PLoS ONE: Induktion af Peroxiredoxin 1 af hypoxi Regulerer Hæm oxygenase-1 via NF-KB i Oral Cancer

Abstrakt

Overekspression af peroxiredoxin en (PRX1) er blevet observeret i mange kræftformer, herunder oral pladecellekræft ( OSCC). Den præcise molekylære mekanisme af opregulering af PRX1 i carcinogenese, dog stadig dårligt forstået. Formålet med dette studie er at undersøge sammenhængen mellem PRX1 og hypoxi, og potentiel mekanisme (r) PRX1 i OSCC cellelinje SCC15 og xenograftmodel. Vi behandlede vildtype og PRX1 knockdown SCC15 celler med transient hypoxi efterfulgt af reoxygenering. Vi har registreret tilstanden af ​​hypoxi, produktion af reaktive oxygenarter (ROS), og ekspression og /eller aktivitet af PRX1, hæm oxygenase 1 (HO-1) og nuklear faktor-kappa B (NF-KB). Vi fandt, at hypoksi inducerer ROS akkumulering, opregulerer PRX1, øger NF-KB translokation og DNA-bindingsaktivitet, og nedregulerer HO-1

in vitro

. I PRX1 knockdown celler blev ekspressionen niveauet for HO-1 steg, mens NFKB translokation og DNA-bindingsaktivitet blev nedsat efter hypoxi eller hypoxi /reoxygenering behandling. Desuden har vi efterlignede den dynamiske iltning tumormikromiljøet i xenograft model og vurderet ovennævnte indeks i tumorer med maksimal diameter på 2 mm, 5 mm, 10 mm eller 15 mm. Vores data viste, at tumor hypoxisk tilstand og ekspression af PRX1 er signifikant associeret med tumorvækst. Ekspressionen af ​​HO-1 og NF-KB, og NF-KB-DNA-bindingsaktivitet blev signifikant forhøjet i 15 mm tumorer, og niveauet af 8-hydroxydeoxyguanosine blev forøget i 10 mm og 15 mm tumorer, sammenlignet med dem i størrelse 2 mm. Resultaterne fra dette studie giver eksperimentelle beviser for, at overekspression af PRX1 er forbundet med hypoxi, og PRX1 /NF-KB /HO-1 signalvejen kan være involveret i oral carcinogenese

Henvisning:. Zhang M, Hou M, Ge L, Miao C, Zhang J, Jing X, et al. (2014) Induktion af Peroxiredoxin 1 af hypoxi Regulerer Hæm oxygenase-1 via NF-KB i Oral Cancer. PLoS ONE 9 (8): e105994. doi: 10,1371 /journal.pone.0105994

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: Maj 20, 2014; Accepteret: 25 Juli 2014; Udgivet: 27 August, 2014

Copyright: © 2014 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation (81070836), Beijing Natural Science Foundation (7102065) og ZYLX201407, Beijing Municipal Administration af Hospital Key Medical Development Project. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Oral pladecellekræft (OSCC) er den mest almindelige hoved- og halscancer i hele verden. Trods af fordelene ved kirurgi, kemoterapi og strålebehandling, har 5-års overlevelsesraten for OSCC ikke forbedret markant i de seneste 30 år [1] – [3]. Metastase og kemoterapi /strålebehandling modstand er fortsat største bekymringer i klinisk kræftbehandling. Hypoksi, et fælles træk ved cancer, fremmer tumorcelleinvasion og metastase i tumormikromiljøet fører til resistensen af ​​tumorceller over for kemoterapi og strålebehandling [4], [5]. Det er blevet rapporteret, at de patologiske funktioner, herunder aktive invasionsevne, lymfeknudemetastase og vaskulær proliferation er associeret med tumorvæv hypoxi i OSCC [6], [7]. Udsættelse for hypobarisk hypoxi fører til en betydelig stigning i produktionen af ​​reaktive oxygenarter (ROS) hos dyr. Ophobningen af ​​ROS induceret af hypoxia kan resultere i oxidativt stress og tumorprogression [8]. ROS-medieret respons kan reguleres ved antioxidanter og antioxidant enzymsystemer, såsom superoxiddismutase, katalase og thioredoxin /peroxiredoxin [9].

