisering med moderat-svær cerebellar dysfunktion (Rankin score 3) forekom hos 13 af de 21 patienter (62%), der havde passende opfølgning. Tre patienter forbedret og fem forblev stabil med en Rankin score på 3 eller mindre

VGCC og onconeural antistoffer:. Association med SOX1 antistoffer

Halvfjerds-to procent af patienterne havde mindst én af de angivne antistoffer. De individuelle frekvenser af antistofferne var: 49% SOX1-ab, 44% VGCC-ab, 31% Hu-ab, og 13% ZIC4-ab. Tyve otte sera præsenteret mindst ét ​​antistof, og 11 var negative (figur 1). Der var en klar sammenhæng mellem SOX1-ab og VGCC-ab. SOX1-ab blev fundet i 76,5% af patienterne med VGCC-ab men kun 27,3% af dem uden VGCC-ab (Fisher eksakt test p = 0,0036) (figur 2). Positive VGCC-ab blev fundet i 9 (90%) af de 10 patienter med Lambert-Eaton syndrom og i 7 (54%) af 13, uden kliniske eller EMG tegn på Lambert. Tilsvarende SOX1-ab var til stede i 80% af patienter med Lambert-Eaton syndrom og 38% af dem uden Lambert. Ingen foreninger blev observeret mellem VGCC-ab eller SOX1-ab og Hu-ab. Ingen af ​​patienterne var positive for onconeural antistoffer, bortset Hu, eller præsenteres velkarakteriserede anti-neurofile antistoffer. SOX1-ab blev ikke påvist i kontrolgruppen serie af 73 patienter med PCD og forskellige kræfttyper andre end SCLC, 32 patienter med sporadisk sent debuterende cerebellar ataksi, og 23 med cerebellar ataksi og glutaminsyredecarboxylase antistoffer.

Fordeling af SOX1-, VGCC-, driftslam-, og ZIC4-ab i vores patient kohorte. Hver række repræsenterer en patient, og når positiv cellen fyldes i farve.

søjlegraf, der repræsenterer korrelationen mellem SOX1-ab og VGCC-ab. (Fisher eksakt test p = 0,0036).

Identifikation af nye antistoffer

Et serum med SOX1-ab viste også robust immunoreaktivitet mod Axon indledende segment af neuroner i rutinemæssige immunhistokemiske undersøgelser ( Figur 3A). Screening af et humant cerebellum-cDNA-ekspressionsbibliotek med denne serum undladt at identificere den formodede antigen. En anden ny antistof blev identificeret under screeningen af ​​cDNA-biblioteker med en serum med VGCC-ab. Målproteinet, kaldet ELKS1, er yderst rigelige i lillehjernen. Vi udførte en bestemt fag screening analyse til påvisning af ELKS1 men vi kunne ikke finde andre positive sera. PCD sera også ikke vise immunreaktivitet med HEK293-celler transficeret med β4 eller y2 hjælpestoffer underenheder af VGCC. Fem patienter (12,8%) havde antistoffer mod celleoverfladeantigener udtrykt i levende, ikke-permeabiliserede hippocampus neuroner (figur 3B), men kun en af ​​dem reagerede med cerebellare granulære neuroner.

A. Antistoffer mod klippeknold af neuronerne i rottecerebellum. Immunhistokemi på rotte sagittal cerebellum sektioner. Bemærk den stærke atypisk reaktivitet af et PCD SCLC serum mod højen Axon af neuroner, hovedsageligt i Purkinjeceller. Kerner modfarvet med hematoxilin. B. Immunofluorescens på levende hippocampusneuroner. Hippocampusneuroner inkuberet med CSF 1/5 fortyndet af en PCD SCLC patient. Reaktivitet af patienten mod membranen af ​​neuronet ses i grønt og MAP2 farvning i rød at sikre neuronal cellelinje. Kerner set blå med DAPI. (Mål 100x olie)

Diskussion

I den aktuelle undersøgelse, vi ønskede at afgøre, om patienter med PCD og SCLC havde andre end VGCC-ab-antistoffer, som kan forklare den cerebellare ataksi eller mindst til at hjælpe ved diagnosen af ​​PCD. Den isolerede bestemmelse af VGCC-ab i en patient med cerebellare ataksi med eller uden Lambert bekræfter næsten altid en paraneoplastisk oprindelse, fordi den kliniske sammenslutning af cerebellar ataksi og Lambert meget sjældent forekomme i fravær af kræft [12], [13]. Desuden, hvis den cerebellare ataksi er paraneoplastisk og patienten har VGCC-ab den underliggende tumor er altid en SCLC [14].

