PLoS ONE: Cycloart-24-en-26-ol-3-on, en New Cycloartane Isoleret fra blade af Aglaia exima Triggers tumornekrosefaktor-receptor 1-medieret caspase-afhængig apoptose i coloncancercellelinie

Abstrakt

Planter i MELIACEAE familien er kendt for at besidde interessante biologiske aktiviteter, såsom antimalaral, antihypertensive og antitumor aktiviteter. Tidligere vores gruppe rapporterede planten-afledte sammensatte cycloart-24-en-26-ol-3-on isoleret fra hexan ekstrakter af

Aglaia exima

blade, som viser cytotoksicitet mod forskellige cancer cellelinjer, især , coloncancer-cellelinjer. I denne rapport, vi yderligere vise, at cycloart-24-en-26-ol-3-on, herfra videre kendt som cycloartane, reducerer levedygtigheden af ​​tyktarmskræft cellelinjer HT-29 og Caco-2 på en dosis- og tidsafhængig måde. Yderligere belysning af forbindelsens mekanisme viste, at det binder til tumornekrosefaktor-receptor 1 (TNF-R1), der fører til initiering af caspase-8 og, gennem aktivering af Bid, i aktiveringen af ​​caspase-9. Denne aktivitet forårsager en reduktion i mitochondriemembranpotential (MMP) og frigivelse af cytochrom-C. Aktiveringen af ​​caspase-8 og -9 begge virke til at begå kræftcellerne til apoptose gennem nedstrøms caspase-3/7-aktivering, PARP-spaltning og manglen på NFkB translokation til kernen. En molekylær docking undersøgelse viste, at cycloartane binder til receptoren via en hydrofob interaktion med cystein-96 og hydrogenbindinger med lysin-75 og -132. Resultaterne viser, at yderligere udvikling af cycloartane som en anti-cancer stof er værd

Henvisning:. Leong KH, Looi CY, Loong X-M, Cheah FK, Supratman U, Litaudon M, et al. (2016) Cycloart-24-en-26-ol-3-on, en New Cycloartane Isoleret fra blade af

Aglaia exima

Udløser tumornekrosefaktor-receptor 1-medieret caspase-afhængig apoptose i coloncancercellelinie . PLoS ONE 11 (4): e0152652. doi: 10,1371 /journal.pone.0152652

Redaktør: Ruby John Anto, Rajiv Gandhi Center for Bioteknologi, INDIEN

Modtaget: April 26, 2015; Accepteret: 17 marts 2016; Udgivet: 12 April, 2016

Copyright: © 2016 Leong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af University of Malaya [tilskud RP001 /2012A, RP001A-13BIO]; University Malaya High Impact Research [tilskud H-20001-E00002]; og Ministeriet for Videregående Uddannelser Malaysia [give FP006-2011A]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en invaliderende sygdom, der påvirker en væsentlig del af verdens befolkning, og det er faktisk et globalt sundhedsproblem. Kolorektal cancer er stadig en af ​​de mest udbredte kræftformer blandt patienter i USA, som udgør 8% og 9% af alle kræfttilfælde for mænd og kvinder, henholdsvis [1]. På trods af de seneste fremskridt i kræft behandlinger, såsom udvikling af målrettet terapi [2], de relative overlevelsesrater for patienter med tarmkræft har ikke forbedret væsentligt [3]. Desuden kemoterapi under anvendelse af syntetiske stoffer ofte forårsager bivirkninger, såsom hårtab, blødning, diarré og myelotoksicitet [4]. Forskere fortsætte med at søge efter nye terapeutiske midler, der er mere selektive over for cancerceller og som genererer færre bivirkninger.

Planter fortsat en af ​​de største kilder til naturlige produkter, der bruges til at opdage nye kemoterapeutiske stoffer [5-6 ]. Især blev nogle nye forbindelser opdaget fra planter, der havde unikke virkningsmekanismer, større styrke eller lavere bivirkninger end aktuelt anvendte lægemidler [7]. I samarbejde med franske institutioner for at søge efter nye lægemidler lægemidler, vi udførte foreløbig phytochemical profilering af anlægget