Peroxiredoxins (Prxs) er en superfamilie af multifunktionelle antioxidant thioredoxin-afhængige peroxidaser. Peroxiredoxin 1 (PRX1) er en stor medlem i Prxs familien og fungerer som en antioxidant til at fjerne ROS i en bred vifte af organismer. PRX1 er involveret i flere biologiske tilstande /aktiviteter, herunder oxidativ stress, celledeling og celle apoptose [9]. PRX1 overudtrykkes i mange maligniteter, herunder spiserøret, lunge, bryst og pancreascancer. Forhøjet PRX1 udtryk er forbundet med nedsat samlet overlevelse og dårlig klinisk resultat [10], [11]. Overekspression af PRX1 er også blevet rapporteret i OSCC, men den præcise molekylære mekanisme af PRX1 i mundtlig carcinogenese forbliver uklar [12]. Udtrykket af nuklear faktor-kappa B (NF-KB) og Hæm oxygenease-1 (HO-1) forhøjes i OSCC [13], [14]. Talrige undersøgelser har vist, at NF-KB reaktioner på hypoxi-reoxygenering

in vitro

[15]. NF-KB kan reguleres ved PRX1 gennem sin indledende aktivering i cytoplasmaet [16] eller ved at ændre koncentrationen af ​​oxidant fører til oxidativ inaktivering af NF-KB [17]. HO-1, et 32-kDa varmechokprotein, kan katalysere den oxidative nedbrydning af hæm til biliverdin, der efterfølgende reduceres til bilirubin. HO-1 kan induceres af hypoxi, varmechok og cytotoksiske oxidanter [18], [19]. HO-1 er et af målene i NF-KB under stressende forhold [20] – [23]. Selv om mekanismen for PRX1 i oxidant stress er ikke klart, flere beviser tyder på, at PRX1 kan respons på hypoxi og regulere NF-KB-vejen kaskade. I denne undersøgelse undersøgte vi ændringen af ​​PRX1 som respons på hypoxi og vurderet de potentielle sammenhænge mellem PRX1 og NF-KB /HO-1 under anvendelse af oral cancer cellesystem og xenograftmodel.

Materialer og metoder

Cellekultur

Humant OSCC celler, SCC15, (ATCC, Manassas, VA) blev holdt i DMEM-F12 suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS) (Gibco, USA) indeholdende 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. SCC15-celler blev dyrket ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO

2 og 95% luft. At vælte PRX1 blev SCC15 celler transficeret med PRX1 shRNA Plasmid (Santa Cruza Biotechnology) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) ifølge producentens anvisninger. Kontrol shRNA Plasmid-A (Santa Cruza Biotechnology) blev transficeret som kontrol. Effektiviteten af ​​PRX1 shRNA knockdown blev bestemt ved QRT-PCR og western blot-analyser.

Pimonidazole farvning i SCC15 celler

Celler blev dyrket på dækglas i 24 timer før hypoxi behandling. Under hypoxi behandling blev celler sat i en hypoxi inkubator med gas indeholdende 1% O

2, 5% CO

2 og 94% N

2 ved 37 ° C i forskellige tidsrum. 200 uM pimonidazole blev tilsat til mediet og inkuberet i 30 min. Efter vasket med PBS blev cellerne fikseret med paraformaldehyd (3%) ved stuetemperatur i 10 minutter og efterfølgende vasket igen med PBS. Efter blokeret med BSA, blev dækglassene inkuberet med hypoxyprobe-1 muse-monoklonalt antistof MAB1 (1:100) i Hypoxyprobe-1 Plus kit (Chemicon Int., Temecula, CA) natten over. Et sekundært FITC-konjugeret anti-muse-antistof blev anvendt. Dækglas blev monteret og immunofarvede celler blev undersøgt på et Olympus IX71 mikroskop (Tokyo, Japan).

