PLoS ONE: proteomiske Profilering af en musemodel for æggestokkene Granulosa celle tumor Identificerer VCP som et meget følsomt Serum Tumor Marker i flere humane Cancers

Abstrakt

Det oprindelige formål med denne undersøgelse var at identificere nye serum diagnostiske markører for det humane ovarie granulosa celle tumor (GCT), en tumor, der udgør op til 5% af alle ovariecancere. For at omgå mangel på humane væv til rådighed for analyser, vi brugte den

Ctnnb1

tm1Mmt /+;

PTEN

tm1Hwu /tmiHwu;

Amhr2

TM3 (CRE) Bhr /+ transgen musemodel, som har den konstitutive aktivering af CTNNB1 signalering kombineret med tabet af

PTEN

i granulosaceller og udvikler GCT’er der efterligner aggressive former af den humane sygdom. Proteomisk profilering ved massespektrometri viste, at vinculin, enolase 1, flere varmechokproteiner, og valosin indeholder protein (VCP) blev mere rigeligt udskilles af dyrkede mus GCT celler i forhold til den primære dyrkede GC. Blandt disse proteiner, kun VCP var til stede i signifikant forhøjede niveauer i den præoperative serum af GCT kræftpatienter sammenlignet med normale personer. For at bestemme specificiteten af ​​VCP blev serumniveauer også målt i ovariekarcinom non-Hodgkins lymfom og bryst, colon, pancreas, lunge, og prostatacancer. Forhøjede serum VCP niveauer blev observeret i de fleste kræfttilfælde, med undtagelse af patienter med lunge- eller prostatacancer. Desuden blev serum VCP-niveauer steg i nogle GCT, ovariecancer, brystcancer, og tyktarmskræft patienter, som ikke på anden måde vise forhøjede niveauer af udbredte serum tumormarkører for deres kræft type (f.eks inhibin A, inhibin B, CA125, CEA, eller CA15.3). Disse resultater viser den potentielle anvendelse af VCP som yderst følsomme serum markør for GCT samt flere andre menneskelige kræftformer

Henvisning:. Laguë MN, Romieu-Mourez R, Bonneil É, Boyer A, Pouletty N, Mes- Masson AM, et al. (2012) proteomiske Profilering af en musemodel for æggestokkene Granulosa celle tumor Identificerer VCP som et meget følsomt Serum Tumor Marker i flere humane kræftformer. PLoS ONE 7 (8): e42470. doi: 10,1371 /journal.pone.0042470

Redaktør: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: 13. april, 2012; Accepteret: 9 juli 2012; Udgivet: 1. august, 2012 |

Copyright: © Laguë et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette projekt blev støttet af driftstilskud MOP-102.508 fra den canadiske Institutes of Health Research og Canada Research Chair i æggestokkene Molekylærbiologi og Functional Genomics. The University of Virginia Center for Forskning i Reproduction ligand-analysen og analyse Core er støttet af National Institutes of Health NICHD (SCCPRR) Tilskud U54-HD28934. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Serum markører er af stor værdi for den kliniske screening, diagnose og opfølgning af kræft. En ideel markør bør have høj følsomhed og /eller høj specificitet med henblik på at skelne cancerpatienter fra raske forsøgspersoner og fra patienter med benigne tumorer eller ubeslægtede betingelser. Mest anvendte serummarkører er hormoner, glycoproteiner eller andre proteiner overudtrykt af cancerceller. Disse markører er normalt ikke specifikke for en unik cancer type og mangler undertiden følsomhed [1]. Adskillige strategier er for nylig blevet foreslået at identificere nye serum tumormarkører [2]. Differential proteomikanalyser af serumprøver fra kræftpatienter og raske forsøgspersoner er tilgange af valg, men er hæmmet af mangel på materiale i sjældne kræftformer samt ved vanskeligheden ved at opdage proteiner, som udtrykkes på et lavt niveau i forhold til rigelige normale serum proteiner. En alternativ fremgangsmåde i to trin involverer indledende identifikation af proteiner, som udtrykkes differentielt og /eller secernerede mellem normale celler og tumorceller, efterfulgt af identifikationen af ​​disse proteiner i serum fra cancerpatienter. Denne tilgang ideelt kræver isolering af primære tumorceller og tilsvarende normale celler. I denne forbindelse kan anvendelsen af ​​relevante dyremodeller for tumorudvikling indeholde vigtige udgangsmaterialer til proteomisk eller genomisk analyse, og føre til identifikation af tumor-specifikke kandidat-proteiner eller gener, hvis ekspression kan derefter blive undersøgt i humane prøver, som påvist i kræft i æggestokkene [3], [4], [5].