Aglaia exima

. Aglaia er den største slægt af MELIACEAE familien, og Aglaia træer almindeligvis vokser i tropiske og subtropiske skove i Kina, Indo-malaysiske og Stillehavsøerne. Aglaia tree dele (blade, blomster og spiselige frugter) har flere medicinske egenskaber, såsom anti-inflammatoriske, anti-cancer, anti-diabetiske egenskaber. Seks triterpenoids og to steroider er tidligere isoleret fra bladene af

Aglaia exima

ved vores gruppe. Tidligere viste vi, at den nye cycloartane udviste den højeste cytotoksiske virkning på tyktarmskræft cellelinien HT-29 i alle de forbindelser isoleret fra

Aglaia exima

fra vores gruppe, med en IC

50 på 11,5 pM [8]. Interessant, tidligere undersøgelse rapporteret cycloartane fra

Aglaia

arter vises 10 gange selektivitet mod tyktarmskræft cellelinje HT-29 i forhold til normal colon cellelinje CCD-112CoN [9].

De fleste af nuværende kemoterapi narkotika udløse apoptose at forårsage kræft celledød. Apoptose er en aktiv proces med programmeret celledød, der opstår med specifikke morfologiske og biokemiske forandringer i cellerne [10]. Disse morfologiske ændringer omfatter udlægning af phosphatidylserin på celleoverfladen, membranblæredannelse, chromatinkondensering og dannelsen af ​​apoptotiske legemer [11]. Fremskridt i forståelsen af ​​signalering af apoptose har ført til to større veje for indvielse bliver bredt accepteret, nemlig ydre og indre apoptoseveje. Den ydre vej udløses gennem dødsreceptorer stede på celleoverfladen, mens indre vej er udløst af frigivelsen af ​​proapototic faktorer, såsom cytochrom c, fra cellens mitokondrier [12]. Tumornekrosefaktor receptorer, transmembrane proteiner, er blandt de kendte eksterne dødsreceptorer. Disse receptorer indbefatter to typer: tumornekrosefaktor-receptor-1 (TNF-R1) og -2 (TNF-R2). TNFR-1 udtrykkes ubikvitært i de fleste celler, hvorimod TNFR-2 hovedsagelig findes i oligodendrocytter, astrocytter, T-celler, myocytter, thymocytter, endotelceller og mesenkymale stamceller [13]. Overlevelse og dødsprocessen hovedsageligt reguleret af TNF-R1, som denne receptor indeholder et intracellulært død domæne, der ikke er til stede i TNF-R2. Når den er aktiveret, dødsdomænet rekrutterer andre death signaler, såsom TRADD, FADD og pro-caspase-8, til dannelse af en død-fremkaldende signaler-kompleks (DISC). Frigivelsen af ​​caspase 8 signaler Bud at aktivere Bax, Bad, og cytochrom C i cellens mitokondrier. Aktivering af TNR-R1 menes at forårsage metalloprotease TACE at frigive det ekstracellulære komponent af receptoren som opløselig TNF-R1 (sTNF-R1), som er en cytokin, som er i stand til at aktivere andre TNF-R1S at forøge antallet af døde signaler [ ,,,0],14].

Men de vigtigste bødler apoptotiske veje er proteaser af caspasefamilien at proteolytisk desintegrerer cellerne i form af apoptotiske legemer. Denne familie af proteaser er opdelt i bøddel caspaser, såsom caspase 3 og 7, og initiator-caspaser, såsom caspase 8 og 9. Initiator caspase-8 vides at blive aktiveret gennem dødsreceptorer, hvorimod caspase-9 aktiveres af cytokrom c lækage fra mitokondrierne. Disse initiator caspaser føre til nedstrøms aktivering af caspase 3 og 7, forpligter cellen til apoptotisk død. I modsætning til nekrose, apoptose er en ikke-inflammatorisk celledød pathway, hvilket har den fordel at minimere uønskede virkninger på naboceller [15]. Derfor videnskabsfolk er konstant på jagt efter små molekyler, der kan udløse apoptose i behandlingen af ​​cancer. I denne undersøgelse, vi vurderet den anti-cancer potentiale cycloartane i human coloncancercellelinie HT-29, med fokus på den apoptotiske mekanisme bag denne aktivitet.