ROS afsløring

Produktionen af ​​intracellulær ROS i celler blev målt med 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCF-DA) under anvendelse af FACS-analyse. De SCC15 celler blev opsamlet og suspenderet i 500 uL fortyndet DCF-DA. Blandingen blev inkuberet ved 37 ° C i 20 minutter og derefter vasket to gange med PBS. Prøverne blev analyseret ved flowcytometer inden for 1 time. Dataene blev normaliseret til værdierne fra kontroller. Den gennemsnitlige DCF fluorescensintensitet blev målt med excitation ved 488 nm og emission ved 525 nm. Forsøgene blev udført in triplo.

Immunofluorescens

celler dyrket på dækglas blev skyllet med PBS, fikseret og permeabiliseret i acetone ved -20 ° C i 10 min. Efter inkubering med PBS indeholdende 5% BSA i 1 time blev monoklonalt anti-NF-KB-antistof (Cell Signaling Technology, 1:100 i PBS-BSA) tilsat ved 4 ° C og inkuberet natten over. Dækglas blev vasket med PBS, inkuberet med Alexa Fluor 546 anti-kanin (Molecular Probes, 1:500) sekundært antistof ved stuetemperatur i 1 time, og monteret i Dako Cytomation fluorescerende monteringsmedium. Konfokale billeder blev indsamlet ved anvendelse af et Leica SP2 laserscanning konfokal mikroskop udstyret med UV excitation, en argon-laser, en 633 /1,32 OIL PH3 CS mål, og et konfokalt pinhole sæt ved 1 Airy enhed. Alle konfokale billeder var enkelt optisk sektioner.

xenograftmodel

Forty male BALB /c nøgne mus (Beijing Vital River Laboratories, Kina) blev anvendt til opnåelse tumorgenicitet af SCC15 celler

in vivo

. Forsøget Protokollen blev godkendt af den lokale etiske komité for anvendelsen af ​​dyr. De SCC15 celler (6 x 10

6) blev suspenderet i 100 pi phosphatpufret saltvand og blev transplanteret subkutant i højre og venstre flanker af 4 uger gamle nøgne mus. Den tumorvækst blev overvåget hver 3. dag efter transplantation. Tumorerne blev høstet, når den maksimale diameter af tumorerne nåede 2 mm, 5 mm, 10 mm eller 15 mm. For at mærke hypoxiske celler blev de nøgne mus injiceret intraperitonealt med 0,1 ml saltvand indeholdende pimonidazole hydrochlorid (1 – [(2-hydroxyl-3-piperidinyl) propyl) -2-nitroimidazol-hydrochlorid) i en dosis på 60 mg /kg legemsvægt 1 time før tumorexcision. Mus blev gennemført eutanasi og tumorprøver blev fjernet og straks opbevaret i flydende nitrogen i molekylær /celleanalyse, eller i formalin for at gøre paraffinindlejrede vævsblokke. I alt 80 tumorer blev inddelt i fire grupper efter tumor diameter (20 tumorer /størrelse).

Pimonidazole farvning i tumorer

De paraffinindlejrede blokke med tumor prøver blev opdelt for pimonidazole farvning. Snittene blev inkuberet med primære kanin anti-pimonidazole antiserum hypoxyprobe-1 MAB1 (fortynding 1:50; Chemicon, USA) ved 4 ° C natten over. At vurdere tilstanden af ​​hypoxi, blev fem repræsentative lysmikroskopiske områder beregnes på hvert afsnit (forstørrelse x 200) og den gennemsnitlige optiske densitet (MOD) blev beregnet ved anvendelse af Image Pro Plus 7.0 analysator, MOD = IOD /område.