æggestokkene granulosa celle tumor (GCT) er den mest udbredte af køn ledningen /stromale undergruppe af ovarietumorer hos kvinder, og menes at udgøre op til 5% af alle ovariecancere. I de seneste år har vores gruppe fokuseret på belysning af den molekylære ætiologi menneskelige GCT, samt om oprettelse af relevante dyr GCT modeller. Vi fandt beviser for, at fejlagtig regulering af både WNT /CTNNB1 (ß-catenin) og PI3K /forekomme AKT signalveje i menneskelig GCT [6], [7]. Transgene mus med konstitutiv aktivering af CTNNB1 i granulosaceller (GC,

Ctnnb1

tm1Mmt /+;

Amhr2

TM3 (CRE) Bhr /+) udvikle forstadier æggestokkene læsioner, ofte fremskridt i GCT senere i livet [6]. Tabet af PI3K /AKT signalering antagonist gen

PTEN

i GC sjældent forårsager GCT, men samtidig aktivering af CTNNB1 og tab af

PTEN

i

Ctnnb1

tm1Mmt /+;

PTEN

tm1Hwu /tm1Hwu;

Amhr2

TM3 (CRE) Bhr /+ (CPA) modelresultater i udviklingen af ​​aggressive, metastatisk GCT med 100 % penetrans [7]. Vi har foreslået, at CPA musen er den bedste model i øjeblikket tilgængelig for analyse af GCT biologi samt prækliniske dyreforsøg formål at udvikle nye terapeutiske indgreb og /eller diagnostiske værktøjer.

Vi hypotese, at CPA mus model kan anvendes til identifikation af differentielt udtrykte, GCT-associerede proteiner, og at disse ville oversætte til klinisk anvendelige hidtil ukendte serum diagnostiske markører for den humane sygdom. Her præsenterer vi en differentieret secretome analyse sammenligner primær kulturperler GC fra normale mus til GCT celler fra CPA mus. Denne tilgang har ført til identifikation af vasolin indeholder protein (VCP) som en potentielt klinisk relevant serum markør for humane GCT, såvel som for andre former for kræft.

Resultater

Identifikation af proteiner udskilt selektivt i mus GCT

proteomiske profilering blev brugt med det formål at identificere udskilte proteiner, der kunne repræsentere nye serum diagnostiske markører specifikke for GCT. Brugte dyrkningsmedier blev opnået fra dyrkede GCT celler fra CPA mus eller fra normal GC fra EKG-stimulerede æggestokke. Proteiner fra medierne blev separeret ved SDS-PAGE og fjorten proteinbånd observeret i GCT men ikke i GC-medium blev udsat for massespektrometrianalyse (figur 1). Denne proces er identificeret en række proteiner, der var mere rigeligt udskilles eller udgydt af GCT celler i forhold til normal GC (Tabel 1). VCL, ENO1, flere varmechokproteiner (HSPA8 /hsc70, de konstitutive og inducerbare HSP90 alfa isoformer HSP90ab1 og HSP90aa1, og HSPA4), og VCP var de mest konsekvent identificeret proteiner fra GCT secretome.

Prøver blev adskilt med 10% SDS-PAGE efterfulgt af sølvfarvning. Pile viser eksempler på proteiner, der udtrykkes selektivt i GCT celledyrkningsmedier, sammen med omtrentlige molekylvægte. I alt 3 geler med forskellige acrylamid indhold blev undersøgt og 14 bånd (med proteiner fra 12 til 116 kDa) blev udsat for massespektrometrianalyse. Kun én af de 3 geler er vist på figuren.