Materialer og metoder

Cell kultur og cytotoksicitet assay

human coloncancer cellelinier (HT-29 og Caco-2) blev opnået fra American Tissue Culture Collection (Rockville, MD). Celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 50 pg /ml gentamycin og 2,5 ug /ml amphotericin B (Gibco, Carlsbad, CA) i en fugtig inkubator ved 37 ° C med en atmosfære af 5% CO

2.

cytotoksicitet cycloartane blev evalueret mod 2 tyktarmskræft cellelinier (HT-29 og CaCO-2). Cellerne blev udpladet ved en densitet på 5 x 10

3 celler per brønd i 96-brønds plader og behandles kontinuerligt med forbindelsen (0,39 til 200 uM) eller cisplatin (3,9 til 2000 uM) eller 5-fluorouracil (200 8 x 10

-6 mM) i 24, 48 og 72 timer. Cisplatin og 5-fluorouracil på mere end 99,9% renhed blev opnået fra Sigma-Aldrich. Kontrolbrønde blev behandlet med 0,05% volumen /volumen DMSO i dyrkningsmediet. Ved afslutningen af ​​behandlingen, medierne blev forsigtigt opdateres, og 20 pi MTS-reagens (CellTiter 96 AQ

ueous® One Solution, Promega, Madison, WI) blev tilsat. Pladerne blev inkuberet i 2 timer, og absorbansen blev aflæst under anvendelse af en mikropladelæser (Infinite 200, Tecan, Männedorf, Schweiz) ved 490 nm, med 690 nm som baggrund bølgelængde. Den levedygtige procentvise Cellen blev beregnet med hensyn til kontrolbrønde, og IC

50 blev bestemt under anvendelse af dosis-respons kurve ved hjælp Prism 5.02 software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA). Alle forsøg blev udført i tre eksemplarer og resultater er rapporteret som aritmetiske middelværdier ± SD

Apoptose og cellecyklus analyser

Apoptose og cellecyklus analyser blev udført separat ved hjælp af kommercielle Annexin V:. FITC Apoptose Detection kit I og CycleTest ™ Plus DNA Reagent kit, henholdsvis (BD Bioscience, San Jose, CA). Celler blev podet ved 5 x 10

5 celler per brønd i tolv brønde. Efter natten over fastgørelse blev cellerne behandlet med forbindelsen ved 12,5, 25 og 50 pM i 24 timer for apoptose analyse og ved 2,5 uM til 12, 24 og 48 timer for cellecyklus-analyse. Efter behandling blev cellerne høstet ved forsigtig trypsinering og centrifugeret ved 1500 x g i 5 minutter. Cellefarvning blev udført ifølge producentens anvisninger. En DNA QC Partikler kit blev anvendt til at kalibrere FACSCanto II flowcytometeret (BD Biosciences, San Jose, CA). Cellepopulationer blev underkastet cytometrisk analyse, og kvadranterne blev fastsat i forhold til populationen af ​​levedygtige celler i de ubehandlede prøver. FacsDiva 5.0.3 software (BD Biosciences, San Jose, CA) blev anvendt til at beregne procentdelen af ​​celler i de respektive kvadranter for apoptose analyse, og Mod Fit LT-software (Verity Software House Inc., Topsham, ME) blev anvendt til cellecyklus analyse.

Mitokondriel membranpotentialet Δѱm (MMP), cytochrom c-frigivelse analyse og NFkB translokation

En Cellomics Multiparameter Cytotoksicitet 3 Kit til MMP og cytochrom frigivelse og Nucleus Factor kappa B aktivering Kit (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) blev anvendt som tidligere beskrevet [16]. Celler blev udpladet ved 1 x 10

4 celler per brønd på plader med 96 brønde natten over. Celler blev vasket og inkuberet med forbindelsen i 24 timer ved forskellige koncentrationer (fra 3,125 til 50 uM). Som for NFkB translokationsaktivitet blev celler behandlet med 12,5 uM cycloartane alene eller 10 ng /ml TNF-α alene eller 12,5 uM cycloartane og 10 ng /ml TNF-α i kombinationsbehandling. Derefter blev cellerne fikseret med 4% formaldehyd i 15 minutter og derefter permeabiliseret med 0,1% Triton X-100 i phosphatpuffer saltvand (PBS). Efter fiksering blev cellerne inkuberet med MMP farvestof eller blokeret med 3% bovint serumalbumin efterfulgt af NFkB primære kanin antistof eller cytochrom c primære muse-antistof og derefter gede-anti-kanin sekundært antistof konjugeret med DyLight