QRT-PCR-analyse

Totalt RNA blev ekstraheret fra dyrkede celler og tumorvæv ved hjælp af TRIzol (Invitrogen Life Technologies, USA) ifølge producentens anvisninger. cDNA blev syntetiseret ved omvendt transkribering 2 ug RNA med High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, USA). En mikroliter aliquots af cDNA blev anvendt som skabeloner. De FAMTM Dye /MGB sonder af PRX1, HO-1 og ß-actin blev syntetiseret af ABI (Assay ID: PRX1, HS0060202; HO-1, HS00015796, human ACTB, 4352935E). Til analyse af data, blev 2

-ΔΔCT metode med normalisering af data af interesserede gener til husholdning gen ß-actin. Eksperimenterne blev udført tredobbelt.

Western blot-analyse

Celler og tumorvæv blev lyseret i immunpræcipitationsassay buffer (50 mM Tris-CI [pH 7,4], 1% NP40, 150 mM NaCl , 1 mM EDTA, 1 M phenylmethylsulfonylfluorid, 10 ug hver af aprotinin og leupeptin og 1 mM Na3VO4). Efter centrifugeret ved 12.000 g i 30 minutter blev supernatanten opsamlet og proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af Lowry-metoden. Lige store mængder protein blev separeret på 12% SDS-PAGE-geler og blottet på nitrocellulosemembraner. Blottene blev inkuberet med anti-PRX1 (1:5000, Upstate, USA) og anti-HO-1 (1:2000, Abcam, USA) antistof. Antistof af β-actin (Sigma, St. Louis, MO) blev anvendt som en loading kontrol. Immunreaktive bånd blev påvist med peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer og forstærkes af kemiluminescens reagenser (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Forsøgene blev udført in triplo.

NF-KB DNA-detektion

bindingsaktivitet

nukleare protein blev ekstraheret fra celler og tumorvæv ved hjælp af NE-PER Nuclear og cytoplasmiske Ekstraktion Reagenser (Thermo, USA) . Kort fortalt blev celler og væv suspenderes i hypotonisk buffer og inkuberet på is i 10 minutter efterfulgt af centrifugeret ved 12.000 g og 4 ° C i 10 minutter for at udfælde kerner. Efter vaskes i hypotonisk puffer, blev kernerne lyseret i en lysebuffer at få kernerne ekstrakter. NF-KB-DNA-bindingsaktivitet blev påvist under anvendelse af NF-KB (p65) Transcription Factor Assay Kit (Cayman Chemical Company, USA).

Immunhistokemi

paraffinindlejrede blokke blev snittet for immunohistokemi analyse. Sektioner blev behandlet med 20 mg /l proteinase K (fortynding: 1:1000; Sigma-Aldrich, USA) ved 37 ° C i 30 minutter for antigen hentning. Efter blokering af endogen peroxidaseaktivitet med 0,3% hydrogenperoxidase i 15 minutter blev snittene behandlet med 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OHdG, 1:8000; Abcam, USA) eller NF-KB (Cell Signaling Technology, 1:100) primær antistof ved 4 ° C natten over. Objektglassene blev inkuberet i biotinylerede sekundære IgG-antistoffer ved 37 ° C i 30 minutter, og derefter visualiseret under anvendelse af DAB i 2-5 min. Mayers hæmatoxylin blev brugt til at kontrastfarve de sektioner, som var så dehydreret og monteret. For negativ kontrol blev PBS anvendt i stedet for primære antistoffer. Cellerne med positiv farvning blev bestemt ved at tælle procentdelen af ​​farvede celler under anvendelse af Image Pro Plus 7.0 analysator. Et minimum af 1.000 celler blev talt for hver tumor prøve.

Statistisk analyse

Ekspressionsniveauerne for PRX1, HO-1, NF-KB og 8-OHdG, og data fra ROS produktion, pimonidazole farvning, immunofluorescens og NF-KB-DNA-bindingsaktivitet blev analyseret og sammenlignet ved anvendelse af envejs variansanalyse (ANOVA). Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS Software til Windows 17.0. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant på

P

0,05. Alle

P

værdier var tosidet.