VCP er et serum markør for GCT og andre kræfttyper

Vi næste undersøgt, om de proteiner, der udskilles af GCT celler fra CPA mus kunne tjene som serum markører i humane GCT patienter. Humane homologer af ni proteiner identificeret i de secretome analyser (B2M, CTSB, HSPA4 /HSP70, HSP90, SPARC, TIMP-2, VCP, VCL og WIF-1) blev udvalgt til yderligere undersøgelse baseret på kendte gen funktioner og antistof tilgængelighed. Serumprøver blev opnået fra raske frivillige og fra patienter med GCT før behandling. Ingen signifikante forskelle i niveauerne af B2M, CTSB, HSP90, SPARC, TIMP-2, VCL eller WIF-1 blev observeret ved immunoblot analyser i serum fra GCT patienter sammenlignet med raske forsøgspersoner (data ikke vist). Marginalt forhøjede niveauer af HSP4A blev observeret i serum fra nogle GCT patienter sammenlignet med normale individer, men forskellene var ikke statisk signifikante, og anses ikke at have klinisk nyttigt (figur 2A). VCP var lavt i immunoblot analyser af serumprøver fra raske personer, men blev forøget betydeligt i de fleste serumprøver fra GCT patienter (

P

0,05). Med en referenceværdi for VCP niveauer, der på middelværdien af ​​immunoblot band intensitetsværdier for de raske kontroller plus to gange standardafvigelsen, observerede vi, at 8 ud af 9 kvinder med GCT de viste forøget serum VCP niveauer (figur 2B, Tabel 2). For at bestemme specificiteten af ​​VCP som tumormarkør for GCT blev serum VCP niveau vurderet hos patienter med ovariecarcinomer samt i små grupper af patienter med større ikke-ovariecancere med kendt histologi og bedømmelse (tabel 3). Overraskende fandtes forhøjede serum VCP-niveauer detekteret i klinisk signifikante andele af patienter med ovariecancer (8 af 8), brystcancer (5 af 12), colon cancer (7 af 12), pancreascancer (8 af 12) eller ikke-Hodgkins lymfom (5 af 12) (figur 2B og tabel 3). Imidlertid blev serum VCP niveauer, der ikke meningsfuldt øget hos patienter med lunge eller prostatakræft.

(A) HSPA4 niveauer i serum hos kvinder med GCT eller ovariecancer. Lige store mængder serumprotein blev separeret ved SDS-PAGE og blev underkastet immunoblotanalyse for HSPA4 niveauer (repræsentative blots er vist i toppanelet, hver bane repræsenterer en enkelt donor). Densitometri analyser af signaler opnået med HSPA4 immunoblot analyser i en afbildning, hvori hver prik repræsenterer en enkelt donor (bund, vandrette bar = middel). Ingen signifikant forskel i HSPA4 niveauer blev påvist blandt grupper ved envejs ANOVA. (B) VCP niveauer øges i serum hos kræftpatienter. Sera blev analyseret som i (A) for tilstedeværelse af VCP hos patienter med bryst-, tyktarms-, lunge-, pancreas- eller prostatacancer, ovariecancer, GCT, eller non-Hodgkins (NH) lymfom. Statistisk signifikante forskelle (

P

0,05). Blev påvist mellem kontrolgruppen (normal) og GCT og tyktarmskræft grupper Vejviser

specificitet og følsomhed VCP i forhold til udbredte serum diagnostiske markører

Vi næste sammenlignet relevansen af ​​VCP til andre almindeligt anvendte serum diagnostiske markører for forskellige kræftformer. I øjeblikket er de mest anvendelige serum- markører for GCT hos postmenopausale kvinder inhibin A og inhibin B [8]. I vores kohorte blev inhibin A og inhibin B serumniveauer øges i 5 ud 9 og 7 af 9 patienter med GCT (tabel 2), henholdsvis. Der var ingen klar korrelation mellem præoperative niveauer af inhibin A, inhibin B og VCP i GCT patienter, ikke desto mindre en patient havde upåviselige serumniveauer af inhibin A og inhibin B, men stærkt forøgede niveauer af VCP (tabel 2). Følsomheden af ​​VCP synes derfor at sammenligne positivt til den for de inhibiner, og VCP kunne tjene til at identificere sjældne inhibin-negative GCT patienter. Serum CA125 er forøget i ca. 50% af kvinder med tidlig ovariecancer og i over 80% af kvinder med fremskreden sygdom og er nyttig til monitorering terapi [9]. I vores lille ovariecarcinom kohorte, 4 af 8 patienter blev testet positive for CA125, mens VCP måling opdaget kræft hos alle patienter, herunder dem, negativ for CA125 (figur 3). CEA er den mest udbredte serum tumormarkør for tyktarmskræft. Serum CEA er forhøjet i mindre end 25% af tidligt tyktarmskræft og 75% af sen-fase kræft og er nyttig til bestemmelse af prognosen, overvågning terapi og overvågning [10]. I de 12 patienter med tyktarmskræft, som vi testede, 5 var positive for CEA. VCP måling detekteret cancer hos alle CEA-positive patienter, der ud over to, der var CEA-negative (figur 3). CEA og CA15.3 er de mest almindeligt anvendte serum markører for brystkræft. Vurdering af disse markører anbefales ikke til prognose, men snarere for postoperativ opfølgning samt overvågning i avancerede sygdomme [10]. I 12 tilfælde kohorte, vi undersøgte, 3 patienter blev testet positive for enten CEA eller CA15.3, mens resten negative for begge. VCP-niveauer var forhøjet i alle tre patienter, der var CEA eller CA15.3-positive, og også hos tre patienter, der var negative for begge markører (figur 3). Således blev VCP serumniveauer steget betydeligt i de fleste af de testede kræftpatienter, herunder i nogle ellers negativ for etablerede serum tumormarkører.