TM 488 eller ged anti- mus sekundært antistof konjugeret med DyLight

TM 649 i 1 time hver. Cellerne blev skyllet tre gange med vaskebuffer II (1 X PBS med 1% Tween-20). Kernerne blev farvet med Hoechst 33258. Derefter blev de farvede celler visualiseret, og billederne blev taget med Cellomics ArrayScan HCS-læser ((ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). Cellen sundhed profilering bioapplication modul blev anvendt til at kvantificere fluorescens intensitet hver farvestof.

caspaseaktivitet og inhibitor assays

celler blev udpladet i hvide plader med 96 brønde ved 1 x 10

4 celler per brønd og lodes binde. Derefter celler blev behandlet med forbindelsen (50 uM) for forskellige tidsperioder (1, 3, 6, 12, 18, 24 og 30 timer). Caspase-aktivitet blev målt ved tilsætning af 50 pi af Caspase-Glo® 3/7 (Z- DEVD-aminoluciferin), Caspase-Glo® 8 (Z-LETD-aminoluciferin) eller Caspase-Glo® 9 (Z-LEHD-aminoluciferin) (Promega, Madison, WI) og derefter læse luminescensen ved anvendelse af en mikropladelæser (Infinite 200, Tecan, Männedorf, Schweiz). aktiviteterne af de enkelte caspaser blev udtrykt som gange stigninger i forhold til den ubehandlede kontrol. for inhibitoren assayet blev celler forbehandlet med 10 pM caspase 3 inhibitor (Z-DEVD-FMK), caspase 8 inhibitor (Z-IETD-FMK), caspase 9 inhibitor (Z-LEHD-FMK) eller generel caspaseinhibitor (Z-VAD-FMK) i 30 minutter. Derefter blev cellerne inkuberet med forbindelsen (50 uM) i 18 timer, og de caspase assays blev udført som beskrevet ovenfor. Efter yderligere 6 timers inkubation med forbindelsen, blev cellelevedygtighed målt ved anvendelse af MTS-reagens, som beskrevet i afsnittet cellekultur og cytotoksicitet assay.

Protein ekstraktion, protein array og western blotting analyser

i alt 1 x 10

6 celler blev behandlet med forbindelsen (50 uM) eller TNFa (10 ng /ml) som positiv kontrol for NFkB translokation, og ændringer i proteinekspression blev monitoreret over tidsintervaller på 6, 12, 18 og 24 timer. Celler blev høstet, vasket med iskoldt PBS og lyseret i M-PER buffer indeholdende Pierce 1x Halt proteaseinhibitorcocktail for totale cellulære ekstrakter eller NE-PER buffer for cellulære kerneekstrakter i NKkB eksperimenter eller Mem-PER Plus buffer til cellulær membranprotein ekstrakter i TNF-R1 eksperimenter (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). For proteinarray blev ekspressionsniveauerne af 43 apoptose-relaterede proteiner i cellelysatet bestemt under anvendelse af RayBio Humant Apoptose Array G1 kit, ifølge leverandørens protokol. Fold ændringer mellem behandlede og ubehandlede prøver blev analyseret under anvendelse af RayBio Antibody Array Analysis Tool (RayBiotech, Norcross, GA). Til Western-blot, cellelysater (20 ug protein /brønd) blev kogt i 5 minutter og derefter opløst på 12% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført elektroforetisk til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner. Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri mælk i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,5% Tween 20 (TBST) i 1 time og inkuberet med primært antistof natten over ved 4 ° C. Pakkerne blev benyttet apoptose antistof sampler kit (# 9915), pro-apoptose Bcl-2-familien antistof sampler kit (# 9942), og død receptor sampler kit (# 8356), og antistofferne anvendt var den nukleare faktor-kappa B p65 (# 8242), beta-actin (# 8457) og lamin B2 (# 13823) antistoffer (Cell Signaling, dansere, DA). Efterfølgende blev membranerne vasket med TBST-buffer og inkuberet med det passende peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (gede anti-kanin IgG) (# 7074). Membraner blev udviklet ved hjælp af en forbedret kemiluminescenskittet (Super Signal West Dura, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA).