Resultater

PRX1 knockdown øger hypoxi og intracellulær ROS produktion

Vi brugte shRNA plasmid til at vælte PRX1 i SCC15 celler. Som vist i figur 1A og 1B, blev niveauerne af PRX1 mRNA og proteinekspression reduceret til 40-50% af shRNA transfektion i SCC15 celler. Efter PRX1 knockdown, vi opdaget hypoxiske tilstand i både PRX1 knockdown celler og kontrol celler, der blev transficeret med tom vektor. Vores data viser, at hypoxisk tilstand blev forøget af hypoxi eller hypoxi /reoxygenering undtagen 12-h hypoksi behandling i kontrolceller (figur 1C, øvre panel). I PRX1 knockdown celler, den hypoxiske tilstand steget mere væsentligt i forhold til kontrolceller (figur 1C, nedre panel). Den højeste hypoksi blev observeret i PRX1 knockdown-celler efter 24 timers hypoxi /2 timer reoxygenering behandling, og 2 timer reoxygenering behandling ikke formindske hypoxi niveau forhøjes ved hypoxi behandling. Vi har registreret også produktionen af ​​intracellulær ROS. Svarende til hypoxi tilstand, blev produktionen af ​​intracellulær ROS steg med hypoxi behandling, undtagen 12 h hypoksi og 12 h hypoksi /2 timer reoxygenering behandling (figur 1D). Ophobning af intracellulære ROS er højere i PRX1 knockdown celler i forhold til det i kontrol- celler.

A, PRX1 protein blev signifikant reduceret med shRNA transfektion. B, PRX1 mRNA blev signifikant reduceret med shRNA transfektion. C, Pimonidazole farvning viste den øgede hypoksi status i celler efter hypoxi /reoxygenering behandling. D, Intercellular ROS niveau identificeret ved flowcytometri i celler efter hypoxi /reoxygenering behandling. *

P

0,05 vs. WT SCC15 celler;

#

P

. 0,05 vs. kontrol hypoxiske WT SCC15 celler

PRX1 negativt regulerer HO-1 under hypoxisk betingelser

For at bestemme hvorvidt PRX1 var relateret til HO-1 i SCC15 celler under hypoxiske betingelser, vi vurderede ekspressionsniveauerne af PRX1 og HO-1 efter hypoxiske behandling. Som vist i figur 2A (a, b), proteinet ekspression af PRX1 blev forøget med hypoxiske behandling. Imidlertid blev proteinet ekspression af HO-1 faldt ved indledende faser af hypoxi, når PRX1 ekspression blev forøget, og steg derefter mens PRX1 ekspression faldt i 12 h hypoksi /2 timer reoxygenering, 24 h hypoksi og 24 h hypoksi /2 timer reoxygenering, som angivet i figur 2A (c og d). I 4 timer hypoxi /2 timer reoxygenering gruppe, blev niveauet af PRX1 protein steget med 50%, mens HO-1 protein blev nedreguleret med 30% sammenlignet med ubehandlede celler (figur 2A-B og D). Men i PRX1 knockdown celler, HO-1 var signifikant opreguleret efter hypoxi eller hypoxi /reoxygenantin behandling bortset fra 24 timer gruppen. Proteinet ekspression af HO-1 blev forøget med 30% (figur 2A-d), og mRNA-niveau blev forøget 1,4 gange i PRX1 knockdown SCC15 celler behandlet med 4 h hypoksi /2 timer reoxygenering sammenlignet med ubehandlede celler (figur 2C) . MRNA ekspression af PRX1 blev forøget med 2,7 gange, mens ekspressionen af ​​HO-1 mRNA blev nedreguleret med 40% (figur 2B og 2C).