For at overvinde denne begrænsning, vi analyserede tilstedeværelsen af ​​SOX1-ab, en serologisk markør af SCLC [15]. I vores serie af PCD og SCLC fandt vi, at SOX1-ab var til stede i næsten 50% af disse patienter. I modsætning hertil blev SOX1-ab ikke fundet i serum fra patienter med PCD og andre typer tumorer med eller uden onconeural antistoffer og hos patienter med cerebral ataksi uden cancer. Vores data indikerer, at SOX1-ab er gode indikatorer for en underliggende SCLC hos patienter med cerebral ataksi. Hyppigheden af ​​SOX1-ab var endnu højere (76,5%) i PCD patienter med SCLC, som også havde VGCC-ab. Denne frekvens er den samme som rapporteret hos patienter med Lambert-Eaton syndrom og SCLC (67%) [16]. Tilsammen tyder disse data, at patienter med PCD og SCLC, co-forekomst af VGCC-ab og SOX1-ab er stærkt forbundet, selv om 41% af PCD patienter med VGCC-ab i den aktuelle serie ikke havde Lambert.

Tidligere undersøgelser viste, at alle patienter med Lambert-Eaton syndrom og SCLC der havde Hu-ab havde også SOX1-ab [16]. Derfor gjorde yderligere testning for Hu-ab ikke forbedre diagnoser af paraneoplastisk Lambert [16]. Men konstateringen af ​​den aktuelle undersøgelse har forskellige konsekvenser. Henviser SOX1-ab, forekom hos 48,7% af patienterne med PCD, yderligere 20% af patienterne havde Hu-ab eller VGCC-ab. Samlet set kombinerer test af alle 3-antistoffer (alle kommercielt tilgængelige) vil identificere næsten 70% af patienter med PCD og SCLC. Enkelte patienter kan have andre onconeural antistoffer som ZIC4, CV2 eller amphiphysin og alle, men ZIC4 rutinemæssigt screenes med de samme kits almindeligvis anvendes til at detektere Hu-ab.

Vi kunne ikke finde andre potentielt nyttige antistoffer i denne serie . Serum fra en patient udviste reaktivitet med Axon indledende segment af store neuroner. Dette antistof er tidligere blevet rapporteret i en patient med encephalomyelitis og SCLC der udviklede kramper og alvorlige gangart ataksi [17]. Vi har tidligere identificeret denne immunoreaktivitet hos en patient med SCLC uden neurologiske symptomer på antistoffet kan være en markør af den underliggende SCLC (upubliceret). En anden patient havde et antistof mod ELKS1, et protein hovedsageligt udtrykkes i Purkinje-celler [18]. Selvom ELKS1 co-immunopræcipitater med β4 VGCC underenheden, kunne vi ikke identificere antistoffer, der reagerer direkte med β4 eller γ2, som er VGCC underenheder, der er stærkt til udtryk i lillehjernen [18], [19]. Vores undersøgelse udelukker ikke den mulighed, at sera fra disse patienter kan have antistoffer mod andre VGCC underenheder eller interagerende proteiner. For eksempel, sera fra patienter med ikke-paraneoplastiske Lambert reagerer oftere med det domæne IV i alpha1A af VGCC sammenlignet med patienter med Lambert-Eaton syndrom og SCLC [20].

Den nylige opdagelse af antistoffer mod neuronale overfladeantigener har ændret konceptet, at antistoffer i CNS paraneoplastisk syndrom er kun surrogatmarkører for den underliggende tumor. Mens patienter med limbisk encephalitis og SCLC ca. 50% har Hu-ab og de resterende 50% har antistoffer mod synaptiske proteiner (hovedsagelig GABA

B receptor) [5], vores undersøgelse viser, at patienter med PCD og SCLC forekomsten af antistoffer til celle- andre end VGCC-ab overfladeproteiner, er sjældne.

Den praktiske implikation af vores undersøgelse er, at patienter med cerebellare ataksi, SOX1-ab er gode prædiktorer for et tilknyttet SCLC med en specificitet på 100 % og en sensitivitet på 49%. Desuden er kombinationen af ​​testning for SOX1-, VGCC-, og Hu-ab identificerer næsten 70% af patienter med PCD og SCLC. I betragtning af at PCD normalt udvikler før diagnosen af ​​tumoren, dette repertoire af antistoffer er nyttigt at fastslå, at den cerebellare syndrom er paraneoplastisk, den underliggende tumor er SCLC, og chancen for neurologiske opsving er lav.

Tak

forfatterne takker Mercé Alba og Eva Caballero for deres fremragende tekniske support. Forfatterne takker også Dr. Xavier Xifró for at levere den cerebellare kornet cellekultur-protokollen.