Computational molekylær docking og statistiske analyser

X-ray krystalstruktur tumornekrosefaktor receptor 1 (TNF-R1) blev hentet fra Protein data Bank (FBF post 1NCF) og fremstillet under anvendelse af CHARM kraftfelt. Docking blev udført ved hjælp af c-DOCKER modul af Discovery Studio 4.1 software (Acceryls, San Diego, CA) for at simulere samspillet mellem stoffet og TNF-R1. Bindingen interaktion energi blev beregnet ved hjælp af

in situ

minimering værktøj til at indarbejde fleksible docking på kuperet sted efter en tidligere beskrevet protokol [17]. Statistiske analyser blev udført under anvendelse af t-test eller ANOVA med Bonferroni post-test i Prism 5.02 software til at bestemme signifikante forskelle mellem forsøgs- og kontrolgrupperne (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA), og statistisk signifikans blev defineret som p ≤ 0,05 eller p ≤ 0,01.

Resultater

Cytotoksisk effekt af cycloartane på HT-29 og CaCO-2 tyktarmskræft cellelinjer

den kemiske struktur af cycloartane er vist i figur 1. Både, HT-29 og Caco-2-celler blev behandlet med forskellige doser 0.39-200 pM af forbindelsen i 24, 48 og 72 timer. Cellelevedygtighed blev bestemt ved MTS assay. Som vist i figur 2, forbindelsen reducerede cellelevedygtigheden på en dosis- og tidsafhængig måde. Desuden IC

50 værdier af cycloartane var 3-30 gange lavere end den af ​​standarden chemodrug cisplatin (3,9 til 2000 uM) ved hver behandlingstid-punkt, 42-862 gange lavere sammenlignet med 5-fluoruracil på 24 og 48 timers tidspunkter, men 16-27 gange mere potent efter 72 timer behandling (tabel 1). IC

50 opnåede værdier blev brugt som en rettesnor for de efterfølgende eksperimenter.

Stoffet har en cyclopentano pr hydro phenanthren stillads med en cyclopropanring mellem C-9 og -10. Sidekæden bundet til C-17 har en hydroxylgruppe substituent ved C-26.

I cycloartane (0,39-200 uM) på HT-29 (A) og CaCO-2 (B) celle linjer, cisplatin (3,9 til 2000 uM) på HT-29 (C) og CaCO-2 (D) cellelinjer på 24, 48 og 72 timer, 5-fluorouracil (200-8 x 10

-6 mM) på HT-29 og Caco-2-cellelinier ved 24 (E), 48 (F) og 72 (G) timer. Signifikante forskelle er angivet: * p 0,05; ** P 0.01.

Cycloartane inducerer cellecyklusstop og apoptose i HT-29 celler

For at vurdere tilstanden af ​​celledød forårsaget af cycloartane, HT-29 kolon kræftceller blev behandlet med forbindelsen i 24 timer. Dernæst udførte vi flowcytometrianalyse af celler, der var dobbelt-farvet med annexin-V og propidiumiodid (PI). Kontrolcellerne blev behandlet med vehikel (0,1% volumen /volumen DMSO

4) og havde 99,4% cellelevedygtighed, med 0,6% af celler i apoptose. Behandling med forbindelsen ved stigende koncentrationer, fra 12,5 um til 50 pM, medført nedsat cellelevedygtighed fra 68,6% til 30,6% og en samtidig forøgelse i procentdelen af ​​apoptotiske celler fra 30,7% til 59,6% og procentdelen af ​​nekrotiske celler fra 0,7% til 9,8% (fig 3A)

(A) Procentdel af celler, der viser phosphatidylserin translokation, som målt ved celle-overflade annexin V-binding og fri PI:. celler negative for annexin V og positive for PI er nekrotisk (Q1 ); celler positive for både annexin V og PI er i sen apoptose (Q2); celler negative for både annexin V og PI (Q3) er levedygtige celler; og celler positive for annexin V og negative for PI er i tidlig apoptose (Q4). Celler blev inkuberet i 24 timer med 0,1% vol /vol DMSO

4 (vehikelkontrol) eller cycloartane ved koncentrationer på 12,5, 25 eller 50 uM, som angivet. (B) Flowcytometri histogrammer viser fordelingen af ​​celler i forskellige faser af cellecyklussen (G

1, S og G

2 /M) i begyndelsen af ​​forsøget (0 timer) og ved 12, 24 og 48 timers behandling med 2,5 uM af cycloartane. Resultatet er repræsentativt for en af ​​tre replikater der havde væsentlige lignende resultater.