A (a), protein ekspression af Prx-1 og HO-1 detekteret ved Western blot efter hypoxi /reoxygenering behandling; A (b og d), PRX1 og HO-1 protein kvantificering forhold til p-actin; A (c), korrelation af Prx-1 og HO-1 efter hypoxi /reoxygenering behandling. B og C, mRNA ekspression af Prx-1 og HO-1 detekteret ved QRT-PCR efter hypoxi /reoxygenering behandling. *

P

0,05 vs. WT SCC15 celler;

#

P

. 0,05 vs. kontrol hypoxiske WT SCC15 celler

PRX1 knockdown hæmmer NF-KB-translokation og DNA bindende aktivitet

Vi har detekteret den endogene NF-KB-ekspression i celler efter hypoxi behandling. Vi observerede en øget kerne ekspression af NF-KB i SCC15 celler efter behandling, især i 24 h hypoksi gruppe (figur 3A, øvre panel). Desuden er der i PRX1 knockdown celler blev NF-KB-translokation fra cytoplasma til kernen faldet i forhold til kontrol-celler (figur 3A, lavere panel). Vi derefter detekteret NF-KB-aktivitet i celler efter hypoxi behandling. Vi fandt, at NF-KB p65 DNA bindingsevne blev signifikant reduceret i PRX1 knockdown celler efter hypoxi behandling sammenlignet med kontrolceller (figur 3B).

A, endogene kerner ekspression af NF-KB. B, NF-KB-DNA-bindingsaktivitet detekteret ved ELISA. *

P

0,05 vs. WT SCC15 celler;

#

P

0,05 vs. kontrol hypoxiske WT SCC15 celler

Hypoxi er forbundet med tumorvækst i xenograftmodel

For at vurdere ændringen. de hypoxiske betingelser under tumorudvikling, vurderede vi hypoxi i tumorer med maksimal diameter på 2 mm, 5 mm, 10 mm eller 15 mm. Som vist i figur 4A, blev de små og spredte positive celler observeret i 2 mm tumorer. I 5 mm, 10 mm og 15 mm tumorer blev de hypoxiske celler hovedsageligt placeret ved centrene af kræft reder. Hypoxi i 5 mm, 10 mm og 15 mm tumorer var signifikant højere end den i 2 mm tumorer (figur 4B). Vi har detekteret også niveauet for 8-OHdG at vurdere oxidative DNA skade i tumorceller. Ekspressionen af ​​8-OHdG steg fra 2 mm til 15 mm tumorer (figur 4C). Det var signifikant højere i 10 mm og 15 mm tumorer i forhold til 2 mm tumorer (figur 4D).

A, Hypoxi blev detekteret i 2 mm (a), 5 mm (b), 10 mm (c) og 15 mm (d) tumorer ved pimonidazole farvning. B, Hypoxi MOD øger i 5 mm, 10 mm og 15 mm tumorer i forhold til 2 mm tumorer. C, 8-OHdG blev påvist ved immunhistokemi i 2 mm (a), 5 mm (b), 10 mm (c) og 15 mm (d) tumorer. D, Niveauet af 8-OHdG var højere i 10 mm og 15 mm tumorer i forhold til 2 mm tumorer. *

P

0,05; **

P

. 0,01

Overekspression af PRX1 og HO-1 under tumorigenese i xenograft model

Som vist i figur 5A, mRNA ekspressionen af PRX1 signifikant forøget i 5 mm, 10 mm og 15 mm tumorer sammenlignet med 2 mm tumorer. Proteinet ekspression af PRX1 blev også forhøjet i 10 mm og 15 mm tumorer (figur 5B). Overekspression af HO-1 blev observeret i 15 mm tumorer som vist i figur 5C og 5D.