Sera fra patienter blev testet for VCP niveauer ved immunoblot analyser og den stiplede linje viser VCP cutoffværdier etableret i raske donorer. Derudover blev sera testet ved ELISA for tilstedeværelse (+) eller fravær (-) af øgede niveauer af CA125 i ovariekarcinom CEA i coloncancer, eller CEA og CA15.3 i brystcancer. De normale intervaller af CA125, CEA, og CA15.3 er under 35 U /ml, 7 ug /l, og 29 kU /l.

Diskussion

VCP protein er en AAA + ATPase i forbindelse med diverse cellulære aktiviteter. VCP er nødvendige for opretholdelsen af ​​cellulær protein homeostase og regulerer ekspressionen af ​​proteiner involveret i mange funktioner, såsom DNA-replikation, mitose, proteinnedbrydning, endocytose, membranfusion, og organel biogenese. Konkret VCP virker på ubiquitinerede substrater molekyler og regulerer protein omsætning ved at balancere proteosomal nedbrydning af opløselige proteiner eller fejlfoldede proteinaggregater lokaliseret i ER lumen eller cytosolen. Afhængig konformationel nyttiggørelse af komplekser med VCP og target proteinsubstrater, VCP enten fremmer deres nedbrydning, udskiller dem fra store proteinkomplekser, eller modulerer deres ubiquitinering af konkurrerende ubiquitin konjugering og dekonjugering machineries (revideret i [11]). VCP associerede med mange ubiquinated substrater og funktioner VCP i forskellige celletyper vedrører dels til den specifikke væv udtryk for substrater og co-faktorer. I neuroner og muskelceller, VCP interaktion med NF-1, UNC45b, og caveolin-3 regulerer synaptogenese og myofibrogenesis (gennemgået i [12]). Nogle autosomale dominante mutationer i VCP genet årsagen inklusion krop myopati med Paget sygdom af knoglerne og frontotemporal demens (IBMPFD), som er en sjælden, sen alder debuterende arvelig degenerativ lidelse, der kan påvirke muskler, knogler og hjerne [13]. Ud over væsentlige funktioner i homeostase blev VCP vist at regulere halveringstid og niveauer af flere proteiner med kræft-modulerende funktioner. For eksempel VCP i samarbejde med flere ubiquitin ligaser regulerer omsætning på IkappaB [14], HIF-1 [15], p53 [16], eller ErbB3 [17]. Mutationer og /eller fejlagtig regulering af VCP funktioner i cancerceller stadig ikke godt karakteriseret, som er deres mulige sygdomsfremkaldende effekter i tumorigenese. Ikke desto mindre er overekspression af VCP er for nylig blevet dokumenteret

in situ

i en bred vifte af menneskelige typer kræft, og analyser af store patientkohorter viste signifikant forøgede ekspressionsniveauer af VCP med tumorceller ofte korrelerer med sygdomsprogression [18] [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25]. Men den foreliggende rapport er den første til at identificere forøgede VCP-niveauer i serum fra cancerpatienter.

Tilsammen vores resultater viser, at VCP repræsenterer en meget følsom, potentielt klinisk nyttigt serum tumormarkør for en række humane cancere. Selv om dens manglende specificitet for en enkelt cancer typen antyder, at det er usandsynligt, at VCP serum måling kan anvendes som et screeningsværktøj, dens følsomhed ækvivalent eller overlegen i forhold til mange almindeligt anvendte markører indikerer at den kunne anvendes i applikationer såsom overvågning behandlingseffekt eller sygdomskontrol tilbagefald. Endvidere kunne VCP anvendes til diagnose i forbindelse med mere kræft typespecifikke markører for at øge den samlede sensitivitet. Screening af meget større årgange vil være forpligtet til at bestemme følsomheden af ​​serum VCP måling til påvisning af forskellige stadier af kræft progression, og forskellige cancer undertyper. Endvidere vil specificitet VCP med hensyn til påvisning af neoplastiske vs ikke-neoplastisk sygdom skal vurderes før dens anvendelighed som en tumor markør kan fastsættes endeligt. Som immunblotting er begrænset både med hensyn til quantitativeness og teknisk muligt, vil storstilet screening kræver udvikling af en high-throughput ELISA assay for VCP.