Dernæst undersøgte vi cellecyklus profil af de cycloartane-behandlet HT-29-celler. Som vist i fig 3B, flowcytometri analyse viste en tidsafhængig forøgelse af celler i G

1 fase, med 45,6%, 56,8%, 64,3% og 76,2% af cellerne er i G

1 fase efter 0 , 12, 24 og 48 timers behandling, henholdsvis.

Cycloartane inducerer aktivering af caspaser 3/7, 8 og 9

caspaser spiller en central rolle i apoptose-induktion, og som vist i fig 4A, HT-29 celler behandlet med stoffet viste en kraftig stigning i aktiviteterne i caspaserne 3/7, 8 og 9 fra 6 til 12 timer. Deres aktiviteter toppede på 18 timer for caspase 9 og 24 timer for caspase 3/7 og 8, som blev efterfulgt af en faldende tendens. Pre-behandling med enten caspase 8 (Z-IED-FMK) eller en pan-caspaseinhibitor (Z-VAD-FMK) efterfulgt af cycloartane resulterede i højere cellelevedygtighed end i celler uden forbehandling. Men inhibitorer til caspase 3 (Z-DEVD-FMK) og 9 (Z-LEHD-FMK) ikke redde cellerne fra cycloartane-induceret apoptose (fig 4B).

(A) Tidsforløb ( 0-30 timer) fold stigning i caspase 3/7, 8 og 9 aktiviteter af HT-29-celler efter behandling med cycloartane (50 uM). (B) Virkninger af caspaseinhibitorer på behandlede HT-29-celler. Ændringer i caspase 3/7, 8 og 9 aktiviteter, og cellelevedygtighed af celler forbehandlede med caspase 3 inhibitor (Z-DEVD-FMK), caspase 8 inhibitor (Z-IETD-FMK), caspase 9 inhibitor (Z-LEHD -FMK) eller generel caspaseinhibitor (Z-VAD-FMK), efterfulgt af inkubation med cycloartane (50 uM). Ved 18 timers behandling blev caspase aktiviteter bestemt, og efter 24 timers behandling cellelevedygtighed blev målt. Alle resultater er tre uafhængige bestemmelser med fold stiger og procent celle levedygtighed beregnet på grundlag af den ubehandlede kontrol. Symboler angiver signifikant højere sammenlignet med 0 timer eller ingen inhibitor forbehandling: * p 0,05; ** P 0.01.

Effekter af cycloartane på apoptose signalering proteiner

Næste, vi indsamlede proteinlysater på 6, 12, 18, og 24 timer efter behandling med cycloartane og indlæst dem på RayBio Humant Apoptose Array at detektere niveauerne af 43 apoptoseinducerende proteiner. Den største stigning i proteinekspression blev set for caspase 8, som steg fra 2 til 4 gange på 12- og 18-timers tidspunkter. Caspase 3 og bud kun steg efter 18 timer af forbindelsen behandling (Fig 5A og 5B).

(A) opreguleret proteiner detekteret i human apoptose antistof array. (B) Fold ændringer af apoptose signalmolekyler i sammenligning med kontrol med en afskåret grænse på 1,5 gange. (C) Western blot-analyse af apoptotiske signaler proteiner i cycloartane behandlet HT-29-celler og TNF-α-behandlede som positiv kontrol for NFkB translokation over forskellige tidsintervaller (6, 12, 18 og 24 timer).

Hele cellelysater af celler behandlet med cycloartane blev opsamlet på forskellige tidspunkter og underkastet Western blotting-analyse. I overensstemmelse med Proteinarray resultater (fig 5A og 5B), blev tidsafhængige stigninger i Bid og spaltet caspase 3 og 8 proteiner (Fig 5C) observeret. Også, TNF-R1, FADD, og ​​TRADD protein udtryk opreguleret, indikerer, at forbindelsen inducerede det extrinsiske apoptose signalvejen gennem TNF-R1 receptor (figur 5C); sTNF-R1 blev også vist at være opreguleret af Proteinarray resultater (fig 5A og 5B). De mitokondrie-relaterede pro-apoptotiske proteiner Bax og Bad også steget markant fra 6 til 24 timer. Desuden blev ingen translokation af NFkB fra cytoplasmaet til cellekernen observeret over tid og niveauet af spaltet PARP steg over tid. Celler behandlet med 10 ng /ml TNF-α tjente som en positiv kontrol for de NFkB translokation forsøg (Fig 5C).