A og C, mRNA-ekspression af PRX1 og HO-1 detekteret ved QRT-PCR. B og D, Protein ekspression af PRX1 og HO-1 detekteres ved western blot. *

P

0,05; **

P

0,01

NF-KB-translokation og DNA bindende aktivitet øges i xenograft model

NF-KB-translokation og DNA bindende aktivitet begge. blev forhøjet, når tumor udviklet. Den immunhistokemi-analyse viste, at ekspressionen af ​​NF-KB var signifikant forøget i 15 mm tumorer sammenlignet med 2 mm tumorer (figur 6A og 6B). Tilsvarende blev NF-KB-DNA-bindingsaktivitet signifikant forhøjet i 15 mm tumorer end 2 mm tumorer (Figur 6C).

A, NF-KB-ekspression blev påvist ved immunhistokemi i 2 mm (a), 5 mm ( b), 10 mm (c) og 15 mm (d) tumorer. B, er den procentdel af nukleare NF-KB positive celler steg betydeligt i 15 mm tumorer i forhold til det i 2 mm tumorer. C, NF-KB-DNA-bindingsaktivitet var signifikant højere i 15 mm tumorer sammenlignet med 2 mm tumorer. *

P

0,05; **

P

. 0,01

Diskussion

Det overordnede formål med denne undersøgelse er at undersøge den rolle, PRX1 i iltsvind i OSCC. Først brugte vi shRNA at vælte PRX1 i SCC15 celler og derefter opdaget PRX1, NF-KB og HO-1 i hypoxi. Vi undersøgte også PRX1 med hypoxi under tumor udvikling i xenograft model. Vores data viste, at efter udsættelse for hypoxi eller hypoxi /reoxygenering, intracellulær hypoxi og ROS-niveauer blev forværret. Vi fandt også, at HO-1-ekspression var opreguleret i PRX1 knockdown-celler, hvorimod NF-KB translokation og DNA-bindende aktivitet, blev nedsat. Taget sammen antyder disse data, at den forhøjede akkumulering af ROS induceret af hypoxia kan opregulere PRX1, som kan aktiverer NF-KB og negativt regulerer HO-1 i hypoksi-induceret orale cancerceller. Vores

in vivo Salg data viste, at overekspression af PRX1 er forbundet med hypoxi og tumorvækst. Disse resultater antyder, at PRX1 /NF-KB /HO-1-signalvejen kan spille en nøglerolle i carcinogenese af hypoxi-induceret oral cancer.

En af de vigtigste funktioner i PRX1 er thioredoxin-afhængig peroxidaseaktivitet udelukkende at basere sig på cystein ved den N-terminale region [24]. Det bekæmper ekstra ROS som en antioxidant. Hypoxi øger intercellulære ROS-niveauer via det mitokondrielle elektrontransportkæden. Hypoxi er en af ​​de vigtigste faktorer, der påvirker tumor initiering og progression gennem øget oxidativ DNA-skader [25]. I de senere år var overekspression af PRX1 rapporteret at spille en vigtig rolle i mange maligniteter på grund af sin kritiske rolle i patogenesen af ​​hypoxi. I lungecancerceller, kan hypoxi /reoxygenering øge PRX1 ekspression ved aktivering nuklear faktor erythroide 2-relateret faktor 2 (Nrf2), en vigtig transskriptionsfaktor involveret i oxidant stress [26]. Tabet af PRX1 ekspression kan forbedre følsomheden for oxidanter og dermed øge ROS produktion og oxidativ DNA-beskadigelse [27]. I den foreliggende undersøgelse, mRNA og protein ekspression af PRX1 var opreguleret i SCC15 celler ved enten hypoxi (4 h, 12 h), enten enkeltvis eller efterfulgt af reoxygenering (2 timer). I en anden undersøgelse rapporteret af Kim

et al.,

PRX1 var kun opreguleret ved hypoxia /reoxygenering, men ikke af hypoxi alene [27]. Vi fandt, at SCC15 celler er stadig hypoksiske efter 2 timer reoxygenering behandling, hvilket indikerer, at PRX1 stadig kunne induceres af hypoxi, selv efter 2 timer reoxygenering behandling. Vores resultat viser, at hypoxi er tæt forbundet med overekspression af PRX1 i OSCC. Opreguleringen af ​​PRX1 øger cellernes evne til at fjerne ekstra ROS og beskytte tumorceller, og som kan forstærke tumorprogression og reducere virkningsfuldheden af ​​kemo- og radiotherapies.