Sammenfattende vores resultater viser, at proteomisk profilering af tumor secretomes fra klinisk relevante musemodeller kan føre til identifikation af kandidat cirkulerende proteiner associeret med tumorgenese hos mennesker. Vi rapporterer, at VCP overudtrykkes i serum hos kræftpatienter, og at det kan udgøre en ny klinisk anvendelig markør til påvisning af kræft.

Materialer og Methods

Mice

Ctnnb1

tm1Mmt/+;

Pten

tm1Hwu/tm1Hwu;

Amhr2

tm3(cre)Bhr/+ (CPA) transgene mus blev dannet som beskrevet tidligere [7] og holdt på en C57BL /6 genetisk baggrund. I disse mus, konstitutiv aktivering af CTNNB1 signalering skyldes sletning af tredje exon af

Ctnnb1

, hvilket resulterer i produktionen af ​​en dominerende-stabilt CTNNB1 mutant protein, der mangler de phosphoryleringssteder nødvendige for dens proteosomal nedbrydning [ ,,,0],6]. CPA mus udvikler GCT perinatalt og dø inden 8 uger [7]. Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg og var i overensstemmelse med den USPHS Politik om Humane Pleje og anvendelse af forsøgsdyr.

Cell kultur

Normalt GC blev isoleret ved hjælp af metoden beskrevet af Zeleznik et al. [26]. Kort fortalt blev umodne (23-26 dage gamle) C57BL /6 mus injiceret I.P. med 5 IU heste choriongonadotropin (EKG, Folligon, Intervet, Schering-Plough) for at inducere follikulær vækst. Otteogfyrre timer senere blev dyrene aflivet, og ovarierne punkteres med en 25-gauge nål til gratis GC’er i mediet (0,9% NaCl). Cellesuspensionen blev centrifugeret ved 1.000

g

i 5 minutter og resuspenderet GC blev udpladet i 24-brønds plader ved 70% konfluens i DMEM /F12-medium (Sigma Aldrich) suppleret med 5% FBS (Invitrogen), penicillin og streptomycin (P /S). GCT den 21.-25 dage gamle CPA-mus blev udskåret, hakket med en størrelse 10 skalpelblad og spaltet i 2 timer med 0,1% collagenase fra

Clostridium histolyticum

(Sigma) i serumfrit DMEM med P /S . Celler blev derefter centrifugeret ved 1.000

g

i 10 minutter og resuspenderet i DMEM suppleret med 10% FBS og P /S før udpladning i 100 mm celle dyrkningsskåle (25 × 10

6 celler /skål) .

Differential secretome analyser

Fireogtyve timer efter udpladning, dyrket GC og GCT cellerne blev vasket med HBSS (Invitrogen) og inkuberet i 24 timer i serum-frit DMEM. Supernatanter blev opsamlet og opkoncentreret 80-fold under anvendelse af Amicon Ultra-4 centrifugal filterenheder (Millipore) med et 3 kDa molekylvægt cut-off. Proteinkoncentrationer blev kvantificeret ved anvendelse af fremgangsmåden ifølge Bradford (Bio-Rad protein assay) og 4-6 ug proteinprøver blev adskilt ved SDS-PAGE. Efter sølvfarvning, proteiner bands fundet i GCT men ikke i GC-prøver (n = 14) blev udskåret fra gelen. Gelskiverne affarvet med 50% methanol derefter reduceret i 10 mM DTT i 1 time ved 56 ° C og alkyleret i 55 mM chloracetamid i en time ved stuetemperatur. Efter vask i 50 mM ammoniumbicarbonat blev gelstykkerne skrumpet i 100% acetonitril (ACN). Fordøjelse blev udført under anvendelse af trypsin i 50 mM ammoniumbicarbonat i 8 timer ved 37 ° C. Peptiderne blev endelig ekstraheret i 90% ACN /0,5 M urinstof og tørret i en speed vakuum. Prøver blev resolubiliseres i 5% ACN med 2% myresyre (FA) og separeret på en hjemmelavet C