Cycloartane reducerer mitokondrie membran potentiale (MMP), øger cytochrom c release og NFkB translokation begivenheder

for at undersøge, om stoffet forårsager skade på mitokondrier og cytochrom c-frigivelse, vi behandlede HT-29 celler med forbindelsen i 24 timer og derefter udførte et højt indhold celle screeningsanalyse. Som vist i fig 6A, den cycloartane på 6,25 uM og 12,5 uM faldt (p 0,01) MMP. Derudover observerede vi cytochrom c-frigivelse i cytosolen af ​​HT-29 celler behandlet med 6,25 uM af forbindelsen i sammenligning med den ubehandlede kontrol (Fig 6B). Ved undersøgelsen af ​​om forbindelsen konkurrerer med den naturlige ligand, TNF-α, blev den nedstrøms NFkB translokation ind i kernen målt. I fig 6C, behandling af TNF-α (10 ng /ml) resulterede i NFkB fluorescensintensitet stigning (p 0,01) i kernen region. Men behandling med cycloartane (12,5 uM) ikke signifikant (p 0,05) øge NFkB fluorescensintensitet sammenlignet med kontrol. Kombinationsbehandling af cycloartane (12,5 uM) og TNF-α (10 ng /ml) resulterede i en signifikant (p 0,05). Fald i NFkB fluorescensintensitet sammenlignet med TNF-α behandling alene

(A) billeder og søjlediagram over mitochondriemembranpotential (MMP) falde. (B) cytochrom c lokalisering (røde pile) i kontrol- celler eller frigivelse fra cycloartane-behandlede HT29 kolon kræftceller. (C) NFkB fluorescensintensitet i cellekernen region er ens mellem kontrol og cycloartane-behandlede celler, reducerer intensiteten i kombinationsbehandling af cycloartane og TNF-α eller øge intensiteten i TNF-α alene. Billeder blev taget til fange ved 100X forstørrelse og signifikante forskelle er angivet: * p 0,05; ** P . 0.01

Undersøgelse af cycloartane docking til TNF-R1

Computerbaseret molekylær docking illustreret bindingen af ​​forbindelsen til TNF-R1 (figur 7) og afslørede en samlet bindingsenergi af – 67,032 kcal. Bindingsstedet for cycloartane på TNF-R1 er forskellig fra det aktive sted for den naturlige ligand, TNFa. Forbindelsen binder til det ekstracellulære domæne nær cellemembranen. Hydrofob interaktion blev observeret mellem en af ​​de cyclohexan og cyclopentan grupper af forbindelsen og cystein-96, og hydrogenbindinger dannes mellem hydroxyl på C-26 og carbonylgrupper ved C-3 af forbindelsen med lysin-75 og -132 af receptor, henholdsvis.

Forstørrelse viser hydrogenbinding (grøn stiplede linier) mellem hydroxyl- og carbonylgrupper af forbindelsen med lysin-75 og -132 og hydrofobe interaktioner (lilla stiplede linier) mellem cyclohexan og cyclopentan af forbindelsen med cystein-96 af receptoren.

diskussion

Vores tidligere cytotoksisk screening af et panel af cancercellelinjer viste, at cycloartane er mest cytotoksisk mod tyktarmskræft cellelinien HT 29 [8]. I denne undersøgelse har vi observeret lignende cytotoksiske virkninger i en anden human coloncancer cellelinie Caco-2. Resultaterne af MTS assays viser, at behandling med forbindelsen forårsager en dosis- og tidsafhængig reduktion af cellelevedygtighed i begge HT-29 og Caco-2-celler. Som IC

50 af forbindelsen var lavest for HT-29 cellelinien, blev udført yderligere eksperimenter i denne cellelinie.