En nylig undersøgelse viste, at i Hela-celler , cytoplasmatisk PRX1 ændret cytoplasmatisk NF-KB translokation ind i kernen. Nuclear PRX1 regulerer NF-KB /DNA-binding gennem eliminering af H

2O

2 [23]. Wang

et al.

Rapporterede, at PRX1 interagerer med NF-KB på DNA-niveau og formentlig modulerer dens transkriptionsaktivitet i brystcancerceller [10]. Som en potent antioxidant, HO-1 letter tumorprogression på en vævsspecifik måde. Studier har indikeret, at NF-KB inducerer ekspression af HO-1 i tumorvæv [28] – [31]. Desuden talrige undersøgelser antydet en direkte forbindelse mellem NF-KB og HO-1, men funktionen af ​​NF-KB i reguleringen HO-1 ekspression i humane celler er kontroversiel [32] – [35]. I denne undersøgelse viste vores data, at hypoksi inducerer PRX1 og NF-KB, og PRX1 regulerer HO-1 via aktivering NF-KB.

PRX1 er for nylig blevet identificeret som en endogen ligand for toll-like receptor (TLR ) ligander [36]. I normoksiske betingelser, kan PRX1 forøge ekspression af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) via induktion af hypoxia-inducible factor 1-alfa promotoraktivitet gennem PRX1: TLR4 interaktion. Denne proces medieres af NF-KB. NF-KB interagerer med VEGF-promotoren er imidlertid ikke påkrævet for PRX1, hvilket antyder, at NF-KB kan regulere VEGF uden PRX1 induktion [37]. PRX1 og HO-1 er begge karakteriseret som oxidativ stress-inducerbare og hæm-relaterede proteiner. PRX1 har hæm-bindende aktivitet. Den thiol-specific antioxidant aktivitet af PRX1 kan inhiberes af hæm. Co-ekspression eller co-induktion af PRX1 og HO-1 er blevet observeret i nogle væv eller celler, hvilket indikerer, at PRX1 og HO-1 proteiner kan co-lokalisere og interagere at udstille antioxidant aktiviteter [15]. Undersøgelser har vist, at ekspressionen af ​​HO-1 er hovedsagelig opreguleret af Nrf2. Nrf2 er også en af ​​de vigtigste transkriptionsfaktorer for PRX1 genekspression i hypoxiske cancerceller. For første gang rapporterer vi at PRX1 og HO-1 kunne have en negativ regulering forhold i en indirekte måde. De præcise molekylære mekanismer, skal imidlertid bekræftes og undersøges i fremtiden undersøgelse.

I OSCC xenograftmodel, vi fundet lignende resultater, betydelig forhøjelse af HO-1 halter bagefter PRX1. Under hypoxiske tilstand og oxidativ DNA-skade, er PRX1 og HO-1 opreguleres og NF-KB-DNA-bindingsaktivitet forøges. Vores data tyder på, at PRX1 spiller antioxidative rolle ved at aktivere NF-KB og regulering HO-1 i hypoxi-relaterede OSCC progression. Afslutningsvis fandt vi, at hypoxi spiller en vigtig rolle i OSCC gennem regulering PRX1 /NF-KB /HO-1-signalering pathway. Vores undersøgelse giver en systematisk undersøgelse af PRX1 i cellesystemer og xenograft model af OSCC, der hver har specifikke fordele for biomarkør forskning. Yderligere undersøgelser af funktionelle rolle af PRX1 i mundtlig carcinogenese er berettiget. Oplysninger fra denne undersøgelse kan være nyttige i at udvikle kemopreventive /terapeutiske midler rettet mod PRX1.