18 søjle (150 um x 10 cm) under anvendelse af en Eksigent nanoLC-2D system. En 56-min gradient fra 5-60% ACN (0,2% FA) blev anvendt til at eluere peptiderne fra en hjemmelavet omvendt fase søjle (150 um i.d. x 100 mm) med en strømningshastighed andrager 600 nanoliter /min. Kolonnen blev direkte forbundet til en NanoProbe interface med en LTQ-Orbitrap Velos massespektrometer (Thermo-Fisher). Hver fulde MS-spektrum blev efterfulgt af tolv MS /MS spektre (tretten scan hændelser), hvor de tolv mest rigelige formere ladede ioner blev udvalgt til MS /MS sekventering. Tandem MS eksperimenter blev udført under anvendelse af kollision-induceret dissociation i den lineære ionfælde. Dataene blev behandlet ved hjælp af 2,1 Mascot (Matrix Science) søgemaskine med tolerance parametre til 15 ppm og 0,5 Da for forstadiet og fragmentionerne henholdsvis. De valgte variable ændringer var carbamidomethyl (C), deamidering (NQ), oxidation (M) og phosphorylering (STY). Den valgte database var menneskelig IPI database v.3.54 med 150858 sekvenser.

Serumprøver

Serumprøver fra patienter med bryst-, tyktarms-, lunge-, pancreas eller prostatacancer, eller non-Hodgkins lymfom ( n = 12 for hvert cancer type) blev opnået fra Ontario Tumor Bank. Serumprøver fra raske frivillige (n = 7) og patienter med GCT (n = 9) eller ovariecarcinom (n = 8; 2 clear cell, 2 serøse, 2 mucinøs og 2 endometrioide ovariecancere) blev opnået fra Réseau de Recherche DU kræft du Fonds de recherche Québec – Santé. Procedurer blev godkendt af Forskningsudvalget den FRQS-RRCancer og Ontario Cancer Research Ethics Board, samt Comité d’éthique de la recherche sur les sujets humains af Centre Hospitalier de l’Université de Montréal. Inhibin A og inhibin B-niveauer blev bestemt ved ELISA på University of Virginia Center for Forskning i Reproduction ligand-analysen og Analyse Core. Værdier for inhibin A og B under detektionsgrænsen (13 ng /l og 20 ng /l) blev defineret som normalt. CA15.3 og CEA niveauer blev bestemt af Les Laboratoires du Centre Hospitalier de l’Université de Montréal. Værdier under 7 ug /l og 29 kU /L for CEA og CA 15.3, henholdsvis blev betragtet normal. CA125-niveauer blev bestemt ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt ELISA-assay kit og niveauer blev betragtet som normalt, når under 35 U /ml (Abnova).

immunoblotanalyser

serumprøver (4 pi dvs. ca. 200 mg ) blev separeret ved SDS-PAGE på 10% acrylamidgeler. Gelerne blev overført til polyvinylidenfluorid membraner (GE Amersham /VWR). Immundetektion blev udført med HSPA4- eller VCP-specifikke antistoffer (kloner ab75977 eller ab11433 henholdsvis Abcam) og peberrodsperoxidase-konjugeret sekundære antistoffer (GE Amersham /VWR) og afslørede anvendelse af ECL Detection Reagents (GE Amersham /VWR). Kvantificering af proteinbåndene blev udført ved densitometri analyser under anvendelse af en Kodak Image Station 440CF og Kodak 1D v.3.6.5 software (Eastman Kodak, Rochester, NY). For at normalisere VCP eller HSPA4 proteinniveauer mellem immunblots, hver gel indeholdt to eller tre fælles serumprøver som referencer. Referenceværdien for VCP blev fastsat som gennemsnittet af sunde kontrol band intensiteter i immunoblotanalyser + 2SD.

statistiske analyser

En-vejs ANOVA med Dunnetts post-test blev anvendt til at sammenligne VCP niveauer hos raske kvinder og kræftpatienter.

tak

forfatterne takker Meggie Girard, Kathleen Theroux, Jennifer Kendall-Dupont, og Manon de Ladurantaye for deres teknisk hjælp og Ontario Tumor Bank (Jeanette Joanes ) og Réseau de recherche du kræft du Fonds de la Recherche en Santé du Québec for at levere sera fra kræftpatienter og normale individer.