Phosphatidylserin eksternalisering på celleoverfladen er et af kendetegnene for apoptose [15 ]. Flowcytometri undersøgelser viste en koncentrationsafhængig forøgelse af annexin-V FITC cellepopulationer sammenlignet med PI cellepopulationer, hvilket indikerer, at denne forbindelse inducerer apoptose i stedet for nekrose. Desuden blev akkumuleringen af ​​celler i G

1 fase over tiden detekteres ved flowcytometri efter cycloartane behandling. Normal cellevækst og differentiering kræver passende regulering af cellecyklussen. Dereguleret cellecykluskontrol grund af mutation, deletion og transkriptionel repression af gener, såsom FBXW7, pRB, og p53, er blevet vist at bidrage til kolorektal cancer progression [18-20]. Således inhibering cellecyklusprogression kunne stoppe ukontrolleret proliferation af coloncancerceller og få dem til at indtaste apoptose

andet kendetegn ved apoptose er aktiveringen af ​​caspaser, og der er to etablerede veje baseret på initiator-caspaser:. Den dødsreceptor pathway, der involverer caspase-8, og den mitokondrielle pathway, der involverer caspase-9 [16]. Indledning af en eller begge caspaser aktiverer bøddel caspase (caspase 3/7), som i sidste ende fører til velreguleret celle død. Inkubation med forbindelsen forårsager en tidsafhængig aktivering af caspase 3/7 fra 6

th time fremefter. Stigningen i caspase-8-aktivering var samtidig med stigningen af ​​caspase-9-aktivering, hvilket antyder inddragelsen af ​​både død receptor og mitokondriske veje i induktionen af ​​apoptose ved cycloartane. Det er dog uklart, hvilken caspase er den primære initiator baseret på tendensen af ​​caspaseaktivering. For at bestemme dette, udførte vi en caspaseinhibitor eksperiment. Caspase 8 inhibitor (Z-IETD-FMK) var i stand til at undertrykke caspase 9 og 3/7 aktiviteter, der fører til en stigning i levedygtige celler. Derfor caspase 8 er den primære initiativtager, mens caspase 9 er en sekundær mægler, der forstærker det apoptotiske signal.

Yderligere undersøgelse af apoptosecyklus ved protein array analyse viste udgivelsen af ​​opløselig tumornekrosefaktor-receptor 1 ( sTNF-R1) fra helcelleekstrakter. Aktiveringen af ​​TNF-R1 menes at forårsage metalloprotease TACE at frigive det ekstracellulære komponent af receptoren som opløselig TNF-R1 (sTNF-R1) [14], hvilket fører os til at tro, at TNF-R1 blev udløst i opstrøms begivenhed . Western blot analyse af cellulære membran ekstrakt af de behandlede celler bekræftede opreguleringen af ​​TNF-R1. TNF-R1 hører til døden receptorfamilie, og den cytoplasmatiske hale af TNF-R1 indeholder en dødsdomæne (DD), som er afgørende for induktion af apoptose [21, 22]. Undersøgelser viste, at TNF-R1 aktiverer apoptotiske program ved sekventiel rekruttering af adapteren proteinet TRADD, den TRADD-interagerende adapter protein FADD og FADD-lignende ICE protein (FLICE, også kaldet pro-caspase-8) til dannelse af død-fremkaldende signalering kompleks (DISC) [23, 24]. Aktivering af TNF-R1-receptoren ved lægemidler har vist sig at forøge behandling effektivitet i både resistente cellelinjer og primære carcinomaceller [25].

TNF-R1-aktivering yderligere inducerer Bud, som aktiverer Bad og Bax , forårsager mitokondrielle membranpotentiale at falde, cytochrom c til at blive frigivet og caspase 9 skal aktiveres. Rolle Bid og Bad i transduktion apoptotiske signaler fra dødsreceptorer til den indre mitokondrier vej involverer amplifikation af apoptotiske signaler [26]. Bad og Bax hører til Bcl-2-familiemedlemmer, som regulerer celledød og overlevelse. For eksempel har opregulering af Bax blevet vist at inducere apoptose ved at reducere mitokondrisk permeabilitet at frigive cytochrom c [27]. Konsekvensen af ​​cytochrom c-frigivelse og caspase 9-aktivering er aktiveringen af ​​downstream caspaser 3 og 7, som forårsager spaltning af PARP og fører til apoptotisk død uden translokationen af ​​NFkB til kernen. Yderligere fluorescens mærkning af NFkB viste forbindelsen ikke signifikant (p 0,05) øge NFkB translokation til kernen sammenlignet med kontrol.